四川省宜賓中學(xué)高二人教版生物選修一：5.3血紅蛋白的提取和分離課件

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離 一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）蛋白質(zhì)提取和分離原理 （二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法 1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法 2）電泳法（三）緩沖液的作用二、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理和粗分離純 化純度鑒定 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)步驟 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白樣品處理和粗分離純 化純度鑒定蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異： 1.分子的形狀、大小 2.電荷性質(zhì)和多少 3.溶解度 4.吸附性質(zhì) 5.對(duì)其他分子親和力 洗脫：從色譜

2、柱上端不斷注入緩沖液， 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。混合物上 柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收 集大分子收 集小分子 2凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基團(tuán)會(huì)帶上電荷3）常用電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大

3、小。 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素決定運(yùn)動(dòng)方向電場(chǎng)作用力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）緩沖溶液洗脫劑 作用： 配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。 思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液？1.洗 滌 紅 細(xì) 胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標(biāo)志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2 min紅細(xì)胞血 漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色2.釋放血紅

4、蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂20mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)純化凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5193.樣品的加入和洗脫步驟操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75 20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？注意： 色譜柱不能內(nèi)不能有氣泡； 裝完后，立即用緩沖液洗滌，平衡凝 膠是凝膠裝填緊密3.樣品的加入和洗脫 1.調(diào)液面 2.加樣 3.再調(diào)液面 4.洗脫 5.收集緩沖液凝膠注意事項(xiàng)1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2.色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆