WesternBlot實(shí)戰(zhàn)指引：從電泳到定量

1、【轉(zhuǎn)】Western Blot實(shí)戰(zhàn)指南：從電泳到定量-1樣品制備：變性條件SDS LB直接裂解：用常溫或者高溫預(yù)熱過(guò)（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容 易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)改變）的1*SDS LB （或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞 或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積 比類推。通常條件下，SDS LB都是過(guò)量的（因此不一定要嚴(yán)格參考SDS LB稀 釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過(guò)高時(shí)，煮樣后會(huì)發(fā)現(xiàn)tip吸 不上來(lái)，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1.再 煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5mi

2、n，樣品過(guò)濃時(shí)就煮10min； 2.如果10min煮樣后， 仍然吸不起來(lái)，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮；也可以對(duì)樣品進(jìn)行超聲。煮樣時(shí) 間若過(guò)長(zhǎng)，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去繼續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn) 明顯的蛋白沉淀和水分層）此方法的缺點(diǎn)，SDS LB煮過(guò)的樣品如果用來(lái)做出，需要特殊方法，因此，這種 制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實(shí)類似） 裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl

3、2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors （20g/ml leupeptin, 10pg/mi pepstatin A and 10 pg/ml aprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復(fù)雜也很貴，其實(shí)用0.5mM PMSF替代這三種就好了；如果還要 做磷酸化蛋白，加 1mM Na3VO4 （現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GPo此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便 于隨后的IP等試驗(yàn)。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見(jiàn)，諸如0.15M （生理 鹽

4、濃度）、0.3M、0.6M （高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀 非常粘稠）及0.8-1.2M; 0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M及以上適合純化蛋白， 尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端 的高鹽裂解細(xì)胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40,用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%,但此 時(shí)染色體會(huì)析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。當(dāng)組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是.低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。.錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙）， 進(jìn)一

5、步破碎；反復(fù)多次。.用上述細(xì)胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測(cè)；如果含量過(guò)低，需要用TCA沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的影響最小，是最 佳的實(shí)驗(yàn)條件；但是這存在隱憂。因?yàn)楹宓呐囵B(yǎng)基中含有非常豐富的BSA （牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì)有非常大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46 kDa之間的時(shí)候;用“任何” 抗體去檢測(cè)這一區(qū)間的蛋白，會(huì)有一片非常強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)榇藚^(qū)間蛋白（主要是 BSA）濃度過(guò)于富集，會(huì)非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識(shí)別。同理， 采用SDS LB

6、裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng) 基中的BSA。采用無(wú)血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞上清除了改變細(xì)胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號(hào) 途徑，諸如AKT等），還會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題是：.即使采用了無(wú)血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對(duì)好很多。.選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA沉淀對(duì)半定量操作要求非常高，因?yàn)楹苋菀壮恋聿怀浞只蛘唠x心操作丟失, 尤其在離心過(guò)程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重新溶解時(shí)，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索 充分溶解的條件，相對(duì)麻煩。實(shí)際上，如果你不是非常強(qiáng)調(diào)蛋白的分泌有什么

7、生理功能，一般不建議檢測(cè)上清， 尤其半定量的WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同樣品間的差異。這里面有實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)的麻煩 經(jīng)驗(yàn)之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但 90%的數(shù)據(jù)是cell乎出；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為 進(jìn)一步分析做準(zhǔn)備。樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長(zhǎng)期；例外，IP用 樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP,避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過(guò)的 樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問(wèn)題，SDS沉淀；SDS 4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣 前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也 會(huì)出現(xiàn)類似

8、拖尾；上樣過(guò)大也會(huì)）。在樣品制備過(guò)程中，另一個(gè)需要注意的問(wèn)題是，從樣品制備的起始階段就要注意 定量問(wèn)題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可 以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長(zhǎng)有差異也不會(huì)對(duì)WB結(jié)果影響太多。組 織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ重）開(kāi)始，裂解液的體積都是精確定量的，操作 過(guò)程也盡量避免蛋白損失。有人會(huì)說(shuō)可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白 定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對(duì)定量的干擾。蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。經(jīng)驗(yàn)之談，8%膠最底邊 約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑 300KD

9、a-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問(wèn)題不大。12%， 180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問(wèn)題不大（300KDa蛋白如何，沒(méi) 有嘗試過(guò)）。電泳一般采用恒流，45mA-55mA （應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高 限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證最 快速度完成電泳（電壓會(huì)逐漸增大），省時(shí)且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過(guò)快時(shí)會(huì)發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項(xiàng)：.聚丙烯酰胺的30%母液會(huì)降解，要4度避光保存。. APS會(huì)失效，10%APS 一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右。-20度分裝

10、長(zhǎng)期保存。.注意Tris buff的PH值，以及平時(shí)所用的水的PH值。PH值改變會(huì)使帶型非 常怪異，所有蛋白和澳酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果澳酚藍(lán)前有 紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從澳酚藍(lán)一直延伸到膠底部（澳酚藍(lán)此時(shí)涌動(dòng) 極緩慢，位于膠中上部）.上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝 置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會(huì)過(guò)熱。SDS膠可能局部自溶，條帶 扭曲、變形。.配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時(shí)洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平 滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會(huì)凝結(jié)肉眼無(wú)法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩）， 其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過(guò)該

11、處或電泳散熱不好，條 帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會(huì)導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清 除；蛋白膠也會(huì)導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒(méi)洗凈的另一個(gè)壞處是，由中學(xué)物 理知識(shí)可知，玻璃表面越光滑粘附越牢,未洗凈的玻板會(huì)削弱和膠體間的粘附力， 拔梳子或邊條時(shí)會(huì)產(chǎn)生微小的錯(cuò)動(dòng)，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間， 這個(gè)關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯(cuò)動(dòng)會(huì)使上樣時(shí)，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或 者甚至膠和玻板分開(kāi)。為避免拔梳子時(shí)的錯(cuò)動(dòng)，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水 更好，有SDS潤(rùn)滑）。判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒(méi)有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。.上樣時(shí)，不要把tip深入膠孔過(guò)

12、深（或者采用細(xì)的尖端拉長(zhǎng)的專用上樣槍頭）， 可能會(huì)錯(cuò)開(kāi)膠和玻板，樣品會(huì)泄露。.未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會(huì)拉寬變形。通常 20ul 樣品（含 5ul 4*SDS LB）,可用 8-8.5ul 4*SDS LB 平衡。同理，點(diǎn) marker 的 lane也要加入同樣體積的LBOLB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會(huì)有差異， 在新舊LB靠近的地方，條帶會(huì)拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填 空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。.增加上樣量不一定會(huì)提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。增加上樣量的后果通常只能是讓你 的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因?yàn)樵黾由蠘恿孔疃嘀荒芴岣邘?/p>

13、倍， 而WB靈敏度是以10的幾次冪量級(jí)的，所有目的蛋白信號(hào)的唯一方案就是IP富 集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣 量的另一個(gè)壞處是，本來(lái)高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出 現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul （最 少80ul,這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時(shí)的損失就太大，上樣就 很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時(shí)上樣量要控制在5-6ul, 最少2.5ul,最多10ul,10ul時(shí)內(nèi)參基本已經(jīng)開(kāi)始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋； 當(dāng)然并

14、非不可以多上樣，再多對(duì)WB結(jié)果影響不大（沒(méi)有的仍然沒(méi)有），且條帶 都很丑。.不同樣品上樣時(shí)，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一 組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul,剛好+5川4*SDS LB達(dá)到常規(guī)20ul上樣體積;后者第8點(diǎn)提到只上5ul,同樣+5ul SDS LB （比重同，不會(huì)互相擠壓）, 最好補(bǔ)加10ul DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用 “空白”泳道隔開(kāi)（空白僅指無(wú)蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul 4*SDS LB），這樣才能 確保每條帶都很美觀。. SDS PAGE膠配好暫時(shí)不用時(shí)，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊 邊條后的間

15、隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長(zhǎng)期4度保存。個(gè) 人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。 兩種方案都可以。所以如果預(yù)計(jì)次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。 樣品是否一定需要定量再上樣？ 不是的，這是浪費(fèi)時(shí)間的一個(gè)操作。我們首先來(lái)討論一下蛋白定量的科學(xué)性。蛋白定量首先需要一個(gè)參照系（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），參照蛋白通常選擇8$人，也就是說(shuō) 你所謂的定量是對(duì)應(yīng)于BSA的濃度的一個(gè)參照值。這里面存在一個(gè)問(wèn)題，即忽 略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對(duì)光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構(gòu)象還會(huì)影 響顏料分子的嵌入。因此你其實(shí)默認(rèn)將所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊

16、狀態(tài)、光吸收情況下,然后做出的一個(gè)相對(duì)判斷，這就存在一個(gè)“系統(tǒng)誤差” 還不算上測(cè)量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。其次，裂解組織或細(xì)胞的時(shí)候,那些裂解液中，某些溶劑本身會(huì)使Coomassie G250 或者Bradford法（實(shí)際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如 NP40，就會(huì)使Coomassie顯藍(lán)色，可以完全覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的 藍(lán)色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂的蛋白定量實(shí)際是NP40 顏色和蛋白染色的疊加，根本不會(huì)符合標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準(zhǔn)?！拘枰f(shuō)明：我目前只知道NP40會(huì)這樣，因?yàn)槲覀儚膩?lái)不去定量，沒(méi)有做過(guò)更深入的研

17、究?！?實(shí)際上保證你的內(nèi)參一致，是從樣品制備開(kāi)始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如 果你從制備樣品時(shí)就注意過(guò)定量問(wèn)題，實(shí)際上通常內(nèi)參差別不會(huì)太大。如果真的 有差別，通常我們會(huì)先跑少量的樣品，目的是讓Actin或tubulin更清晰、不會(huì)粘 連、不會(huì)過(guò)曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，根據(jù)第一輪的內(nèi)參的熒光信號(hào)做 微調(diào)，大致能做到相當(dāng)；最多可能需要第三輪。以上的試驗(yàn)可以精確到0.1ul差 異（我很多體外生化試驗(yàn)之前的調(diào)整酶量就是這樣進(jìn)行，此時(shí)根本不可能有足夠 的蛋白讓你去定量）。當(dāng)然憑曝光強(qiáng)弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn) 定，很可靠，這是需要相當(dāng)多的經(jīng)驗(yàn)積累，如果你一時(shí)掌握不了，可以讓經(jīng)驗(yàn)更

18、豐富的師兄師姐或者導(dǎo)師幫忙。順便提到，有人問(wèn)過(guò)用Quantity One等定量軟件對(duì)光密度定量后計(jì)算差別從而調(diào) 整上樣體積是否可以？ 不可以。因?yàn)閃B結(jié)果經(jīng)過(guò)多重放大，精確計(jì)量只 代表相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)比值，與實(shí)際比值還是有誤差，所以按計(jì)算值更改上樣 量仍會(huì)出現(xiàn)偏差。如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中 嘗試一下，避免那些本身會(huì)顯色的物質(zhì)出現(xiàn)在你的裂解液中；當(dāng)然，某些物質(zhì)的 去除可能影響對(duì)組織蛋白的提取。所以這是一個(gè)兩難的問(wèn)題。轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果的影響并不如書本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚(yáng)的那么大！ 首先必須澄清的是，很多時(shí)候新手會(huì)把WB結(jié)果無(wú)信號(hào)歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實(shí)

19、際上轉(zhuǎn)膜效率對(duì)最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識(shí) 別能力的強(qiáng)弱，以及如何正確使用抗體，這個(gè)問(wèn)題下節(jié)討論。有一個(gè)簡(jiǎn)單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時(shí)，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對(duì)多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測(cè)沒(méi)有任何影 響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒(méi)有 很好的策略可以解決這個(gè)新濾紙的問(wèn)題；嘗試過(guò)浸泡（會(huì)泡爛的）、預(yù)電泳（會(huì) 稍微好點(diǎn)）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。 每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流;水流太大，紙張會(huì)爛掉的）， 晾干再用；只要沒(méi)沖爛可以一直

20、反復(fù)使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對(duì)較長(zhǎng)，所以每個(gè)步 驟的疊加作用會(huì)被級(jí)數(shù)放大，因此在試驗(yàn)的每個(gè)步驟我們?nèi)詴?huì)力求更好，因此以 下仍會(huì)深入探討如何提高轉(zhuǎn)膜效率。針對(duì)提高轉(zhuǎn)膜的效率，個(gè)人認(rèn)為最先應(yīng)該考慮到的是儀器的選用。這里不是歧視“made in China”，國(guó)內(nèi)的廠家很少注重不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì), 走低端策略，對(duì)于電泳儀這種技術(shù)含量不高的儀器倒可以湊合；但說(shuō)到轉(zhuǎn)膜儀， 能把一個(gè)簡(jiǎn)單的勻場(chǎng)電極做好的還真不多（就我道聽(tīng)途說(shuō)的，國(guó)外廠家為了使電 極之間場(chǎng)強(qiáng)更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過(guò)極薄的白金層）；因此轉(zhuǎn)膜效 率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個(gè)人使用過(guò)的國(guó)產(chǎn)

21、電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯 Tanon仿Biorad的還可以（算替它們免費(fèi)打個(gè)廣告吧，Tanon仿biorad mini3型 電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認(rèn)為“中國(guó) 制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進(jìn)口，用過(guò)Biorad、amersham 和英國(guó)公司的scieplasoPS:批評(píng)一下Biorado Biorad的半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會(huì)莫名其妙的碎裂（絕 非摔裂、磕碰，因?yàn)榈酌嬉话惴旁谧郎虾蟪ㄆ谛枰逑慈コ龤埩酐}漬，基本不 會(huì)移動(dòng)；即便如此它自然就會(huì)碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報(bào)廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則

22、無(wú)法接通，導(dǎo) 致儀器報(bào)廢我們先后買過(guò)3臺(tái)都是這樣的毛病，其間間隔了 3年，不能肯定 近來(lái)Biorad有沒(méi)有改進(jìn)這個(gè)問(wèn)題；如果沒(méi)有，我想市場(chǎng)遲早會(huì)被其他公司所取 代）對(duì)這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，容易過(guò)早報(bào)廢；amersham 獨(dú)特的蜂窩式設(shè)計(jì)確實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸 面減少，電轉(zhuǎn)時(shí)散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確 實(shí)不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時(shí)仍可采用）長(zhǎng)時(shí)程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在 4度冰柜或cold room進(jìn)行；英國(guó)的產(chǎn)品，價(jià)格較高，公司不太出名國(guó)內(nèi)不一定 有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)。

23、這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn) 膜效率最佳，但靡費(fèi)試劑、溶液，對(duì)普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時(shí)間長(zhǎng)于半 干轉(zhuǎn)（下文會(huì)具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時(shí)、省試劑。 蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋 白，當(dāng)然這只是一個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對(duì)大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會(huì)選擇長(zhǎng)時(shí)程 的濕轉(zhuǎn)，那么剛才提到的amersham半干轉(zhuǎn)儀的缺陷實(shí)際上沒(méi)太多實(shí)質(zhì)意義，何 況還可以外加條件彌補(bǔ)；而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來(lái)就是高手在懸崖上跳舞， 此時(shí)轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒(méi)有任何意義我說(shuō)過(guò)轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果不起 決定因素。濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請(qǐng)參考分子

24、克隆，有必要指出的是，實(shí)際上用半干轉(zhuǎn)緩 沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（=5次常規(guī) 1hr電轉(zhuǎn)，如有3hrs長(zhǎng)時(shí)程轉(zhuǎn)染，緩沖液使用次數(shù)會(huì)減少），不過(guò)要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質(zhì)剩余不多，為確保轉(zhuǎn)膜溫度, 可開(kāi)始或中途更換新鮮轉(zhuǎn)膜液）。電轉(zhuǎn)液中SDS增加蛋白的水溶性，促進(jìn)蛋白 在電轉(zhuǎn)液中泳動(dòng)。若不加5口5，蛋白會(huì)沉淀在膠上，但SDS過(guò)多會(huì)影響蛋白與 膜的吸附。甲醇能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但 高濃度的甲醇對(duì)蛋白會(huì)有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來(lái)。一般來(lái)說(shuō)甲醇的 濃度為20%，但PVDF膜截留marker上交

25、聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮 提升甲醇的濃度至25%（它對(duì)普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋 白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外SDS必須添加。甲醇的另一個(gè)作用是降溫， 舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時(shí)電流或電壓變化更快、溫度 升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點(diǎn)對(duì)半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因 為半干轉(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置的時(shí)間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時(shí) 少量補(bǔ)加。濕轉(zhuǎn)一般采用穩(wěn)壓，電壓控制在120-140V，時(shí)長(zhǎng)1-3hrs（小蛋白控制在1hr，大 蛋白3hrs），有人會(huì)選擇60V過(guò)夜，從實(shí)驗(yàn)的效率來(lái)講太浪費(fèi)時(shí)間，對(duì)轉(zhuǎn)膜到底 有多大程度的增益難說(shuō)，不太推

26、薦；半干轉(zhuǎn)一般穩(wěn)流，依m(xù)illipore PVDF膜附帶 說(shuō)明書，當(dāng)2.5-3mA/cm2,電壓25V（biorad半干儀額定值不能超過(guò)25V； amersham 半干轉(zhuǎn)儀，限壓30V。通常跑不到這么大的電壓，除非是新的濾紙或很久的轉(zhuǎn)膜 液，或常溫放置的轉(zhuǎn)膜液，或超大的膠），時(shí)間一般15-45min （常規(guī)用0.5hr）； 如果是3mA/cm2,時(shí)間不要超過(guò)0.5hr。這兩款儀器的限壓要求，可能出于保護(hù) 儀器的目的；amersham為防止過(guò)載，當(dāng)電壓30V,35V附近的時(shí)候，保險(xiǎn)會(huì) 自動(dòng)跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V （因此足見(jiàn)其散熱性能

27、的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時(shí)間的 要求是針對(duì)PVDF膜的，這里面有一個(gè)很有趣的問(wèn)題。盡管廠家一再表明PVDF 膜比NC膜對(duì)蛋白的截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高， 所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對(duì)小分 子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很容易穿過(guò) PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮 增加marker的上樣量）；NC膜沒(méi)有這種問(wèn)題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時(shí)間也是小蛋 白1hr、大蛋白3hrs，電流控制在200-300mA（16cm*9cm大膠300皿，如果膠面 積小很多可以

28、考慮降低，實(shí)際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）ONC膜唯一不如PVDF 膜的地方，在我看來(lái)是它的強(qiáng)度：干燥的膜易碎。當(dāng)然目前某些廠家為解決這個(gè) 問(wèn)題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強(qiáng)度和PVDF膜類似， 但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時(shí)候要 特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也 不是一定必須。對(duì)于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本建議采用低濃度膠，如6% SDS。但實(shí)際操作 發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在 45KDa附近，而6%膠底邊澳酚藍(lán)指示60KDa左右，除

29、非采用壇子上有人提過(guò)的 灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時(shí)跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個(gè)人 經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36e3）都可以勝任,可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8% 膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會(huì)局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒(méi) 有具體要求，但用預(yù)冷過(guò)的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條 件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前 -20度預(yù)冷，時(shí)間不能長(zhǎng)于2比$，否則電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽的，冰槽 置-80度預(yù)冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治的過(guò)程中，書中強(qiáng)調(diào)過(guò)濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒(méi)有 膠、膜隔開(kāi)

30、部分的濾紙會(huì)因?yàn)橹苯咏佑|而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓） 流，造成升溫過(guò)快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新 濾紙，消耗過(guò)快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實(shí)際 上濾紙大一些也不太要緊，但是我會(huì)選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙； 通常膜的大小會(huì)嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點(diǎn)點(diǎn)。操作時(shí)在保證每一層均 無(wú)氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個(gè)來(lái)回，力道要均勻、恰好；力量過(guò)大，膠會(huì) 被拉伸，條帶會(huì)扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加 的時(shí)候每一層都無(wú)任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時(shí)可以一張張的疊加），更重 要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢?/p>

31、理解的是，對(duì)于蛋白分子的大小而言，膠 和膜之間的間距是數(shù)十萬(wàn)倍計(jì)的，因此更緊密的接觸無(wú)疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少公司實(shí)驗(yàn)講座時(shí)提出泡膠、泡膜，實(shí)際操作中沒(méi)有發(fā) 現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實(shí)際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可 以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾 些緩沖液會(huì)有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤(rùn)再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來(lái)發(fā)現(xiàn)此操作不 僅增加額外的操作時(shí)間，而且不能說(shuō)明任何問(wèn)題，于是拋棄之。首先，立春紅（也 包括考染膠）的靈敏度和HR

32、P-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無(wú) 顏色，也無(wú)法提示W(wǎng)B結(jié)果會(huì)不會(huì)失?。既灸z無(wú)顏色也不能說(shuō)明轉(zhuǎn)膜充分了， 除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反耙蛋白區(qū)域有顏色，亦無(wú)法提示 靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個(gè)分子量大小相近的蛋白。因此，無(wú)論立 春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的 操作時(shí)間，而且增加一輪漂洗的操作，對(duì)膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不 采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交 聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會(huì)增 加任何額外的操作（固定marker的上樣量

33、非常必要）。當(dāng)然上面提到針對(duì)PVDF 膜，由于對(duì)小分子截留的局限，顏料分子會(huì)在高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)印過(guò)程中從交聯(lián)的蛋白 上脫落并穿過(guò)膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過(guò)深會(huì)使整個(gè)lane糊掉；太緊（多）可改變 蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)， 這意味著在某些條件下，顏料會(huì)從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因?yàn)槟し肿涌讖揭约澳?對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會(huì)輕易穿過(guò)膜到濾紙背面，而蛋白則被 牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象?，F(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換 NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細(xì)節(jié)，就可從根 本上忽略掉其對(duì)轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅

34、僅作為一個(gè)分子量大小的指針，當(dāng)然同時(shí)可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無(wú)誤（沒(méi)有插反電極，放反膜），也可 為后續(xù)抗體孵育操作時(shí)膜的正反面做必要的提示。不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù) 染 marker 要上 8-10ul, MBI 的只要 5ul （膠大小 20X30cm）, Bioradmini3 型（8.2X7.4cm）MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰?？贵w孵育一WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個(gè)脾氣。對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。無(wú)論 你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異

35、，而抗體的效 價(jià)可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價(jià)不被過(guò)分的拮抗, 謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。封閉最短可以縮減到5min:很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實(shí)這也是沒(méi)有吃透WB （說(shuō)實(shí) 話，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無(wú)語(yǔ)）；實(shí)際上封閉（極端點(diǎn)） 也是個(gè)可有可無(wú)的步驟，真正對(duì)降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。 當(dāng)你的抗體使用次數(shù)較多時(shí)，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新, 其實(shí)封閉最短可以縮減到5min （沒(méi)試過(guò)更短的，不一定不可以）。那什么導(dǎo)致 高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問(wèn)題 （

36、增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可 以不同；通常封閉液是最簡(jiǎn)單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。 封閉很少出狀況。不過(guò)在milk做封閉劑的封閉液中，milk顆粒未完全溶解時(shí)，微小的顆粒會(huì)粘附在膜上增加星點(diǎn)狀背景。緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗。抗體孵育成敗的關(guān)鍵首要 在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價(jià)和背景的強(qiáng)弱，然而歷來(lái)商品化的抗體質(zhì)量 參差不齊。各家生產(chǎn)的抗體中質(zhì)量問(wèn)題最嚴(yán)重的是scbt的抗體，但它們的價(jià)格 卻是最便宜的。其實(shí)，scbt在美國(guó)的售后服務(wù)還是相當(dāng)不錯(cuò)的，只要按他們的要 求操作仍然能舉證抗體的質(zhì)量問(wèn)題，可以更換、交換（你指定的他們銷售的另外 一種抗體），有時(shí)候還會(huì)附送一些ProA beads之類的，所以不奇怪它的普及率； 也正因?yàn)榇耍绻銋⒖嘉墨I(xiàn)的話很容易找到這家公司的。可惜，在國(guó)內(nèi)