單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)備室建立技術(shù)

1、單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)備室建立技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)室的建立一、建細(xì)胞間的一些細(xì)節(jié)問題：1、甲醛薰蒸：資料（internet）：40甲醛溶液(藥用規(guī)格、福建三明化工總廠出品)，用量30 mlm3，室內(nèi)溫度2124，相對濕度7585，加熱薰蒸使蒸汽彌漫全室，關(guān)閉門窗1 h。甲醛水溶液為無色，具有強(qiáng)烈刺激性氣味的液體，可殺滅多數(shù)微生物，價(jià)廉，熏蒸消毒時(shí)不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含3740%的甲醛。其主要用法為：1熏蒸消毒:對室內(nèi)消毒其用量為2025%毫升/米，在加熱該溶液時(shí)最好同時(shí)煮沸一壺水，使室內(nèi)相對溫度保持在70-90%左右，室內(nèi)溫度最好在20攝氏度以上，作用時(shí)間12-24小

2、時(shí)。如消毒皮毛服裝，甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,掛衣密度為每平方米3套為宜。熏蒸消毒時(shí)應(yīng)密閉門窗。消毒后一般多用自然通風(fēng)驅(qū)散甲醛氣體，其需時(shí)較長，急于排出氣體，可將25%氨水加熱蒸發(fā)中和。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半，中和時(shí)間為30分鐘。2自然揮發(fā): 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器中，室內(nèi)溫度保持在18攝氏度以上，同時(shí)室內(nèi)噴水以保持相對濕度在70%以上，經(jīng)16小時(shí)可達(dá)到室內(nèi)消毒的目的。關(guān)于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比較：甲酸的毒性比甲醇大6倍，甲醛的毒性比甲醇大30倍。所以吃進(jìn)410克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表現(xiàn)在損傷視力，使視力減退（不能矯正），視野縮小，以致

3、雙目失明，直到死亡。實(shí)際操作：我的每個(gè)房間是7個(gè)平方，約20個(gè)立方。按書上的算要福爾馬林300ml，高錳酸鉀100g。高錳酸鉀放入甲醛液體中后，在開始的3秒鐘內(nèi)沒有反映，3秒鐘以后，會產(chǎn)生大量煙氣。所以一旦在甲醛中加了高錳酸鉀請馬上離開滅菌室，并關(guān)上門。高錳酸鉀放入甲醛液體中會使液體沸騰，所以反應(yīng)要在比較大的大口徑容器進(jìn)行，本人用的是臉盆。甲醛氣體毒性非常強(qiáng)，所以操作時(shí)一定要帶上防毒面具。2、關(guān)于紫外線：資料：紫外線的穿透能力非常弱的，主要靠電離產(chǎn)生氧自由基來消毒。細(xì)胞培養(yǎng)室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料蓋住。如：玻璃和有機(jī)玻璃都可以的。紫外有些人認(rèn)為大型精密的顯微鏡是不可以照紫外

4、的，因?yàn)樗鼈兊溺R頭上涂的膜會被分解掉，但我特意問了我校光學(xué)系的老師，他們認(rèn)為是沒有關(guān)系的。紫外線在許多實(shí)驗(yàn)室被認(rèn)為是起心理安慰作用的。我參觀過的一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)間他們的房間大約6平方米，但是只裝了30W的紫外燈，但前提是他們有一個(gè)層流系統(tǒng)。個(gè)人認(rèn)為，如果細(xì)胞培養(yǎng)間有層流系統(tǒng)，那紫外的作用是可以被忽略的，但如果沒有層流系統(tǒng)，那么紫外的作用還是相當(dāng)重要。此外，不要擔(dān)心紫外不能照射到的角落，因?yàn)樽贤鈿⒕δ艹俗贤獗旧硪酝?，還可以由產(chǎn)生的臭氧來完成。臭氧過量吸入的作用應(yīng)該和雙氧水的作用是一樣的，個(gè)人認(rèn)為也許有一定的致癌性。所以紫外滅菌以后，最好過一個(gè)小時(shí)再進(jìn)去。3、關(guān)于新潔爾滅：資料：【藥品名稱】苯扎溴

5、銨溶液 (新潔而滅溶液) (乙類非處方藥【別 名】BenzalkoniumBromideSolution【標(biāo)準(zhǔn)來源】中華人民共和國藥典2000年版?！拘?狀】 無色或淡黃色的澄明液體;芳香;味極苦;強(qiáng)力振搖能發(fā)生多量泡沫，遇低溫可能發(fā)生渾濁或沉淀?！舅幬锝M成】每毫升含苯扎溴銨0.05克 (5%)?！咀饔妙悇e】皮膚科用藥品?！舅幚碜饔谩勘皆邃@為陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑?！九R床應(yīng)用】用于皮膚黏膜和傷口的消毒。【用法用量】 外用，使用前應(yīng)稀釋即配即用。皮膚消毒使用0.1%溶液；創(chuàng)面黏膜消毒用0.01%溶液； 稀釋方法：0.1%溶液：取本品一份，加純化水或清水50份；0.01%溶液：取本品1份，

6、加純化水或清水500份?！咀⒁馐马?xiàng)】 l. 本品為外用消毒防腐藥，不可內(nèi)服。2. 不得用塑料或鋁制容器貯存。3. 涂布部位如有灼燒感、瘙癢、紅腫等，應(yīng)停止用藥，洗凈。必要時(shí)向醫(yī)師咨詢。4. 低溫時(shí)，可能出現(xiàn)混濁或沉淀，可置于溫水中加溫，振搖使溶解后使用。5. 兒童必須在成人監(jiān)護(hù)下使用。【不良反應(yīng)】偶見過敏反應(yīng)。 【藥物相互作用】 l. 不得與肥皂或其他合成洗滌劑并用。2. 局部消毒時(shí)勿與碘酊、高錳酸鉀、雙氧水、磺胺粉等并用。 3. 如正在使用其他藥品，使用本品前請咨詢醫(yī)師或藥師?！疽?guī) 格】500毫升25克；100毫升5克(5%)?！举A 藏】避光，密封保存。評論：在甲醛滅菌前，先用新潔爾來擦洗整

7、個(gè)墻面，此外，平時(shí)地板滅菌也可以用它。新潔爾滅和酒精相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是便宜，因?yàn)樾聺崰枩?00ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價(jià)格可能是新潔爾滅的幾十倍。二、培養(yǎng)準(zhǔn)備時(shí)的一些問題：1、多聚賴氨酸：資料：多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細(xì)胞涂片

8、，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實(shí)驗(yàn)操作過程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。使用說明免疫學(xué)操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。2 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-263 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時(shí)間不會提高包被效果。4在60烘箱1小時(shí)干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。注意1 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。2 用之前的玻片必須保持清潔。必要時(shí)用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。3 不要在用過的稀釋液中加新的溶液。

9、4 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。5 用過的稀釋液要過濾，若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。2、洗液的一些問題：資料：重鉻酸鉀硫酸洗液 通常稱為洗潔液或洗液，其成分主要為重鉻酸鉀與硫酸,是強(qiáng)氧化劑。 K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4 Cr2(SO4)3 3O 因其有很強(qiáng)的氧化力，一般有機(jī)物如血、尿、油脂等類污遺跡可被氧化而除凈。事先將溶液稍微加熱，則效力更強(qiáng)。新鮮鉻酸洗液為棕紅色，若使用的次數(shù)過多，重鉻酸鉀就被還原為綠色的鉻酸鹽，效力減小，此時(shí)可加熱濃縮或補(bǔ)加重鉻酸鉀，仍可繼續(xù)使用。 配方：稀洗液 重鉻酸鉀 10g 粗濃硫酸 200ml 水 100ml 濃洗液 重鉻酸

10、鉀 20g 粗濃硫酸 350ml 水 40ml 配法：先取粗制重鉻酸鉀20g，放于大燒杯內(nèi)，加普通水100ml使重鉻酸鉀溶解（必要時(shí)可加熱溶解）。再將粗制濃硫酸（200ml）緩緩沿邊緣加入上述重鉻酸鉀溶液中即成。加濃硫酸時(shí)須用玻璃棒不斷攪拌，并注意防止液體外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶內(nèi)面必須沒有掉瓷，以免強(qiáng)酸燒壞瓷桶。配時(shí)切記，不能把水加于硫酸內(nèi)（將因硫酸遇水瞬間產(chǎn)生大量的熱量使水沸騰，體積膨脹而發(fā)生爆濺）。 使用時(shí)先將玻皿用肥皂水洗刷12次,再用清水沖凈倒干,然后放入洗液中浸泡約2小時(shí),有時(shí)還需加熱,提高清潔效率。經(jīng)洗液浸泡的玻皿，可先用自來水沖洗多次，然后再用蒸餾水沖洗12次即可。 附

11、有蛋白質(zhì)類或血液較多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可對有如酒精、乙醚的容器用洗液洗滌。 洗液對皮膚、衣物等均有腐蝕作用，故應(yīng)妥善保存。使用時(shí)帶保護(hù)手套。為防止吸收空氣中的水分而變質(zhì)，洗液貯存時(shí)應(yīng)加蓋。注意：洗液具有強(qiáng)烈的腐蝕性，接觸皮膚后會，皮膚會變黃，2天后會脫一層皮。1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù),要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響.細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響,要求工作環(huán)境清潔,空氣清新,干燥和無煙塵.細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè),常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室,而洗刷消毒在另一室. 2 常用設(shè)

12、施及設(shè)備 (1)超凈工作臺:也稱凈化工作臺,分為側(cè)流式,直流式和外流式三大類. (2)無菌操作間:一般由更衣間,緩沖間和操作間三部分組成.操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱,離心機(jī),倒置顯微鏡等.緩沖間可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無菌物品等. (3)操作間:普通培養(yǎng)箱,離心機(jī),水浴鍋,定時(shí)鐘,普通天平及日常分析處理物(4)洗刷消毒間:烤箱,消毒鍋,蒸餾水處理器及酸缸等. (5)分析間:顯微鏡,計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等. 3 培養(yǎng)器皿 常用細(xì)胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)板,培養(yǎng)皿等.常準(zhǔn)備量是使用量的三倍.器皿應(yīng)選擇透明度好,無毒,利于細(xì)胞粘附和生長的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.

13、常用的器皿有下面幾種. (1)液體儲存瓶:用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液,血清等液體,常用規(guī)格有500ml,250ml, 100ml等幾種. (2)培養(yǎng)瓶:根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異,用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻,便于細(xì)胞貼壁生長和觀察,瓶口要大小一致,口徑一般不小于1cm,允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位,規(guī)格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等幾種. (3)培養(yǎng)皿:用于開放式培養(yǎng)及其它用途.分直徑30mm,60mm,120mm等幾種. (4)吸管:常用的有長吸管和短吸管兩類,長吸管也稱刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管,刻度吸管用于移動液體.常用1

14、ml和10ml兩種.短吸管也叫滴管,分彎頭和直頭兩種. (5)離心管:離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿,根據(jù)用途不同形態(tài)各樣,常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類.前者分別為50ml,30ml,15ml;后者則多為10ml和5ml. (6)其它:如三角燒瓶,燒杯,量筒,漏斗,注射器等.4 細(xì)胞培養(yǎng)溫度 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長,必須有恒定而適宜的溫度.不同種類的細(xì)胞對培養(yǎng)溫度要求也不同.人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.50.5,偏離這一溫度范圍,細(xì)胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡.培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng),溫度上升不超過39時(shí),細(xì)胞代謝與溫度成正比;人體細(xì)胞在39-

15、401小時(shí),即能受到一定損傷,但仍有可能恢復(fù);在40-411小時(shí),細(xì)胞會普遍受到損傷,僅小半數(shù)有可能恢復(fù);41-421小時(shí),細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷,大部分細(xì)胞死亡,個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能;當(dāng)溫度在43以上1小時(shí),細(xì)胞全部死亡.相反,溫度不低于0時(shí),對細(xì)胞代謝雖有影響,但并無傷害作用;把細(xì)胞放入25-35時(shí),細(xì)胞仍能生存和生長,但速度減慢;放在4數(shù)小時(shí)后,再回到37培養(yǎng),細(xì)胞仍能繼續(xù)生長.細(xì)胞代謝隨溫度降低而減慢.當(dāng)溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí),細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡.但是,如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護(hù)劑(二甲亞砜或甘油),可在深低溫下如-80或-196(液氮)長期保存. 5 合適的氣體環(huán)境 氣體是哺乳

16、動物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分.開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中.二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物,也是細(xì)胞生長繁殖所需成分,它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值.大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2-7.4,偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響.但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長.但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長,如成纖維細(xì)胞最適合pH是7.4-7.6.每種細(xì)胞都有其最適pH值. 單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放

17、置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟

18、無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。 2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。 3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人