免疫學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用PartIII課件

1、Part III 免疫細胞的檢測Part III 免疫細胞的檢測免疫細胞的檢測免疫細胞的分離密度梯度分離法磁珠分離法fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS免疫細胞功能的測定T細胞B細胞巨噬細胞NK細胞免疫細胞的檢測免疫細胞的分離一、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴細胞和單核細胞，是免疫學(xué)實驗中最常用的細胞群，也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。一、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞(peripherPBMC的密度與血液中的其他成分不同:血小板的密度

2、為1.0301.035，粒細胞為1.092，紅細胞為1.093，淋巴細胞和單核細胞的密度為1.0751.090。利用一種密度介于1.0751.092之間、近于等滲的溶液(分層液)進行密度梯度離心，可使不同類別的血細胞按其相應(yīng)密度分布，從而被分離。常用的分層液有聚蔗糖-泛影葡胺Ficoll-Hypaque分層液法和Percoll分層液法兩種。PBMC的密度與血液中的其他成分不同:(一)聚蔗糖-泛影葡胺分層液法聚蔗糖-泛影葡胺分層液法是分離PBMC一種單次密度梯度離心分離法 (一)聚蔗糖-泛影葡胺分層液法聚蔗糖-泛影葡胺分層液法是分離特異性分離所需淋巴細胞的方法。將特異性抗體(如抗CD3、抗CD4

3、、抗CD8等)吸附在鐵顆粒(磁珠)上，加至細胞懸液中，具有相應(yīng)抗原的細胞與磁珠上的特異性抗體結(jié)合。反應(yīng)管置于磁場中，鐵顆粒受磁場的吸引，攜帶有相應(yīng)細胞的磁球吸附于靠近磁鐵的管壁上。棄細胞懸液，重新解離細胞與磁珠。(二)磁珠分離法特異性分離所需淋巴細胞的方法。(二)磁珠分離法免疫學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用PartIII課件autoMACS?Pro SeparatorWalk-away cell sorting of multiple samplesCliniMACS Plus InstrumentThe CliniMACS?Systema closed and sterilesystem for se

4、paration of large cell samplesautoMACS?Pro SeparatorCliniMACT細胞鑒定及功能測定使用酶、免疫熒光標記單抗進行鑒定 Th1 (IFN-r、T-bet） Th2 （IL-4、IL-5、IL-13、GATA-3） CD4+ T cell Th17 （IL-17A、IL-17F、IL-22、ROR t ） Treg （CD4+、CD25+、CD127low、Foxp3） Tfh （CXCR5、ICOS、BcL6） CD8+ T cell: CTLT細胞增殖功能測定混合淋巴細胞培養(yǎng)CTL介導(dǎo)的細胞毒試驗T細胞鑒定及功能測定使用酶、免疫熒光標記單

5、抗進行鑒定T細胞增殖功能測定 用于評估T細胞對各種刺激的增殖能力。T細胞增殖能力是反映T細胞功能的一個重要指標。刺激T細胞增殖的因素及意義 1. 特異性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 可用于判斷抗原免疫的效果（疫苗接種）和回憶反應(yīng) 能力，也能反映T細胞總體的功能。 2. 絲裂原：多克隆。 3. 刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子：（Anti-CD3、Anti-CD28 mAb） 多克隆。T細胞增殖功能測定 用于評估T細胞對各種刺激的T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法（一）體外增殖檢測 1. 3H胸腺嘧啶（TdR）摻入法：T細胞增殖時，伴隨細胞內(nèi)DNA合成，在細胞增殖的高峰期時可通過加入（3HTdR）到培養(yǎng)體系中

6、，處于增殖的T細胞可攝取3HTdR用于合成DNA ，細胞增殖程度與細胞內(nèi)摻入的3HTdR的量成正比。通過用液閃儀定量測定培養(yǎng)細胞中的放射性強度，就可以確定T細胞增殖的能力與強度。 2. 流式細胞儀計數(shù)法：T細胞增殖最直接的結(jié)果就是細胞數(shù)量的明顯增加，因此可以采用T細胞表面標志（如：CD4 或 CD8）的熒光抗體聯(lián)合排除死細胞的試劑 PI 或 7-AAD 標記出存活的特定的 T 細胞群體，然后在流式細胞儀上對標記出的T細胞群體進行準確的計數(shù)。T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法（一）體外增殖檢測 3. CFSE 分裂法：羧基熒光素二醋酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）

7、可通透細胞膜進入細胞，原先為無色且不發(fā)生熒光，在進入細胞后可被細胞內(nèi)酯酶催化分解成高熒光強度的物質(zhì)并與細胞內(nèi)胺穩(wěn)定結(jié)合從而使細胞標記上高熒光強度的CFSE。細胞分裂時 , CFSE能夠均等地在兩個子代細胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出8-10代的子細胞。 CFSE已被廣泛應(yīng)用于T細胞增殖的體內(nèi)和體外檢測,并可用于追蹤T淋巴細胞的體內(nèi)遷移與組織定位.T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法Tracing Dye (CFSE)Tracing Dye (CFSE)T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法（一）體外增殖檢測 4. MTT 法： MTT四唑藍是一種能接受氫原子的染料，可直接加入到細胞培養(yǎng)基中，被活細胞

8、的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的深紫色結(jié)晶狀產(chǎn)物 formazan，但死細胞不能進行此還原反應(yīng)。用特定溶劑可溶解MTT所產(chǎn)生的水不溶性紫色結(jié)晶，然后用酶標儀在570 nm波長附近(500600 nm)處測定光吸收值，可反映活細胞的數(shù)量和代謝活力，并由此反映細胞的存活、增殖、生長、和毒性。T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法（二）體內(nèi)增殖檢測BrdU 摻入法： Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一個胸腺核苷的類似物 能夠在細胞增殖和細胞周期狀態(tài)分析中起作用BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細胞相結(jié)合使用熒光標記的BrdU抗體能夠檢測到BrdU,

9、 反映體內(nèi)某些特定細胞的增殖狀態(tài)T細胞增殖功能測定T細胞增殖測定方法抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)原 理 測定T細胞在體外對某一特定抗原的特異性免疫應(yīng)答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原，也可以是曾經(jīng)免疫過的抗原。常用的測定回憶反應(yīng)的抗原有純化蛋白衍生物（PPD）和破傷風類毒素（TT）。這2種抗原都被常規(guī)列入計劃免疫接種范疇，成人應(yīng)該對它們有回憶反應(yīng)。在某些免疫缺陷病中，對它們的特異性回憶反應(yīng)可減弱或消失?？乖T導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)原 理抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)方法（以T細胞對破傷風類毒素刺激的增殖反應(yīng)為例）1. 分離PBMC和APC，APC用絲裂霉素或放射性核素處理2. 96孔板中每孔加入1x105

10、 PBMC和1x104 APC3. 每孔中加入系列稀釋的破傷風類毒素溶液，不同孔中抗原終濃度分別為0、1、5、10和20g/ml。每一種濃度設(shè)3復(fù)孔4. 37C，5CO2，6天5. 加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，計數(shù)?？乖T導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)方法（以T細胞對破傷風類毒素刺激的增抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)結(jié)果解釋：1. 對于接種過破傷風疫苗者來說，本試驗結(jié)果呈低反應(yīng)反映患者對破傷風類毒素特異性應(yīng)答能力低下或全身免疫缺陷。2. HIV感染者反應(yīng)低下反映CD4+T細胞減少導(dǎo)致的免疫缺陷?？乖T導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)結(jié)果解釋：抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)注意事項:1. 培養(yǎng)液中最好用人AB血清。2. 此T細胞

11、增殖反應(yīng)需要APC。如使用純化T細胞，需加510自身APC。抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)注意事項:抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)應(yīng)用實踐 用于估計機體對特異性抗原的應(yīng)答能力和機體總體免疫應(yīng)答能力?？乖T導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)應(yīng)用實踐絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)誘導(dǎo)T細胞增殖反應(yīng)的絲裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陸）絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)誘導(dǎo)T細胞增殖反應(yīng)的絲裂原絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)方法：1. 用RPMI10將PBMC配成1x106/ml的懸液。2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀釋液。3. 96孔板中選擇一行（共12孔），每孔加入1

12、00l細胞。 指定每相鄰3孔為一組。前3組分別加入一種稀釋度的 PHA溶液，最后一組加培養(yǎng)液（對照組）。4. 37C ，5CO2，54h。5. 配制濃度為100ci/ml的3HTdR。絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)方法：絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)6. 每孔加入1ci 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。7. 用多孔自動收集儀分別收集每孔細胞于一小管中。溶 解細胞，將DNA過濾到濾紙上，洗去未摻入的3HTdR ，最后用100的甲醇洗滌，以利濾紙干燥。8. 將濾紙放入液閃管內(nèi)，自動計數(shù)，打印結(jié)果。9. 扣除本底，計算每一組3個復(fù)本的平均數(shù)。絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)6. 每孔加入1ci 3HTdR，繼續(xù)絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)影響

13、因素1. 細胞活力：冷凍技術(shù)影響細胞活力，復(fù)蘇后應(yīng)檢查細胞活力。2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制細胞增殖。如欲測定人體細胞增殖能力，可采用滅活的AB血清。3. 細胞培養(yǎng)板類型：根據(jù)細胞數(shù)量采用不同形狀底部的培養(yǎng)板。4. 微生物污染：可降低細胞增殖能力。絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)影響因素應(yīng)用實踐 臨床上用于評估T細胞對多克隆刺激劑的增殖能力，反映T細胞基本免疫功能，即T細胞群總體的信息，不能反映個別T細胞克隆的情況 PHA常用于測試人T細胞增殖能力，Con A常用于測試小鼠T細胞增殖能力。絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)應(yīng)用實踐絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)混合淋巴細胞培養(yǎng)反應(yīng) 原 理 T細胞受體能夠識別同

14、種異型MHC分子。當把2個不同個體的單個核細胞在體外混合時，可以相互刺激，引起增殖。增殖的強度與兩者之間MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細胞反應(yīng)的強度反映2個個體之間MHC差別的程度，并且因為相互識別與增殖，結(jié)果是2個個體的淋巴細胞增殖能力的總和。這種試驗就是雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗。 將參加反應(yīng)之一方的單個核細胞用放射性核素照射，使其失去反應(yīng)能力，但仍保存刺激能力，成為刺激細胞，則此時的反應(yīng)結(jié)果僅反映另一方（反應(yīng)方）的增殖能力。在實質(zhì)性器官移植時，只需了解受者淋巴細胞對供者MHC的反應(yīng)能力，所以適合采用單向混合淋巴細胞培養(yǎng)反應(yīng)?；旌狭馨图毎囵B(yǎng)反應(yīng) 原 理單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試

15、驗方法 1. 分離宿主與供者的PBMC，調(diào)整細胞濃度為1 x 106/ml 2. 刺激細胞滅活：用絲裂霉素（終濃度25g，37 C， 5C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法處理刺激細胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激細胞和1x105反應(yīng)細胞。 37C，5CO2，46d。加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。陽性對照孔加反應(yīng)細胞和絲裂原，不加刺激細胞。陰性對照孔只加照射的自身細胞，設(shè)3復(fù)孔。 4. 收集細胞，液閃儀計數(shù)，打印結(jié)果。單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗方法單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗 5. 計算相對反應(yīng)（RR） （實驗組cpm陰性對照組cpm） RR 陽性對照組cpm陰

16、性對照組cpm 單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗 5. 計算相對反應(yīng)（RR）單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗注意事項 1. 細胞活力：使用冷凍細胞時，復(fù)蘇后應(yīng)檢查細胞活力。 2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有的血清可能會刺激或抑制反應(yīng)。 3. 本底應(yīng)小于2000 rpm，陽性對照組應(yīng)大于20000 rpm。單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗注意事項應(yīng)用實踐1）主要用于估計器官移植前供體與受者之間MHC相配程度；2）也可用于移植后急性排斥反應(yīng)的監(jiān)測指標和HLA、H-2II類抗原的分型等研究；3）在研究淋巴細胞功能和免疫調(diào)節(jié)中也有廣泛應(yīng)用。單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗應(yīng)用實踐單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗CTL殺傷功能的測定基礎(chǔ)理論 CT

17、L為細胞毒性T淋巴細胞的簡稱。是CD8T細胞識別APC表面MHC I類分子遞呈的腫瘤或病毒特異性抗原肽后，分化形成的。當CTL遇到相應(yīng)的腫瘤細胞或病毒感染細胞時，能夠通過細胞接觸機制或裂解機制殺傷靶細胞。CTL殺傷功能的測定基礎(chǔ)理論CTL殺傷功能的測定1. 細胞接觸機制 CTL表達FasL，靶細胞表達Fas，F(xiàn)asL與Fas的配接，通過Fas傳入的信號激活靶細胞內(nèi)細胞凋亡途徑，導(dǎo)致靶細胞死亡。2. 細胞裂解機制 CTL激活后，胞質(zhì)內(nèi)顆粒向2個細胞接觸點移動。顆粒膜與細胞膜融合通過外吐釋放顆粒內(nèi)容物。穿孔素插入靶細胞膜后聚合，在細胞膜上形成孔，造成細胞裂解。顆粒酶誘導(dǎo)靶細胞凋亡。CTL殺傷功能的

18、測定1. 細胞接觸機制CTL殺傷功能的測定 51Cr釋放法：在將靶細胞與CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿過細胞膜進入胞漿，與胞漿中小分子蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，不能自由從細胞內(nèi)釋放。當靶細胞膜被CTL破壞后， 51Cr被釋放進入上清。因為上清中放射性強度與細胞殺傷程度呈正比，通過測定上清中放射性強度，就可以判定CTL殺傷能力。LDH釋放法: 酸脫氫酶（LDH）在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時不能通過細胞膜，當細胞受損傷或死亡時可釋放到細胞外，此時細胞培養(yǎng)液中LDH活性與細胞死亡數(shù)目成正比，用比色法測定并與靶細胞對照孔LDH活性比較，可計算效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷%。本法操作簡便快捷，自

19、然釋放率低，可用于CTL及NK細胞活性測定及藥物、化學(xué)物質(zhì)或放射引起的細胞毒性，應(yīng)注意較高濃度FCS中所含LDH可能干擾結(jié)果。CTL殺傷功能的測定 51Cr釋放法：在將靶細胞與CTL混合CTL殺傷功能的測定方法：1. 從腫瘤組織中分離淋巴細胞和腫瘤細胞。2. 51Cr標記腫瘤細胞。3. 96孔培養(yǎng)板每孔中加入淋巴細胞和靶細胞，效：靶比為50:1，25:1，12.5:1。另設(shè)最大釋放對照（靶細胞加去污劑）和自發(fā)釋放對照（不加CTL）。4. 37C，5CO2，4h。5. 收集上清，計數(shù)器測定放射活性（cpm）。CTL殺傷功能的測定方法：CTL殺傷功能的測定 計算公式 試驗組平均CPM值自發(fā)釋放組平

20、均cpm值溶解 最大釋放平均cpm值自發(fā)釋放平均cpm值 注意事項 由于CTL殺傷靶細胞受MHC限制，所以靶細胞必須來自自身，或選用表達適當MHC的腫瘤細胞系。 優(yōu)點：方法簡單、快速，能定量。 缺點：自然釋放率高，需要靶細胞量多。使用放射性核素。CTL殺傷功能的測定 計算公式CTL殺傷功能的測定 應(yīng)用實踐 這一方法常用于評估腫瘤患者CTL殺傷腫瘤的能力，可作為判斷雨后和觀察療效的指標之一。CTL殺傷功能的測定 應(yīng)用實踐抗原肽MHC分子四聚體技術(shù)(tetramer)用生物素化的抗原肽MHC分子復(fù)合物與熒光標記的親合素結(jié)合，由于1個熒光素標記的親合素可結(jié)合4個生物素分子，能使4個MHC抗原肽復(fù)合物

21、形成一個復(fù)合體，將該復(fù)合體標記熒光素后，即成抗原特異性四聚體。抗原特異性四聚體能與樣品中的特異性T細胞的TCR結(jié)合，由于四聚體能同時結(jié)合一個T細胞表面的4個TCR，親和力大大提高。用流式細胞術(shù)即可確定待檢標本中抗原特異性CTL細胞的頻率。MHC分子可為I類或類分子，與抗原肽形成的四聚體復(fù)合物，可分別鑒定表達特異性TCR的CD8+T細胞及CD4+T細胞的頻率?？乖腗HC分子四聚體技術(shù)(tetramer)用生物素化的免疫學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用PartIII課件B細胞的鑒定及功能測定B淋巴細胞的分離：尼龍毛法、磁珠分離法 CD19（B220）/ CD45R+B淋巴細胞的活化方法：Anti-IgM A

22、b； CD40L、 LPS、PWMB淋巴細胞的增殖檢測：3H-TdR滲入法、BrdU摻入法測定B細胞產(chǎn)生抗體的能力：ELISA、ELISPOTB細胞的鑒定及功能測定B淋巴細胞的分離：尼龍毛法、磁珠分離法B細胞產(chǎn)生抗體能力的測定 基礎(chǔ)理論 B細胞受到多克隆激活劑或特異性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成為漿細胞，產(chǎn)生抗體?？贵w可以在血漿和其他體液中檢出，檢測抗體是測定B細胞功能的最重要的方法。 B細胞分類：B1細胞和B2細胞。兩者發(fā)生學(xué)不同、接受刺激的抗原不同，對T細胞的依賴性不同。 由于B2細胞對抗原的應(yīng)答依賴T細胞，所以，B細胞產(chǎn)生抗體能力的低下，其缺陷也可能起源于T細胞缺陷。B細胞產(chǎn)生抗體

23、能力的測定 基礎(chǔ)理論ELISPOT法 基礎(chǔ)理論 ELISPOT全稱為酶聯(lián)免疫斑點試驗（enzymelinked immunospot assay），可用于測定產(chǎn)生IgG和IgM抗體的B細胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特異性B細胞。如果B細胞產(chǎn)生抗體，抗體與板上的抗原結(jié)合。加入酶標二抗和顯色劑就會顯色。一個斑點就代表一個產(chǎn)生抗體的細胞。ELISPOT法 基礎(chǔ)理論ELISPOT法技術(shù)方法1. 抗原包被：37C2h，或4C過夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、96孔板。2. 抗體生成細胞培育：加入適量抗體生成細胞，37C，5CO2，過夜。洗滌，去除未與固相結(jié)合的細胞3. 測定斑點產(chǎn)

24、生細胞：加二抗， 37C，5CO2，23h。加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。4. 計數(shù)：24h后用1030倍顯微鏡下計數(shù)斑點形成細胞ELISPOT法技術(shù)方法ELISPOT法評價1. 在操作中應(yīng)使用無關(guān)抗原作陰性對照；病應(yīng)排除細胞標本終抗體污染。2. 硝酸纖維素膜靈敏度高于聚苯乙烯。3. 與ELISA聯(lián)合使用，可以估計單個細胞的抗體產(chǎn)量。4. 當淋巴細胞受到嚴重污染時，也可以使用本法，所以適用于測定組織中抗體生成細胞。應(yīng)用實踐 用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。ELISPOT法評價ELISA測定各類免疫球蛋白基礎(chǔ)理論 B細胞受抗原刺激后，最初產(chǎn)生IgM抗體，然后在Th細胞產(chǎn)

25、生的各種細胞因子的作用下，可轉(zhuǎn)類成為IgG、IgA、IgE類抗體。應(yīng)用不同的單抗，結(jié)合ELISA方法，可以測定B細胞產(chǎn)生的抗體的類別。ELISA測定各類免疫球蛋白基礎(chǔ)理論ELISA測定各類免疫球蛋白方法1. 包板：96孔板用濃度為10g/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板，37C，5CO2，2h，或4C過夜。常規(guī)洗板，封閉。2. 上樣：每孔內(nèi)加入1:10或1:20 稀釋的細胞培養(yǎng)上清液100l。陽性對照為標準品，陰性對照為培養(yǎng)液。每試驗設(shè)2復(fù)本。室溫培育2h，或4C過夜。3. 加酶標二抗：每孔加100l堿性磷酸酶標記的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室溫培育2h，或4C過夜。4. 顯色：洗板，每孔加100l底物（pnitrophenyl phosphate）。5. 自動酶標儀讀數(shù)，從標準曲線讀出抗體濃度。ELISA測定各類免疫球蛋白方法ELISA測定各類免疫球蛋白評價 ELISA法靈敏、簡單、快速、特異性高、重復(fù)性好，是測定上清和體液中Ig的首選方法。堿性磷酸酶標記的二抗顯色明顯，不必用堿中止反應(yīng)，尤其適用于測定體外產(chǎn)生的抗體。應(yīng)用實踐 ELISA可測定各種體液中的抗體，