革蘭氏陰性需氧桿菌的檢驗

1、革蘭氏陰性需氧桿菌的檢驗一、布氏桿菌屬（Brucella）布氏桿菌又名布魯氏菌, 1887年Bruce從死亡士兵脾臟中分到第一株布魯菌，可引起多種動物發(fā)病。主要寄居于肝、脾和淋巴組織的單核細胞，是胞內(nèi)寄生菌。布氏桿菌屬（Brucella）是一類革蘭氏陰性短小桿菌，引起母畜傳染性流產(chǎn)。人類接觸帶菌動物或食用病畜及其乳制品均可被感染。我國部分地區(qū)曾有流行，現(xiàn)基本控制。布氏桿菌屬分為羊、牛、豬、鼠、綿羊及犬布氏桿菌6個種，20個生物型。我國主要流行羊(Br. Melitensis)、牛(Br. Bovis)、豬(Br. suis)三種。 （一）形態(tài)及染色特性1、G球桿狀或細小短桿狀；大小0.5-0.

2、70.6-1.5m。多單在，無芽胞、無鞭毛；毒力菌株有菲薄的微莢膜。2、病料或初次分離為球桿狀，傳代后豬和牛源逐漸變?yōu)闂U狀，而羊源仍呈球桿狀。3、常用 柯茲羅夫斯基染色法即柯氏染色法：本菌紅色，其他組織細胞與雜菌均呈綠色或蘭色。（二）培養(yǎng)及生化特性 1、專性需氧。牛布氏桿菌初次分離需在5-10% CO2，移種幾代后不需要CO2。最適溫度37，pH6.6-7.2。2、營養(yǎng)要求高，生長時需硫胺素，煙草酸和生物素，泛酸鈣等；普通瓊脂上生長貧瘠，加馬血清、血液、葡萄糖、甘油、胰化酪蛋白大豆胨等可促進本菌生長。實驗室常用肝湯瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、胰蛋白胨瓊脂、改良厚氏培養(yǎng)基分離該菌。3、液體培養(yǎng)基上呈輕

3、微渾濁，時間長可形成厚菌膜；固體培養(yǎng)基上有S、 R 、I、 M型菌落，大小不一。固體培養(yǎng)基的菌落特征光滑 (S)型：菌落無色透明、表面光滑濕潤、有光澤、透光呈淡黃色及側(cè)光呈現(xiàn)輕微乳色和略帶藍灰色，菌落大小不等，一般直徑為0510mm，小者0050.1mm，大者34mm.粗糙 (R)型：菌落不太透明，呈多顆粒狀，表面灰暗，顏色由無光澤白色、淡黃白色或淺黃色到褐色，易碎或黏滯不易從培養(yǎng)基表面刮凈。有時還可出現(xiàn)渾濁不透明、黏膠狀的黏液(M)型菌落。除S、R和M型菌落外，在培養(yǎng)中還會出現(xiàn)這此菌落間的過渡類型，如S+R型菌落間的中間(I)型菌落。 4、菌落特性（1）肝湯瓊脂或胰蛋白胨瓊脂：培養(yǎng)4d，呈細

4、小、柔軟、濕潤、圓形、隆起、透明和閃光的露滴狀菌落，菌落大小不等，小的0.050.1mm，大的0.51.0mm；（2）血瓊脂：灰白、隆起的細小圓形菌落，不溶血; （3）麥康凱瓊脂上不能生長; （4）注意：布氏桿菌易發(fā)生S-R變異。此菌生長緩慢，48 h后才出現(xiàn)透明小菌落，雞胚培養(yǎng)也能生長。5、種和生物型該屬現(xiàn)包括6個種20個生物型，即馬爾他布氏桿菌生物型13、流產(chǎn)布氏桿菌生物型19、豬布氏桿菌生物型15、綿羊布氏桿菌、沙林鼠布氏桿菌和犬布氏桿菌。（三）抵抗力1、自然界中抵抗力較強，陽光直射和干燥條件下抵抗力較弱；在病畜臟器和分泌物中一般能存活4個月，在食品中約能生存2個月。2、對低溫抵抗力強，

5、對濕熱敏感， 60加熱30min或705min即殺死，煮沸立即死亡。 。3、對鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素等均敏感。 對一些消毒劑也很敏感對消毒劑的抵抗力也不強，2%石炭酸、來蘇兒、燒堿溶液或0.1%的升汞，可于lh內(nèi)殺死本菌;5%新鮮石灰乳或1%2%福爾馬林3h可將其殺死;05%洗必泰或001%度米芬、消毒凈或新潔爾滅，5min內(nèi)即可殺死本菌。在pH5或更低情況下迅速死亡。（四）抗原性及變異性1、屬內(nèi)抗原：（1） 細胞壁表面的脂多糖蛋白復(fù)合物，包括A（牛布氏桿菌主要成份）和M（羊布氏桿菌主要成份）兩種。牛布氏桿菌（Am）含A 抗原多，含M抗原少。羊布氏桿菌(aM)含A 抗原少，含M抗原多?？捎媚?/p>

6、吸附試驗制備單因子血清，供菌種鑒定用。（2）細胞壁內(nèi)部的脂多糖復(fù)合物R抗原（不凝集S型菌的A、M抗體）；發(fā)生SR變異后，喪失A、M抗原，可暴露R抗原。綿羊種和犬種布氏桿菌是天然R型種，其他種為S型種。布氏桿菌最常見的變異是SR變異，很少發(fā)生回變。2、屬外抗原：指布氏桿菌能與巴氏桿菌、變形桿菌、弗朗西斯菌、弧菌、彎曲桿菌、鉤端螺旋體、假單胞菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌以及大腸桿菌等菌屬細菌發(fā)生交叉凝集反應(yīng)的抗原。（五）致病性1、致病因子：不產(chǎn)生外毒素，僅有毒性很強的內(nèi)毒素LPS。2、感染與致病機理： 本菌侵入機體后，被吞噬細胞吞噬，但本菌的莢膜能抵抗吞噬細胞的裂解，并能在該細胞內(nèi)增殖，成為細胞內(nèi)寄生

7、菌。 繁殖到一定數(shù)量后，經(jīng)淋巴管至局部淋巴結(jié)，突破淋巴結(jié)屏障而進入血流，反復(fù)出現(xiàn)菌血癥。由于內(nèi)毒素作用，病人出現(xiàn)發(fā)熱、無力等中毒癥狀，以后本菌隨血液侵入脾、肝、骨髓等細胞內(nèi)寄生，血流中細菌逐步消失，體溫也恢復(fù)正常。 細菌在細胞內(nèi)繁殖至一定程度時，再次進入血流，出現(xiàn)菌血癥，體溫再次上升，反復(fù)呈波浪熱型。 因本菌多為細胞內(nèi)寄生，難于徹底治療，易轉(zhuǎn)為慢性及反復(fù)發(fā)作，從而在全身各處引起遷徒性病變。（六）微生物學(xué)診斷布氏桿菌病常表現(xiàn)為慢性或隱性感染，其診斷和檢疫主要依靠血清學(xué)檢查及變態(tài)反應(yīng)檢查。細菌學(xué)檢查僅用于發(fā)生流產(chǎn)的動物和其他特殊情況。 本菌傳染性大，要注意防止實驗室污染。 1、細菌學(xué)檢查采樣：病料

8、最好用流產(chǎn)胎兒的胃內(nèi)容物、肺、肝和脾以及流產(chǎn)胎盤和羊水等。也可采用陰道分泌物、乳汁、血液、精液、尿液以及急宰病畜的子宮、乳房、精囊、睪丸、附睪、淋巴結(jié)、骨髓和其他有局部病變的器官。顯微鏡檢查： 病料直接涂片，作革蘭氏和柯茲洛夫斯基染色鏡檢。若發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性、鑒別染色為紅色的球狀桿菌或短小桿菌，即可作出初步的疑似診斷。此法更適合于作流產(chǎn)材料及流產(chǎn)數(shù)日月內(nèi)的陰道分泌物檢查。分離培養(yǎng)鑒定：急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接種于雙相肝浸液培養(yǎng)基(一半斜面，一半液體)，置37 10% CO2中培養(yǎng)，每隔2d檢查一次，培養(yǎng)30d無細菌可定陰性。2、變態(tài)反應(yīng)檢測不宜作早期診斷。布氏桿菌水解素注射皮膚，觀察紅

9、腫反應(yīng)。1-2cm為弱+；2-3cm為+；4-6cm為強+。3、血清學(xué)檢查可檢測血清中布氏桿菌抗體和病料中布氏桿菌。用已知抗體可檢查病料中是否存在布氏桿菌，或分離培養(yǎng)物是否為布氏桿菌，比細菌學(xué)檢查法簡便快速，因而具有較大實用價值。常用方法有熒光抗體技術(shù)、反向間接血凝試驗、間接炭凝集試驗以及免疫酶組化法染色等。動物在感染布氏桿菌715d可出現(xiàn)抗體，檢測血清中的抗體是布氏桿菌病診斷和檢疫的主要手段。方法多，各有所長，目前還沒有一種完美的方法。因此在實際工作中，最好用一種以上的方法相互配合。血清學(xué)檢查：用已知的布氏桿菌檢查動物的血清抗體凝集試驗（虎紅平板凝集試驗）感染初期檢測。大動物血清凝集價達1：

10、100時陽性，1：50可疑；小動物1：50為陽性，1：25為可疑。補體結(jié)合試驗：慢性布氏桿菌病診斷。規(guī)定1: 10被檢血清阻止溶血在50%以上即陽性。凝集反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)出現(xiàn)的時間各有特點。即動物感染布氏桿菌后，首先出現(xiàn)凝集反應(yīng)，消失較早;其次出現(xiàn)補體結(jié)合反應(yīng)，消失較晚；最后出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，保持時間也較長。在感染初期階段，凝集反應(yīng)常為陽性，補體結(jié)合反應(yīng)或為陽性或為陰性，變態(tài)反應(yīng)則為陰性。到晚期慢性或恢復(fù)階段，則凝集反應(yīng)與補體結(jié)合反應(yīng)均轉(zhuǎn)為陰性，僅變態(tài)反應(yīng)呈現(xiàn)陽性。因此有人主張，為了徹底消除各類病畜，應(yīng)同時使用三種方法進行綜合診斷。微生物學(xué)檢驗二、假單胞菌屬（Pseudomonas M

11、igula 1894）G ，直或微彎的桿菌，0.5-1.01.5-5.0m。多單在。不產(chǎn)芽孢。以單極或數(shù)根極毛運動，有的種還具短波長的側(cè)毛。嚴格需氧。不能在酸性下（pH4.5）生長，多數(shù)種不需要有機生長因子?；墚愷B(yǎng)，有的種利用H2或CO為能源兼性化能自養(yǎng)。接觸酶陽性, 產(chǎn)生各種水溶性色素。自然界分布極廣，土壤、淡海水、污水、動植物體表等均存在。引起疾病(Pseudomonas Disease)的有綠膿桿菌、熒光假單胞菌、鰻敗血假單胞菌和惡臭假單胞菌等。（一）銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa ）原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、

12、呼吸道和腸道等都有本菌存在。易從外傷、燒傷及尿道感染的標本分離。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。 1 形態(tài)及染色特征銅綠假單胞菌為非發(fā)酵革蘭氏陰性菌，菌體細長，長短不一， 呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。菌體一端單鞭毛，暗視野或相差顯微鏡下可見細菌運動活潑。2 生長特性專性需氧，生長溫度2542，最適2530，4不生長，42可生長，可用以鑒別該菌。 普通培養(yǎng)基上生長1824h可見扁平、濕潤的菌落，能產(chǎn)生水溶性的色素，如綠膿素（pyocynin）與帶熒光的水溶性熒光素（pyoverdin）等，使得培養(yǎng)基呈亮綠色。 血瓊脂平板生長可見菌落周圍有溶血環(huán)，菌落呈金屬光澤；液體培養(yǎng)基呈渾濁狀生長，液體

13、表面形成菌膜，培養(yǎng)基底部生長不良。 3 生化特點該菌氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖、木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖。 液化明膠、可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮氣。 吲哚陰性，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。4 抗原性與分型該菌含O抗原（菌體抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含兩種成分：一種是其外膜蛋白，為保護性抗原；另一種是脂多糖，有特異性。O抗原可用以分型。 （1）噬菌體分型：所應(yīng)用的噬菌體現(xiàn)有24株，分型率達90%。 （2）血清學(xué)分型：利用O抗原進行分型，目前可分20個血清型。 （3）質(zhì)粒指紋圖分析：此項技術(shù)是對同種細菌的不同株進行同源性分析的一種方法。根據(jù)細菌攜帶質(zhì)粒的

14、情況進行分析。 5 微生物學(xué)檢查標本采集：采自不同感染部位的各種標本，包括血液、尿液、痰標本、膿汁、穿刺液等。還包括來自環(huán)境中的各種標本如水、空氣、物體表面等。 涂片鏡檢: 革蘭陰性，菌體大小1.5-5.00.5-1m。菌體的一端有單鞭毛，無芽胞。 分離培養(yǎng): 對有正常菌群存在的臨床標本或采自環(huán)境中的標本應(yīng)接種選擇性培養(yǎng)基: 麥康凱瓊脂(MAC)； 對無正常菌群存在的臨床標本如血液、腦脊液、穿刺液等可接種普通或血瓊脂培養(yǎng)基。（二）椰毒假單胞菌酵米面亞種 椰毒假單胞菌酵米面亞種（Psedomonas cocovenenans supsp. farino fermentans）是我國發(fā)現(xiàn)的一種新的

15、食物中毒菌，它存在于發(fā)酵的玉米、糯玉米、黃米、高梁米、變質(zhì)銀耳以及周圍環(huán)境中，它是酵米面及變質(zhì)銀耳中毒的病原菌。該菌產(chǎn)生的毒素米酵菌酸是其致病原因。1 形態(tài)及染色特征革蘭氏陰性短桿菌，大小為1.5-4m0.5-1.0m，直或微彎的需氧桿菌。細胞呈卵圓、短桿狀以至長桿狀形態(tài)。兩端鈍圓，無芽胞，有鞭毛。兼性厭氧，但易在表面生長。 胞漿中含濃染顆粒及空泡。在透射電鏡下觀察,可見異染顆粒、脂質(zhì)顆粒、板層狀內(nèi)膜結(jié)構(gòu)等特殊結(jié)構(gòu)。假單胞菌屬為有機化能異養(yǎng)菌,代謝為呼吸而非發(fā)酵,有些是兼性化能自養(yǎng)菌,能利用H2或CO2為能源。分子氧是普遍的電子受體,有些能脫氮而利用硝酸鹽為替代的受體。除能利用脫氮作用以厭氧呼

16、吸的一些外,均為嚴格或?qū)Ｐ孕柩蹙＞﹄m不明顯呈色,但部分菌可產(chǎn)生水溶性色素和熒光色素。2 生長培養(yǎng)特性椰毒假單胞菌的某些菌株在有硝酸鹽環(huán)境中可呈厭氧生長。營養(yǎng)要求不嚴格,幾乎所有菌群在銨鹽和單一碳源環(huán)境中均可生長。生長溫度為2537 ,最適生長溫度為37 ,最適產(chǎn)毒溫度為26 。PDA平板上生長,菌落大小為12mm,呈乳白色或灰白色,光滑、濕潤、邊緣整齊;培養(yǎng)48h后,中心有突起,呈草帽狀或放射狀花紋;菌落周圍有黃綠色素產(chǎn)生,并擴散到基質(zhì)中。在365nm紫外燈下有黃綠色熒光。卵黃瓊脂平板上生長,菌落表面光滑、濕潤,48h后,菌落周圍形成乳白色渾濁環(huán),斜射日光下可見環(huán)的表面呈虹彩現(xiàn)象。S.S瓊

17、脂平板不生長。以脫脂椰肉為基質(zhì),接種椰毒假單胞菌,30下培養(yǎng)4d產(chǎn)生的米酵菌酸,可溶于石油醚中,用PHS的水萃取后調(diào)pH至23,可再用石油醚或乙醚萃取,如此反復(fù)可得到較純凈的米酵菌酸。3 生化特性假單胞菌氧化糖類只產(chǎn)生少量的酸。蛋白胨糖水不適用于測定酸的產(chǎn)生。因為產(chǎn)生的酸常被蛋白胨分解產(chǎn)生的堿所中和。用銨鹽培養(yǎng)基易測定酸的產(chǎn)生。因在該培養(yǎng)基中糖是唯一碳源。過氧化氫酶陽性。假單胞菌能產(chǎn)生和分泌許多胞外酶,包括蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶等。明膠酶的產(chǎn)生對其分類很重要。4 抵抗力在PDA上生長的椰酵假單胞菌,對金霉素、土霉素、四環(huán)素、慶大霉素較為敏感,對青霉素、紅霉素、合霉素、氯霉素、新霉素具有很強的抗性。椰酵假單胞菌對一般常用的消毒劑都很敏感,但鑒于許多消毒劑本身的毒性和殘留問題,僅可用于實驗室消毒。亞硫酸氫鈉對椰酵假單胞菌具有較強的抑菌和殺菌作用,可用于某些食品加工過程的消毒。5 抗原構(gòu)造椰酵假單胞菌具有O、K、H3種抗原。很少發(fā)生交叉反應(yīng)。O抗原為菌體抗原,耐熱,凝集反應(yīng)出現(xiàn)較慢,聚集物呈顆粒狀。H抗原為鞭毛抗原,不耐熱,凝集反應(yīng)發(fā)生迅速