細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡介09.5.22課件

第十三章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)cellculture2009.5.22細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展簡史

1907年Harrison首創(chuàng)體外組織培養(yǎng)法(單蓋片懸滴培養(yǎng))；

1912年Carrel將原代細(xì)胞進(jìn)行了長期傳代培養(yǎng)；

1951年Eagle開發(fā)了人工合成培養(yǎng)基；為何要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是很多實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，細(xì)胞是研究的對象；在分子生物學(xué)的功能研究中，細(xì)胞是研究分子功能的載體。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)非?；A(chǔ)，是實(shí)驗(yàn)操作的基本功之一，所以很重要。怎樣進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)1準(zhǔn)備工作:包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。2取材:在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞，經(jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材。3培養(yǎng):將組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿。4凍存及復(fù)蘇：為了保存細(xì)胞要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度為液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管,加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存保存于液氮中，在液氮中細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。凍存細(xì)胞要快速融化即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在1分鐘內(nèi)迅速融解，離心去除凍存培養(yǎng)基，將細(xì)胞直接加入完全生長培養(yǎng)基中。5常用儀器設(shè)備:無菌室,超凈工作臺(tái),蒸氣消毒鍋,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無菌過濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。2、原代培養(yǎng)(primaryculture)：即第一次培養(yǎng)，指將培養(yǎng)物放在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。3、傳代(passage)：原代培養(yǎng)成功后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面因營養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于生長或發(fā)生中毒。需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程稱為傳代或者再培養(yǎng)（subculture）。4、細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后，即成細(xì)胞系。如細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細(xì)胞系(finitecellline)，它由原代培養(yǎng)中的許多細(xì)胞系列組成。如細(xì)胞系可連續(xù)傳代，則稱為連續(xù)細(xì)胞系(continouscellline)，即已建成的細(xì)胞系（establishedcellline）。5、細(xì)胞株(cellstrain)：通過篩選或克隆化，且有特殊性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞。這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。這些特性包括具有一定的標(biāo)記染色體，對某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。

體外培養(yǎng)細(xì)胞株1、貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞型、上皮型細(xì)胞、游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型。2、懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。

THP-1（ATCC）Organ:peripheralblood

Disease:acutemonocyticleukemia

CellType:monocyte;ATCCcompletegrowthmedium:ThebasemediumforthiscelllineisATCC-formulatedRPMI-1640Medium,CatalogNo.30-2001.Tomakethecompletegrowthmedium,addthefollowingcomponentstothebasemedium:2-mercaptoethanoltoafinalconcentrationof0.05mM;fetalbovineserumtoafinalconcentrationof10%.

Temperature:37.0°C

Atmosphere:air,95%;carbondioxide(CO2),5%細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理

應(yīng)用顯微鏡的成像原理，并借助血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)算單位體積的細(xì)胞或微小生物的數(shù)量。二.試劑與器械器材:光學(xué)顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。Preservation:Freezemedium:Completegrowthmediumsupplementedwith5%(v/v)DMSO

Storagetemperature:liquidnitrogenvaporphase；-80℃Mr.frosy(NalgNuncInternational,catalogno.5100-0001)isopropanol

細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：

1．潛伏期：細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。潛伏期細(xì)胞基本無增殖，少見分裂相。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志著細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。

2.指數(shù)增生期：是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，其數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂（MitoticIndex：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。3．停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。此期細(xì)胞仍有代謝活動(dòng)，消耗營養(yǎng)，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，故傳代越早越好。原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)離體時(shí)間短，具有兩倍體遺傳性，在一定程度上反映了體內(nèi)生長的特性，很適合作藥物測試、細(xì)胞功能等實(shí)驗(yàn)研究。一般常用方法有二：1、組織塊培養(yǎng)法，2、單層細(xì)胞培養(yǎng)法。一般程序包括:取材、漂洗、剪切、消化、制備單細(xì)胞懸液、接種。樹突狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1、用梯度密度離心法分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。2、用磁珠分離法分離CD14+單核細(xì)胞3、用FACS檢測CD14+單核細(xì)胞的純度4、用GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分化成CD1a+的樹突狀細(xì)胞5、用FACS檢測CD1a+樹突狀細(xì)胞的純度

先嚴(yán)格按照protocal進(jìn)行操作，然后根據(jù)所研究細(xì)胞的特點(diǎn)，看看是否需要優(yōu)化。

原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞生命期：是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

1）原代培養(yǎng)期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周，這過程中需要換液。

2）傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。

3）衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。

注意事項(xiàng)防止污染：注意操作無菌；保證其營養(yǎng):了解要細(xì)胞的特性。根據(jù)文獻(xiàn)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的操作，來養(yǎng)好細(xì)胞，使其處于良好的狀態(tài)，從而有利于進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)的研究，或者某個(gè)分子的研究。污染是怎樣的國內(nèi)網(wǎng)站小木蟲丁香園

常用細(xì)胞庫

美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Rockville,MD)人類及動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞收藏中心

中科院細(xì)胞庫

九、細(xì)胞庫(CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures,NavalBiosciencesLaboratory,CellCultureDepartmentNavalSupplyCenter,Oakland,CA)(HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCellCultureRepositories,InstituteforMedicalResearch,Camden,NJ)

歐洲

培養(yǎng)細(xì)胞收藏中心(CulturedeCellulesEucaryotes,Paris)動(dòng)物細(xì)胞收藏中心(EuropeanCollectionforAnimalCellCultures,ECACC,England人類基因突變細(xì)胞庫(EuropeanHumanGeneticMutantCellBank,Rotterdam)

日本

國立腫瘤細(xì)胞系收藏中心(CollectionofCancerCellLines,Tokyo)國立普通細(xì)胞庫(GeneralCellBank,Saitama)附錄一常用培養(yǎng)器皿清洗、包裝及消毒

(一)清洗新的或重復(fù)使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，不含任何殘留物。

1玻璃器皿清洗步驟包括:浸泡、刷洗、浸酸和沖洗浸泡：新玻璃器皿先用自來水刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。刷洗：將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的器皿洗凈、晾干，備浸酸。

浸酸：浸酸是將上述器皿浸泡到酸液中，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的殘留物。浸酸不應(yīng)少于６小時(shí)，可過夜或更長。沖洗：浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水—倒空”15次，重蒸水浸洗2－3次，烘干后包裝備用。2橡膠器材的清洗

用0.5MNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。3塑料制品清洗用后立即清水沖洗，浸于自來水過夜，用紗布和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍），蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時(shí)，晾干備用。4濾器清洗

用清洗液刷洗，流水沖洗，蒸餾水浸泡24小時(shí)，雙蒸水浸泡24小時(shí)，晾干備用。

（二）包裝對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。

（三）消毒和滅菌微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因

1)紫外線：紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜?？梢韵究諝夂团囵B(yǎng)用具；2)高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90－120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。

燒灼也是滅菌方法之一，常用酒精燈火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。

3)高溫濕熱滅菌壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法，對生物材料有良好的穿透力，布類、璃璃器皿、金屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法。4)過濾消毒：主要是微孔濾膜濾器除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液必須用過濾消毒；5)消毒劑：0.1％新潔爾滅水溶液,75%酒精可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒；

6)抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，應(yīng)根據(jù)需要?dú)绲奈⑸镞x擇不同抗生素。

7）電離輻射：大包裝塑料器皿或不能用上述方法消毒的試劑。附錄二、細(xì)胞培養(yǎng)用液

1.培養(yǎng)用水配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水，存放時(shí)間一般不應(yīng)超過2周。2.平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水，配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

3.消化液取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶溶液。3.1胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度。

3.2EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶。

3.3膠原酶溶液：膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或20萬U/L,作用的最佳pH為6.5。

4.pH調(diào)整液常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

4.1NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。4.2HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。

5.抗生素常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml，鏈霉素終濃度0.01g/100ml。附錄三、細(xì)胞培養(yǎng)基

（一）細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

1.營養(yǎng)成分維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個(gè)方面：

氨基酸：所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。

單糖：體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

維生素：生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

2.促生長因子及激素：各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。

3滲透壓：細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中。對于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

4pH：氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體要是氧和二氧化碳。在開放培養(yǎng)時(shí)，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。（二）細(xì)胞培養(yǎng)基的分類

1.天然細(xì)胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。

1.1血清：目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。1.2胚胎浸出液：是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。1.3水解乳蛋白：為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。

2、合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，基本組分包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。如TC199、MEM、RPMI1640、DMEM等。3.無血清細(xì)胞培養(yǎng)基3.1無血清培養(yǎng)基：是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外生長繁殖的合成培養(yǎng)基。適用于某些特殊實(shí)驗(yàn)：如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，需要排除其他生長因子的干擾作用，而血清中可能含有各種生長因子

3.2無血清培養(yǎng)基的基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分：添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：促貼壁物質(zhì)；促生長因子及激素；酶抑制劑；結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；微量元素，硒是最常見的。

附錄四、常見組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法

體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:

（一）上皮細(xì)胞培養(yǎng)

以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞，其法如下：

1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30－60分鐘。

6、反復(fù)吹打，制成懸液。

7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

（二）內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對于研究內(nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價(jià)值。

研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，方法如下：

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。

5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。

（三）肌組織細(xì)胞培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

1.心肌細(xì)胞培養(yǎng)

心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料，最常用的是雞胚心肌。心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時(shí)，1周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

2.骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

1）出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2）無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。

3）計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

4）快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5）培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化（明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠）。

細(xì)胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52h后出現(xiàn)融合。數(shù)日后融合停止，可觀察到橫紋，一般在融合后2、3天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。（四）神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外