蛋白質組學課件

Proteome&ProteomicsProteome&Proteomics定義Proteome：1994年，由澳大利亞Macguarie大學的Wilkins等首先提出：“蛋白質組指的是一個基因組所表達的全部蛋白質”(proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome)“proteome”是由蛋白質一詞的前幾個字母“prote”和基因組一詞的后幾個字母“ome”拼接而成蛋白質組(Proteome)

:細胞內的全部蛋白質Proteomics定義蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，研究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化規(guī)律的科學最早是在1995年提出的，它在本質上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質特征：表達水平（量）翻譯后的修飾（成熟與調控）蛋白與蛋白相互作用（信號通路）等由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識Proteome與Genome關系互補的角度/空間來研究細胞的分子架構相輔相成Genome導演

RNome

編劇 Proteome演員Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性Proteome靜態(tài)Genome動態(tài)修飾化程度Proteome高Genome底復雜程度Proteome高（20aa+高度多樣性修飾）Genome底（4nt）特異性Proteome組織和細胞特異性Genome無組織和細胞特異性功能蛋白質組(functionalproteome)1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定時間、特定環(huán)境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋白質。功能蛋白質組只是總蛋白質組的一部分，通過對功能蛋白質組的研究，既能闡明某一群體蛋白質的功能，亦能豐富總蛋白質數(shù)據(jù)庫，是從生物大分子(蛋白質、基因)水平到細胞水平研究的重要橋梁環(huán)節(jié)。功能蛋白質組蛋白質組學研究思路與方法策略、技術、工具蛋白質組研究相關網站蛋白質組學研究依賴生物信息學和網絡技術

蛋白質組研究技術、信息等

發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用(新藥開發(fā))

蛋白質組研究相關企業(yè)、各種儀器來源、新聞等teome.co.uk

各種蛋白質組研究相關信息http://www.micromass.co.uk

介紹蛋白質鑒定的先進儀器http://www.expasy.ch

蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，SwissInstituteofBioinformatics.au

蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，AustralianProteomeAnalysisFacilityhttp://expasy.cbr.nrc.ca

蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，CanadianBioinformaticsResours

主要專業(yè)術語及其英文對照和縮寫IPG-IEF：固相pH梯度等電聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色譜（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)研究策略與技術兩條互補的實驗流程基于凝膠的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色譜的工作流程 （LC-basedworkflow）蛋白質組學實驗室所需的條件雙向凝膠電泳（2DE）是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進行SDS（按照分子大?。┠z經染色得到二維分布的蛋白質圖蛋白質組研究的基本技術2D-SDS：樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色（銀染）及圖譜分析目標蛋白獲取及其鑒定（MC分析）2DE結果圖譜蛋白質組研究的基本技術

樣品預分離樣品的制備（預處理）：組織細胞細胞器（線粒體、葉綠體、細胞核）蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取重要性：在制備時丟失的蛋白永遠不能在后面實驗中彌補把蛋白質看作具有獨特而奇妙性質的實體原則：使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取步驟：破碎沉淀蛋白去除雜質蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取樣品制備流程

破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機械法（超聲波法、高壓法、機械勻漿法）化學法（去污劑法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、循環(huán)凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法）蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取樣品制備流程

沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關鍵

TCA-丙酮沉淀法

三氯醋酸（TCA）沉淀法–引起降解/修飾

丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–影響IEF醋酸銨沉淀法–步驟繁瑣

2D電泳結果影響因素分析蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取樣品制備流程

去除雜質

關鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除（DNase/Rnase）多糖的清除（超離心、TCA沉淀等）去污劑的清除（丙酮沉淀法等）鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）2D電泳結果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：TCA殘留致使Pr丟失2D電泳結果影響因素分析可能原因：Tris質量不好可能原因：Urea不純蛋白質組研究的基本技術

蛋白提取樣品制備注意事項：蛋白質水解

蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強堿性蛋白質（核糖體）、極端分子量)樣品定量重復性2D-SDS重復性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區(qū)帶從而得知其等電點信息IEF的基本條件step1step2step3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmstep1step2step3totaltotalstep1step2step311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapidIPG-IEF電泳2-DE第二向垂直SDS電泳聚丙烯酰胺凝膠形成網狀結構，具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。SDS與蛋白質形成雪茄狀帶負電荷復合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度僅與分子量有關

從而得知其分子量信息第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對應的分離范圍膠濃度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS電泳步驟：溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED)灌膠電泳Ettan

Dalttwelve電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳Ettan

Daltsix電泳系統(tǒng)2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測染色：

1）考馬斯亮蘭染色法；

2）銀染法；

3）負染法；

4）熒光染色法；

5）放射性同位素標記法等2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測圖像掃描和分析——ImageScannerII2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測全自動斑點切取系統(tǒng)（EttanSpotPicker）

2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測質譜或MALDI-TOFMS質譜分析基本原理是使試樣中各組分電離生成不同荷質比的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器，利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散——離子束中速度較慢的離子通過電場后偏轉大，速度快的偏轉小；在磁場中離子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉，即速度慢的離子依然偏轉大，速度快的偏轉小；當兩個場的偏轉作用彼此補償時，它們的軌道便相交于一點。與此同時，在磁場中還能發(fā)生質量的分離，這樣就使具有同一質荷比而速度不同的離子聚焦在同一點上，不同質荷比的離子聚焦在不同的點上，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測MALDI-TOFMS樣品溶于固定的底物中形成晶體，用激光脈沖使其離子化，離子被加速后通過飛行管時分離，所有離子均可被檢測，常用來測蛋白質、多肽、核酸和多糖等生物大分子2-DE

凝膠蛋白質斑點的檢測通過質譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構成和分子結構等多方面的信息SARS病毒N蛋白整體分子量蛋白質功能研究技術蛋白質功能研究技術酵母雙雜交蛋白質功能研究技術Co-IP技術蛋白質功能研究技術Co-IP&Pulldown蛋白質組在醫(yī)學研究中

的現(xiàn)狀和前景蛋白質組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質組研究直腸癌： Sanchez等對15例結腸癌和13例正常人的結腸上皮進行2-DE。建立了包括882和861個斑點的結腸癌及正常人結腸粘膜的標準膠圖。結果發(fā)現(xiàn)在分子量為13kD和pI值為5.6處的蛋白質僅出現(xiàn)在結腸癌的組織中。經鑒定為：鈣粒蛋白B（calgranulinB）及鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）

蛋白質組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質組研究肝癌

醛糖還原酶膀胱癌醛糖還原酶、Trp-tRNA合成酶、