鮮壁虎的高效液相色譜指紋圖譜

鮮壁虎的高效液相色譜指紋圖譜【摘要】目的建立鮮壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，討論不同壁虎間的相似程度。方法采用高效液相色譜法分析鮮壁虎提取液中相關(guān)物質(zhì)的保存時(shí)間和吸收強(qiáng)度，對(duì)6種壁虎樣品共有峰峰面積進(jìn)展聚類。結(jié)果選定的色譜條件給出了較好的保存時(shí)間分布和吸收強(qiáng)度，建立起鮮壁虎的HPL指紋圖譜，聚類分析給出了相應(yīng)結(jié)果。結(jié)論該HPL指紋圖譜可用于鑒定鮮壁虎，壁虎所含化學(xué)成分的多寡等因素與其品種相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】鮮無(wú)蹼壁虎指紋圖譜高效液相色譜法聚類分析Abstrat：bjetiveTestablishanHPLfingerprintffreshGekk,andtdisussthesiilarityangGekks.ethdsTheretentintieandabsrptinintensityfextratsfGekkeredeterinedbyHPL,peakareafsixkindsfGekksaples’utualpeaksereappliedtgradebyHierarhiallusterAnalysis.ResultsBetterdistributinfretentintieandabsrptinintensityereshnunderthegivenhratgraphinditin,theHPLfingerprintasestablishedandtheresultfHierarhiallusterAnalysisasgt.nlusinThefreshGekkanbeidentifiedeffetivelyandtheheialnstituentsfdifferentGekkarerelatedtthekinds.Keyrds：FreshGekk;Fingerprint;HPL;HierarhiallusterAnalysis壁虎〔Gekk〕屬隸爬行綱有磷目蜥蜴亞目。我國(guó)現(xiàn)知有壁虎屬動(dòng)物11種［1］。其性味咸、寒，有小毒，可以祛風(fēng)、定驚、散結(jié)、解毒，治中風(fēng)癱瘓、歷節(jié)風(fēng)痛、風(fēng)痰驚癇、瘰疬、惡瘡、破傷風(fēng)、癰瘡、胃嗝氣等癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為壁虎對(duì)腫瘤、結(jié)核等疾病有確切療效［2～5］。近年來(lái)對(duì)壁虎抗腫瘤作用的根底研究也有所報(bào)道［6，7］。筆者應(yīng)用“壁虎散〞治療肺癌等腫瘤療效顯著，且副作用很小，是潛在的可開(kāi)發(fā)利用的抗腫瘤中藥品種。由于壁虎種類較多，它們體內(nèi)所含的有效藥物成分的種類及含量的多寡均會(huì)有所不同。為保證研究中所用壁虎的種屬純粹，建立壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，用于對(duì)壁虎的鑒定具有重要的意義。1儀器與材料1.1儀器與試劑黃金系列通用Ⅰ型高效液相色譜儀〔126型泵，166型紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，GLD軟件；美國(guó)BEHAN公司〕；DS-1高速組織搗碎機(jī)〔上海標(biāo)本模型廠〕。色譜純乙腈〔美國(guó)Tedia公司〕，分析純95%乙醇。1.2藥材實(shí)驗(yàn)所用壁虎的物種及來(lái)源見(jiàn)表1。壁虎均于9月從產(chǎn)地購(gòu)置，并經(jīng)當(dāng)?shù)厮帣z所鑒定。表16種壁虎的種類及來(lái)源〔略〕2方法和結(jié)果2.1色譜條件層析柱：購(gòu)自大連江申別離科學(xué)技術(shù)公司〔瑞士Spherigel18填料〕，4.6×250，5μ粒度。流動(dòng)相：A，亞沸水；B，乙腈。梯度洗脫：0～5in，100%A，流速0.7l/in；5～6in流速由0.7l/in升至1l/in；6～16in，0～10%B；16～21in，10～40%B；21～31in，40～60%B；31～46in，60～100%B；46～60in，100%B。進(jìn)樣量10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)205n；室溫。2.2供試品的制備購(gòu)置秋季捕捉的活壁虎，隨機(jī)選取14～15只〔約50g〕，在容器內(nèi)放置72h，以消化、排空壁虎體內(nèi)的食物，蒸餾水清洗晾干后準(zhǔn)確稱重，置入95％酒精致死，用搗碎機(jī)粉碎勻漿〔轉(zhuǎn)速：10000/in〕，50l95％酒精分兩次涮洗搗碎機(jī)，合并涮洗液以浸泡勻漿后的壁虎，不時(shí)搖動(dòng)，浸泡24h后抽濾；濾渣用50l95％酒精再次浸泡提取，抽濾；合并兩次的提取液，定容于100l；置-2℃冰箱內(nèi)保存；使用時(shí)，取一定量的樣品液經(jīng)0.45μ微孔濾膜過(guò)濾；當(dāng)其溫度轉(zhuǎn)變?yōu)槭覝睾?，?0μl進(jìn)樣分析。濰坊干壁虎的處理：將捕捉到的濰坊活壁虎按常規(guī)方法制成干品；取15只干壁虎，用100l95％酒精浸泡1d〔軟化〕，用搗碎機(jī)粉碎勻漿〔轉(zhuǎn)速：10000r·in-1〕，用原酒精液繼續(xù)浸泡2d，提取，抽濾；濾液經(jīng)0.45μ微孔濾膜過(guò)濾，以10μl進(jìn)樣分析。2.3方法學(xué)考察2.3.1檢測(cè)波長(zhǎng)確實(shí)定由于業(yè)界對(duì)壁虎所含的有效藥物成分尚無(wú)系統(tǒng)的研究和分析，其有效藥物成分組成和構(gòu)造尚不得而知，為了使壁虎乙醇提取液中所含有的物質(zhì)能在紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)下被最大限度地檢出，宜選擇短波長(zhǎng)進(jìn)展檢測(cè)。在選用205，210，215，220n進(jìn)展色譜分析后，比照所得色譜圖發(fā)現(xiàn)：除色譜吸收的強(qiáng)度隨波長(zhǎng)增大而依次降低外，吸收峰的數(shù)量多寡無(wú)明顯改變，據(jù)此而確定205n為色譜參數(shù)，用于色譜檢測(cè)。2.3.2流動(dòng)相及柱溫確實(shí)定實(shí)驗(yàn)說(shuō)明使用空調(diào)控制室溫，在22～26℃的溫度條件下，色譜峰的保存時(shí)間沒(méi)有明顯的變化，經(jīng)5次在該溫度范圍內(nèi)的測(cè)試，結(jié)果顯示色譜峰的保存時(shí)間、峰高、峰面積數(shù)據(jù)的RSD均小于1.2%，在室溫條件下的測(cè)試結(jié)果是可靠的。經(jīng)采用不同的流動(dòng)相梯度洗脫，方法中所述的梯度是最正確方案，尤其是方法開(kāi)場(chǎng)的最初5in以0.7l/in的流速進(jìn)展洗脫可使保存時(shí)間較短〔3～8in〕的物質(zhì)得到較好的別離，滿足測(cè)試的需要。2.3.3穩(wěn)定性考察取鮮無(wú)蹼壁虎的乙醇溶液測(cè)試品分別在0，6，12，24，36，48h不同時(shí)間進(jìn)展測(cè)試，考察色譜峰保存時(shí)間與吸收強(qiáng)度的一致性，如圖1中所標(biāo)示的各指紋峰的保存時(shí)間與吸收強(qiáng)度的RSD均小于1.1%。2.3.4儀器精細(xì)度實(shí)驗(yàn)在空調(diào)的設(shè)定溫度為24℃時(shí)，取測(cè)試品連續(xù)五次進(jìn)樣，圖1中各指紋峰的保存時(shí)間、峰高及峰面積的RSD均小于0.6%。2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取壁虎分4次制作供試品，分別進(jìn)樣。結(jié)果顯示各指紋峰的保存時(shí)間、峰高及峰面積的RSD均小于1.6%。2.4色譜圖中選作指紋峰的保存時(shí)間區(qū)間范圍確實(shí)定2.4.1壁虎95％酒精提取液的后續(xù)處理采用濰坊壁虎作抗腫瘤藥用效果研究，勻漿后的壁虎用95％酒精連續(xù)浸泡提取5次，抽濾后，合并5次提取的抽濾液，在30℃下減壓蒸餾濃縮，除去其中的乙醇，獲得帶黃色固體沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍體積的蒸餾水后，水液經(jīng)正己烷和二氯甲烷分別各萃取4次，得黃色水溶液。水溶液在30℃下減壓蒸餾濃縮，凍干，得棕色浸膏狀物。浸膏狀物用95％酒精溶解，作硅膠柱層析，得各層析后樣品。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4.2各水溶性樣品的抗腫瘤效果用各樣品以TT法對(duì)HepG2和T-26腫瘤細(xì)胞作體外抑瘤率實(shí)驗(yàn)。其中棕色浸膏狀物濃度為5g/l時(shí)，抑瘤率最高可達(dá)37%，硅膠柱層析得到的4#樣品，濃度為1g/l時(shí)，抑瘤率最高可達(dá)49%，棕色浸膏狀物對(duì)小鼠作體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，通過(guò)腫瘤實(shí)體稱重比照，抑瘤率可達(dá)63%。體內(nèi)、外抑瘤實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明壁虎含活性較高的抗腫瘤有效藥物成分。2.4.3確定指紋峰的保存時(shí)間區(qū)間范圍通過(guò)上述各水溶性樣品進(jìn)展一樣色譜條件下的色譜分析，發(fā)現(xiàn)各色譜圖中的吸收峰的保存時(shí)間均在20in以內(nèi)，考慮到抗腫瘤有效成分是水溶性的〔謝爽、王學(xué)美的研究也有同樣的結(jié)論［6，7］〕，故將保存時(shí)間在20in以內(nèi)作為選取指紋峰的時(shí)間界限。2.5聚類分析為進(jìn)展各種壁虎所含抗腫瘤成分的比擬，對(duì)各壁虎色譜數(shù)據(jù)進(jìn)展了聚類分析。聚類分析使用各壁虎保存時(shí)間在20in以內(nèi)共有的12個(gè)吸收峰，以每個(gè)壁虎的12個(gè)吸收峰的總面積除各吸收峰的峰面積，得到如表2所示的各吸收峰的相對(duì)峰面積，以此進(jìn)展聚類分析。聚類分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用離差平方和法〔ard’sethd〕及歐氏間隔〔Eulideandistane〕。表2各壁虎共有吸收峰的相對(duì)峰面積〔略〕2.6結(jié)果測(cè)試所得各壁虎的HPL色譜圖，其中濰坊壁虎的色譜圖如圖1所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濰坊壁虎干品的色譜圖〔圖2〕與鮮品的有很大的差異，故鮮品的指紋圖譜不適用于干品。以各鮮壁虎色譜圖中保存時(shí)間作標(biāo)記的各吸收峰為指紋峰。取其中吸收強(qiáng)度最大的〔保存時(shí)間分別為5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250〕吸收峰為參考峰，確定其它指紋峰的相對(duì)保存時(shí)間和相對(duì)峰高，以歸一化法〔RAi=Ai/ΣAi〕確定各指紋峰的相對(duì)峰面積。由色譜中各指紋峰的相對(duì)保存時(shí)間、相對(duì)峰高及相對(duì)峰面積〔RA〕，即可構(gòu)建起樣品的HPL指紋圖譜。各鮮壁虎色譜圖中吸收峰的保存時(shí)間見(jiàn)表3。表3各壁虎HPL指紋峰的保存時(shí)間〔略〕聚類分析所得的樹(shù)狀關(guān)系圖見(jiàn)圖3。3討論壁虎和乙醇的選擇:為盡可能全面地研究分析壁虎體內(nèi)所含物質(zhì)的抗腫瘤活性，需要盡可能多地將壁虎所含物質(zhì)提取出來(lái)。選用乙醇是考慮到乙醇與水的互溶性，選擇鮮壁虎是因?yàn)轷r壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎勻漿物時(shí)，壁虎體內(nèi)所含的水溶性好的物質(zhì)可借助于壁虎體液與乙醇的互溶而被提取出來(lái)，當(dāng)抽濾別離后，濾渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡濾渣時(shí)，可保證其中脂溶性良好的物質(zhì)也被提取出來(lái)。假設(shè)對(duì)壁虎干品進(jìn)展同樣的處理，那么干壁虎所含有的水溶性物質(zhì)就不可能被很好地提取出來(lái)。從干、鮮壁虎的色譜圖中可以看到，在梯度洗脫的前半段時(shí)間，干壁虎的吸收峰數(shù)少、吸收強(qiáng)度低，而在后半段時(shí)間內(nèi)，干、鮮壁虎的吸收峰數(shù)根本相等，但干壁虎的吸收強(qiáng)度要顯著大于鮮壁虎的。關(guān)于壁虎的HPL色譜圖：鮮壁虎的乙醇提取液中所含物質(zhì)種類繁多，在某一特定色譜條件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的別離，盡管在樣品洗脫的初始階段〔前20in〕吸收峰的別離狀況不甚理想，峰的重疊相對(duì)較為嚴(yán)重；但色譜數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性良好，可以滿足作為指紋圖譜的需要。關(guān)于相似度分析：僅從各壁虎在20in以內(nèi)的吸收峰的保存時(shí)間就可發(fā)現(xiàn)，在各吸收峰的保存時(shí)間序列中，各種壁虎均有峰的缺失。按時(shí)間序列，吸收峰的總數(shù)有20個(gè)，但六種壁虎的共有峰只有12個(gè)；因此從圖譜的直觀上就可以區(qū)分出不同的壁虎。為不同壁虎的鑒定提供了根據(jù)。聚類分析的結(jié)果說(shuō)明6種壁虎中，G.S和G.A最為相似，相似度可達(dá)98.61%，當(dāng)聚為五類時(shí)，兩者為一類，其他壁虎各自為一類；當(dāng)聚為四類時(shí)，G.S和G.A為一類，G.H和G.J為第二類，G.Su和G.T各自為一類；當(dāng)聚為兩類時(shí)，G.S、G.A、G.T和G.Su為一類，而G.H和G.J為另一類。盡管在目前這12個(gè)共有峰尚未歸屬為某個(gè)確定的化合物，但隨著研究的深化，各吸收峰的化合物名稱及分子構(gòu)造將一一確定；聚類分析將提供壁虎間互相替代的思路。尚需解決的問(wèn)題：擬通過(guò)后續(xù)的進(jìn)一步別離純化，以獲得抗腫瘤活性成分的純品及其抗腫瘤效果，并解決指紋圖譜中各吸收峰的歸屬問(wèn)題。本文所介紹的壁虎HPL指紋圖譜可用于壁虎的鑒定，聚類分析的結(jié)果給出了不同壁虎間的相似程度?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】［1］杜世章，陳立僑，劉定震.中國(guó)壁虎屬Gekk動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展［J］.四川動(dòng)物，2002，21〔3〕：200［2］金漢明.壁虎臨床應(yīng)用治驗(yàn)3那么［J］.山西中醫(yī)，2022，19〔2〕：40.［3］魏西云.壁虎治療肝轉(zhuǎn)移癌一例［J］.實(shí)用醫(yī)技，2000，7〔8〕：