親和層析技術(shù)在生物科學(xué)中的應(yīng)用課件

親和層析技術(shù)在生物科學(xué)中的應(yīng)用

摘要

Abstract

最近幾十年來．親和層析技術(shù)發(fā)展十分迅速，廣泛應(yīng)用于生物分子(如結(jié)合蛋白、酶、抑制荊、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等)及組織(如細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等)的分離和純化，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要的技術(shù)之一．介紹了親和層析的基本類型及配體舍成的研究進(jìn)展，概述了親和層析技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)以及在其他方面的應(yīng)用和發(fā)展動態(tài)。Thedevelopmentofaffinitychromatographytechniqueisveryfastinrecentyears，remarkableaccomplishmentshavebeenachievedintheseparationandpurificationofbiomoleculesandorganismsaswellasinstudyingtheinteractionsbetweenbiomolecules．Thecommonlyuseddifferentligandtypesandrecentprogressinsearchingforligandsaredemonstrated.Theapplicationofaffinitychromatographyinproteomicsandinotherareasareoutlined.關(guān)鍵字：親和層析；蛋白質(zhì)；純化；鑒定

Keywords：Affinitychromatography;protein;cellulose;purification;identify

引言

親和層析(affinitychromatography)是利用偶聯(lián)親和配體的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物。它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要一步處理即可使某待分離的生物大分子從復(fù)雜的混合物中分離出來，達(dá)到千倍以上的純化，并保持較高的活性，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。近幾十年來，親和層析技術(shù)發(fā)展十分迅速，并在生物技術(shù)產(chǎn)品、生物分子及組織的分離和純化領(lǐng)域取得令人矚目的成就．現(xiàn)已廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)、肽、酶及其底物和抑制劑、抗體及抗原、核酸及其特異性作用物、激素及受體、細(xì)胞及細(xì)胞表面物等等基于此，本文針對親和層析的基本類型，配體的選擇和親和層析在生物學(xué)特別是蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用等方面作一介紹。1常規(guī)材親和層析的類型

1.1材生物親和層析(BAFC)生物親和層析是利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對的親和層析．通常具有高的選擇性，典型的物質(zhì)對有酶．底物、酶．抑制劑、激素．受體等．1.2免疫親和層析(IAFC)

許多典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，稱免疫親和層析．免疫親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛．許多親和層析純化蛋白質(zhì)過程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體．1.3金屬螯合親和層析(IMAC)

金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)．目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基。

1.4擬生物親和層析(BiomimeticAFC)

擬生物親和層析是利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位．以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質(zhì)的親和層析。

親和層析是一種非常有效的大規(guī)模純化生物技術(shù)產(chǎn)品的分級分離技術(shù)并已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和其他領(lǐng)域的研究．

盡管其具有很大潛力，但針對每個(gè)目標(biāo)是否能得到適當(dāng)?shù)呐潴w，親和層析方法的利用是受到限制的．近年來發(fā)展的利用分子模型對配體進(jìn)行設(shè)計(jì)和組合化學(xué)相結(jié)合以經(jīng)成為一種為特定生物技術(shù)需求產(chǎn)生新穎而特異性強(qiáng)的配體的創(chuàng)新方法。2結(jié)親和層析配體的設(shè)計(jì)及應(yīng)用組合方法篩選配體

2.1親和層析配體的設(shè)計(jì)

依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)配體要考慮兩個(gè)重要因素：第一正確地預(yù)計(jì)被設(shè)計(jì)的配體構(gòu)像的能力；第二，正確預(yù)計(jì)配體的親和力的能力．

1)符合一定要求的分子的形狀．例如，線形帶負(fù)電荷的分子肝磷脂對于純化DNA—結(jié)合酶是一種常規(guī)方法¨，另外純化核苷酸結(jié)合酶的配體三嗪染料CibacronBlue3GAt具備能與一些酶的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)形成合適的相互作用所需的幾何結(jié)構(gòu)以及離子和疏水性的基團(tuán)．2)配體具特異功能團(tuán)．例如苯甲脒作為胰蛋白酶類蛋白酶的配體，羥氨基酸作為與金屬結(jié)合的蛋白的配體．3)兩個(gè)或數(shù)個(gè)已知的底物、抑制劑、效應(yīng)體或輔助因子這樣的結(jié)構(gòu)模體的結(jié)合體衍生的結(jié)構(gòu)模型。例如酮—羧基仿生物嵌合染料—配體被設(shè)計(jì)作為純化識別(酮)羧基的酶的配體.2.2組合方法篩選配體

應(yīng)用組合化學(xué)的方法建立多肽文庫，然后利用多肽文庫來篩選與目的蛋白特異性結(jié)合的多肽配基．這一觀點(diǎn)的提出大大促進(jìn)了親和層析篩選及合成配基技術(shù)的發(fā)展．過去的十幾年中已出現(xiàn)了允許產(chǎn)生多達(dá)1O種不同的蛋白，肽鏈或核酸文庫的方法．這樣的大文庫使選擇高親和性和特異性的分子成為可能．

2.3出頭設(shè)計(jì)配體

由于能將X射線晶體學(xué)，NMR或同源結(jié)構(gòu)的知識與限定的或組合化學(xué)合成以及先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，合理設(shè)計(jì)親和配體變得更切實(shí)可行，有效，符合邏輯且更快．這種方法依賴于利用目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)信息有目的地集中引導(dǎo)配體的合成并使合成的努力限定朝向已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)評價(jià)能結(jié)合到被檢測目標(biāo)或預(yù)計(jì)能結(jié)合到目標(biāo)的方向，該方法包括以下的步驟：

選擇目標(biāo)蛋白上合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與該位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)相配伍的配體，合成一個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)的固相的組合配體文庫，并針對目標(biāo)蛋白掃描這個(gè)文庫針對IgG的非肽仿生物配體已經(jīng)建立，它是依據(jù)蛋白A的B結(jié)構(gòu)域和IgG的Fc片段組成的復(fù)合物的x射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)獲得的．利用計(jì)算機(jī)協(xié)助的分子模型，一系列圍繞蛋白A雙肽Phel32-Tyrl33的仿生物分子被設(shè)計(jì)出．其中一個(gè)這樣的配體能與人類IgG結(jié)合，該配體在三嗪環(huán)上帶有3-氨基苯酚和4氨基—1—萘酚部分．當(dāng)這個(gè)仿生物配體被固定到瓊脂糖上被成功地用于純化人類血漿的IgG．為重組胰島索前體MI3以及重組人類凝固因子VIIa等而設(shè)計(jì)的仿生物學(xué)配體的類似方法也已建立．3結(jié)親和層析的應(yīng)用

3.1親和層析在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是用于分離蛋白的雙相電泳(2-DE)和用于鑒定被分離蛋白的質(zhì)譜(MS)技術(shù)．然而親和層析也是起很大作用的分離方法．蛋白被2-DE分離前親和層析主要被用作選擇性地預(yù)先濃縮和預(yù)處理樣品．其應(yīng)用包括去除一種或一類會干擾2-DE的分辨率的蛋白，一個(gè)典型的例子是血清及腦脊髓液樣品的白蛋白和免疫球蛋白IgG的去除，是通過吸附在親和樹脂上的方法進(jìn)行的，這樣可顯著提高2-DE膠上蛋白斑點(diǎn)的分辨率．另外，親和層析可濃縮低豐度的蛋白，這樣它們就可在2-DE膠上被看到；還可將所有蛋白分類成兩組或幾組以便進(jìn)一步分析。3.2分離純化目的蛋白、定量測定

近年來，高速發(fā)展的生物制藥工業(yè)已廣泛應(yīng)用親和層析技術(shù)作為其重要的分離純化和定量測定用于臨床藥物的工具．親和層析最常用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化上．特別在融合蛋白的分離純化上，親和層析更是起到舉足輕重的作用，因?yàn)槿诤系鞍拙哂刑禺愋越Y(jié)合能力．親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，其中，以對分別帶有(His)和GST親和標(biāo)記的融合蛋白的抗原Ni-NAT和GST親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛．金屬螯和層析與免疫親和層析也得到一定的應(yīng)用．3.3生物分子間相互作用的鑒定

親和層析也被用來研究生物系統(tǒng)中生物分子間發(fā)生的相互作用,該領(lǐng)域已被用來檢驗(yàn)各種生物系統(tǒng),包括凝集素lectin／糖,酶／抑制劑,蛋白／蛋白,以及DNA／蛋白間的相互作用,臨床上主要將該技術(shù)用于研究藥或激素與血清蛋白間的結(jié)合,兩種層析方法可用來研究生物間相互作用.

3.4親和層析與其他分析技術(shù)相結(jié)合近年來的另一發(fā)展趨勢是尋求更加優(yōu)化的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和安排形式，從而獲得快速、優(yōu)良的選擇性以及很大數(shù)量被檢測的樣品．親和層析與其他分析技術(shù)串聯(lián)結(jié)合即可很好地達(dá)到這一目的．目前已經(jīng)有很多成功運(yùn)用親和層析(AFC)．MS、AFC，HPLC、AFC．HPLC．MS、AFC．CE(毛細(xì)管電泳)等串聯(lián)結(jié)合的應(yīng)用．這種結(jié)合因其不可替代的優(yōu)點(diǎn)，仍將繼續(xù)發(fā)展.4結(jié)論

在發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)治療疾病的蛋白方面的挑戰(zhàn)已經(jīng)使人們有必要重新考慮設(shè)計(jì)和進(jìn)行純化的過程，這種選擇主要是由方法的引進(jìn)速度,有效性,穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)承受能力決定的.傳統(tǒng)的純化規(guī)程正被高度選擇