脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件

Candidarugosalipase的表現(xiàn)及特性分析

PDBID:1CRL林柏宏11月26日Candidarugosalipase的表現(xiàn)及特性分析

1IntroductionCandidarugosa所產(chǎn)生的五種菌體外脂肪酶(LIP-1~LIP-5)，皆為534個(gè)胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質(zhì)特異性，由此可知CRL的序列與結(jié)構(gòu)及基質(zhì)特異性的相關(guān)性可能是非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹ntroductionCandidarugosa所產(chǎn)生的2脂肪酶的生化特性A、催化之反應(yīng)酯解反應(yīng)(EsterHydrolysis)酯化反應(yīng)(EsterSynthesis)內(nèi)酯化作用(Intererterification)B、水解催化的特異性非特異性脂肪酶(non-specificlipase)1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specificlipase)2-特異性脂肪酶(2-specificlipase)醯基特異性脂肪酶(Acylgroupspecificlipasereaction)C、催化機(jī)制醯化反應(yīng)(acylation)去醯化反應(yīng)(deacylation)脂肪酶的生化特性A、催化之反應(yīng)3脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性

α/β水解酵素摺疊構(gòu)形(α/βhydrolasefolding)催化三元體(catalytictriad)為S209，H449，E341含氧陰離子洞(Oxyanionhole)為G124，A210頂蓋(Liddomain)位置62~92AA脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性α/β水解酵素摺疊構(gòu)形(α/βhydro41CRLα-helix(red)andβ-sheet(yellow)1CRLα-helix(red)5Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元體(purple)Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元6(A)Closed(inactive)form，黑色部分為胺基酸的位置62~92所形成的頂蓋(Liddomain)。

(B)Open(active)form，黑色部分為胺基酸的位置62~92所形成的頂蓋(Liddomain)。(A)(B)(A)Closed(inactive)form，黑色部分7Wecananalyze可以改變liddomain對(duì)受質(zhì)的特異性以及活性有顯著的影響。將LIP的tunel部分的胺基酸突變後，以不同的triacylglycerides來(lái)觀測(cè)基質(zhì)特異性的差異。LIP的序列以基因重組的方法，產(chǎn)生新式脂肪酶跟原本比較之間的差異，看看是否能提高熱穩(wěn)定性和活性。各個(gè)脂肪酶胺基酸序列相同度的比較。Wecananalyze可以改變liddomain對(duì)受8脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件9脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件10脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件11相似的程度相似的程度12脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件13LidLid14結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)脂肪中的頂蓋部位(liddomain)胺基酸序列差異頗大，因此以L(fǎng)IP4(19)/lid1，lid2，lid3與lid5分別轉(zhuǎn)型入P.pastoris系統(tǒng)，並將得到的脂肪進(jìn)行酵素動(dòng)力學(xué)以及活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變lid部位對(duì)脂肪的受質(zhì)特異性以及活性都有顯著的影響。如在置換為lid2時(shí)，對(duì)triolein的活性可增至wildtype的5倍，而置換為lid5時(shí)，則為wildtype的2倍。但在lid1及l(fā)id3中則無(wú)明顯增加。同時(shí)在esterase活性中，只有l(wèi)id2的活性提升，lid1，lid3及l(fā)id5的活性皆下降，由此證明lid部位對(duì)C.rugosa脂肪的功能，具有顯著的影響。結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)脂肪中的頂蓋部位(liddomain)胺基酸序15脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件16脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件17Lip1的LidLip1的Lid18CRL的Lid兩種結(jié)構(gòu)~open為紫色closed為藍(lán)色CRL的Lid兩種結(jié)構(gòu)~open為紫色closed為藍(lán)色19有於Liddomain有hydrophobicmoment而又以L(fǎng)IP4最高，所以L(fǎng)id在LIP的interfacialactivation過(guò)程扮演重要角色所以置換不同的Lid會(huì)呈現(xiàn)不同的物理性質(zhì)，如蛋白質(zhì)的表面的淨(jìng)電荷和疏水性從模擬結(jié)構(gòu)中可以看到活化能高低以及鄰近區(qū)的靜電力作用力，會(huì)決定該LIP的活化速率有於Liddomain有hydrophobicmomen20可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的Asp292形成氫鍵及靜電力。此作用使Lid維持打開(kāi)的狀態(tài)，進(jìn)而穩(wěn)定open的結(jié)構(gòu)可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的Asp21而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。所以酵素動(dòng)力學(xué)特性跟Lip4相近。而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。22以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形與Lid4不同?？梢钥吹絃ys75與Asp292的靜電引力受到Glu71的干擾，因此呈現(xiàn)較差的催化的效率。以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形23脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件24脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件25以上的電腦分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了幾各與LIP活化過(guò)程相關(guān)的重要胺基酸。所以可以提供以後做site-directedmutagenesis的實(shí)驗(yàn)，可以進(jìn)ㄧ步了解LIP的結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)係。以上的電腦分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了幾各與LIP活化過(guò)程相關(guān)的重要胺26Candidarugosalipase的表現(xiàn)及特性分析

PDBID:1CRL林柏宏11月26日Candidarugosalipase的表現(xiàn)及特性分析

27IntroductionCandidarugosa所產(chǎn)生的五種菌體外脂肪酶(LIP-1~LIP-5)，皆為534個(gè)胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質(zhì)特異性，由此可知CRL的序列與結(jié)構(gòu)及基質(zhì)特異性的相關(guān)性可能是非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹ntroductionCandidarugosa所產(chǎn)生的28脂肪酶的生化特性A、催化之反應(yīng)酯解反應(yīng)(EsterHydrolysis)酯化反應(yīng)(EsterSynthesis)內(nèi)酯化作用(Intererterification)B、水解催化的特異性非特異性脂肪酶(non-specificlipase)1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specificlipase)2-特異性脂肪酶(2-specificlipase)醯基特異性脂肪酶(Acylgroupspecificlipasereaction)C、催化機(jī)制醯化反應(yīng)(acylation)去醯化反應(yīng)(deacylation)脂肪酶的生化特性A、催化之反應(yīng)29脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性

α/β水解酵素摺疊構(gòu)形(α/βhydrolasefolding)催化三元體(catalytictriad)為S209，H449，E341含氧陰離子洞(Oxyanionhole)為G124，A210頂蓋(Liddomain)位置62~92AA脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性α/β水解酵素摺疊構(gòu)形(α/βhydro301CRLα-helix(red)andβ-sheet(yellow)1CRLα-helix(red)31Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元體(purple)Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元32(A)Closed(inactive)form，黑色部分為胺基酸的位置62~92所形成的頂蓋(Liddomain)。

(B)Open(active)form，黑色部分為胺基酸的位置62~92所形成的頂蓋(Liddomain)。(A)(B)(A)Closed(inactive)form，黑色部分33Wecananalyze可以改變liddomain對(duì)受質(zhì)的特異性以及活性有顯著的影響。將LIP的tunel部分的胺基酸突變後，以不同的triacylglycerides來(lái)觀測(cè)基質(zhì)特異性的差異。LIP的序列以基因重組的方法，產(chǎn)生新式脂肪酶跟原本比較之間的差異，看看是否能提高熱穩(wěn)定性和活性。各個(gè)脂肪酶胺基酸序列相同度的比較。Wecananalyze可以改變liddomain對(duì)受34脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件35脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件36脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件37相似的程度相似的程度38脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件39LidLid40結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)脂肪中的頂蓋部位(liddomain)胺基酸序列差異頗大，因此以L(fǎng)IP4(19)/lid1，lid2，lid3與lid5分別轉(zhuǎn)型入P.pastoris系統(tǒng)，並將得到的脂肪進(jìn)行酵素動(dòng)力學(xué)以及活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變lid部位對(duì)脂肪的受質(zhì)特異性以及活性都有顯著的影響。如在置換為lid2時(shí)，對(duì)triolein的活性可增至wildtype的5倍，而置換為lid5時(shí)，則為wildtype的2倍。但在lid1及l(fā)id3中則無(wú)明顯增加。同時(shí)在esterase活性中，只有l(wèi)id2的活性提升，lid1，lid3及l(fā)id5的活性皆下降，由此證明lid部位對(duì)C.rugosa脂肪的功能，具有顯著的影響。結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)脂肪中的頂蓋部位(liddomain)胺基酸序41脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件42脂肪酶的結(jié)構(gòu)特性課件43Lip1的LidLip1的Lid44CRL的Lid兩種結(jié)構(gòu)~open為紫色closed為藍(lán)色CRL的Lid兩種結(jié)構(gòu)~open為紫色closed為藍(lán)色45有於Liddomain有hydrophobicmoment而又以L(fǎng)IP4最高，所以L(fǎng)id在LIP的interfacialactivation過(guò)程扮演重要角色所以置換不同的Lid會(huì)呈現(xiàn)不同的物理性質(zhì)，如蛋白質(zhì)的表面的淨(jìng)電荷和疏水性從模擬結(jié)構(gòu)中可以看到活化能高低以及鄰近區(qū)的靜電力作用力，會(huì)決定該LIP的活化速率有於Liddomain有hydrophobicmomen46可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的Asp292形成氫鍵及靜電力。此作用使Lid維持打開(kāi)的狀態(tài)，進(jìn)而穩(wěn)定open的結(jié)構(gòu)可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的Asp47而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。所以酵素動(dòng)力學(xué)特性跟Lip4相近。而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。48以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形與