實(shí)驗(yàn)二、培養(yǎng)基的配制、消毒與滅菌課件

實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的制備

消毒與滅菌

培養(yǎng)基配制實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。培養(yǎng)基配制要素營養(yǎng)：碳源、氮源、能源、生長因子、水分和無機(jī)鹽；適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力；一定的氧化還原電位；合適的滲透壓。按照培養(yǎng)基的成分來分天然培養(yǎng)基:主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)合成培養(yǎng)基:用化學(xué)成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基:以天然有機(jī)物作為微生物營養(yǎng)來源的同時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充一些成分已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)固體培養(yǎng)基：加入凝固劑，如1.5%~2.0%瓊脂半固體培養(yǎng)基：加入少量凝固劑，如0.2%~0.7%瓊脂液體培養(yǎng)基：不含任何凝固劑按照培養(yǎng)基的用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）鑒別培養(yǎng)基：含有特定化合物或試劑。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將某種微生物與他種微生物區(qū)別開來。選擇培養(yǎng)基：利用微生物對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長，而利用所需分離的微生物生長，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物的目的。培養(yǎng)基滅菌配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物微生物生長繁殖：

消耗養(yǎng)分改變培養(yǎng)的酸堿度產(chǎn)生毒素或者抑制物馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）的制備

用來培養(yǎng)真菌馬鈴薯：200g蔗糖（葡萄糖）

20g瓊脂：15-20g水：1000mLpH：自然馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過濾；濾液中加入糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000mL。無氮培養(yǎng)基的制備

用來培養(yǎng)固氮菌葡萄糖：10gKH2PO4：

0.2gMgSO4·7H2O：0.2gNaCl：0.2gCaSO4·2H2O：0.2gCaCO3：

5g瓊脂：20g水：1000mLpH：7.0~7.2麥?zhǔn)希∕eclary）培養(yǎng)基的制備

用來培養(yǎng)酵母菌，利于釀酒酵母子囊孢子的形成葡萄糖：1gKCl：

1.8g酵母浸膏：

2.5g醋酸鈉：

8.2g瓊脂：

20g水：1000mLpH：

自然LB培養(yǎng)基的制備

用來培養(yǎng)細(xì)菌蛋白胨：10g酵母膏：

5gNaCl：

10g瓊脂：

20g水：1000mLpH：

7.0操作步驟稱量溶化補(bǔ)足水分，調(diào)pH（過濾）分裝6.加塞7.包扎8.滅菌9.擱置斜面10.無菌檢查稱量藥品時(shí)，嚴(yán)防藥品混雜。稱完一種藥品后需要將牛角匙洗凈、擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。藥品不要弄錯(cuò)。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和無水形式的化合物要注意分辨。培養(yǎng)基中多種無機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。因此，在混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時(shí)還需要將二種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。對(duì)于微量成分，可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液，按比例換算后再加入。瓊脂溶化過程中，要控制火力并不斷攪拌，以免沸騰溢出或瓊脂糊底燒焦。不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基。固體分裝：不超過試管高度的1/5；不超過三角燒瓶容積的一半為宜。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。配好培養(yǎng)基后要貼上標(biāo)簽，寫清培養(yǎng)基類型、組別、配制時(shí)間。消毒與滅菌方法加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過濾除菌輻射滅菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌化學(xué)藥品滅菌干熱滅菌干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種。高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。由于水蒸氣無法排出，增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的。一般培養(yǎng)基在0.1MPa下，121℃維持15～30min可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。當(dāng)含鹽類的液體和含鹽的瓊脂中大量的鹽類潑灑在工作腔體，要立即換水，沖洗腔體，仔細(xì)擦干鍋蓋墊圈上的水滴。否則它們會(huì)帶來腐蝕和變質(zhì)。要檢查壓力表上的指數(shù)為“0MPa”后才能打開鍋蓋。外來物質(zhì)（金屬、液體）不能堵塞通風(fēng)孔，否則會(huì)引起裝置故障、起火、短路。過濾除菌過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。紫外線滅菌紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈前，可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右再擱置，以防斜面上冷凝水太多。斜面長度不超過試管總長的一半。將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24－48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。實(shí)驗(yàn)任務(wù)

每組配制700

mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（P241）趁熱將培養(yǎng)基分裝至6把試管（6×7支，不超過管高1/5）；剩余的培養(yǎng)基