香豆素分析課件

楊杰cpusyj@163.com香豆素分析概述香豆素及其衍生物是中藥中的主要成分之一，具有多種生理活性，臨床上用于止咳、利尿、抗菌、抗放射、抗凝血等。香豆素分析舉例定量分析定性分析定義、分布、性質(zhì)香豆素按結(jié)構(gòu)分為簡(jiǎn)單香豆素——只在苯環(huán)上有取代基的呋喃香豆素——

線型（6、7～）；

角型（7、8～）吡喃香豆素——線型（6、7～）；

角型（7、8～）其他香豆素——α－吡喃酮環(huán)上有取代基的（一）簡(jiǎn)單香豆素類基本結(jié)構(gòu)即苯并α-吡喃酮。苯環(huán)上常見羥基、甲氧基、亞甲二氧基和異戊烯基等取代基。傘形花內(nèi)酯七葉內(nèi)酯R=H濱蒿內(nèi)酯七葉苷R=glc（二）呋喃香豆素類基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與呋喃環(huán)稠合，根據(jù)稠合位置可分為線型與角型。1．6,7-呋喃香豆素（線型）C6、C7位與呋喃環(huán)稠合（6位異戊烯基與7位羥基環(huán)合，降解失去三個(gè)碳原子）的衍生物，稱為線型。

補(bǔ)骨脂內(nèi)酯花椒毒內(nèi)酯紫花前胡內(nèi)酯（三）吡喃香豆素類基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與吡喃環(huán)稠合，也分為線型和角型。2．7,8-吡喃香豆素（角型）C7、C8位與吡喃環(huán)稠合（8位異戊烯基與7位羥基環(huán)合）的衍生物。

邪蒿內(nèi)酯

黃曲霉素B1二、分布香豆素類成分廣泛分布于植物界，如傘形科、夾竹桃科、蘿藦科、菊科、十字花科、杜鵑花科、豆科、唇形科、蘭科、禾本科、蕓香科、薔薇科、茄科、無(wú)患子科、瑞香科等植物中均有較多分布。含有香豆素類化合物的常用中藥有白芷、秦皮、獨(dú)活、前胡、阿魏、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、茵陳蒿、川芎、防風(fēng)、蛇床子等。三、理化性質(zhì)通性1與堿的反應(yīng)2顯色反應(yīng)3熒光與紫外吸收4多具芳香氣，能隨水蒸氣揮發(fā)或升華。不溶于水或難溶于水，可溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿或乙醇等溶劑中；一般含氧取代基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解度比較小，冷的情況下更小。在定量測(cè)定時(shí)，多用氯仿和乙醇來(lái)提取。

通性1顯色反應(yīng)3（1）異羥基肟酸鐵反應(yīng)：因香豆素具有內(nèi)酯環(huán)，所以能與異羥基肟酸鐵反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色，可被用來(lái)鑒別和比色測(cè)定，其反應(yīng)如下：（2）酚類試劑反應(yīng)：因該類化合物多具酚羥基，能和常規(guī)酚類試劑反應(yīng)，如三氯化鐵、硝酸銀的氨溶液、三氯化鐵-鐵氰化鉀。如果香豆素化合物的C6位上（即酚羥基的對(duì)位）沒有取代基，則能和Emerson試劑反應(yīng)現(xiàn)橙~紅色；與Gibbs試劑反應(yīng)現(xiàn)藍(lán)色。

Emerson反應(yīng)是將香豆素類化合物溶于堿性溶液中，加入2%4-氨基安替比林溶液數(shù)滴及8%鐵氰化鉀溶液2~3滴即可顯色，其反應(yīng)如下：（2）羥基香豆素在紫外光下有強(qiáng)的熒光，不難辨認(rèn)；呋喃香豆素較弱，但也能在紫外光下顯示藍(lán)、紫、棕、綠、黃等色。必要時(shí)可噴10%KOH醇液，或20%SbCl3氯仿液以顯色。

（3）香豆素類化合物羥基和芳環(huán)形成的共軛體系具較強(qiáng)的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物在不同pH條件下表現(xiàn)不同的光譜特性，對(duì)該類成分的分析具重要意義。定性分析

化學(xué)定性分析：

熒光法

顯色反應(yīng)

色譜定性分析：

薄層色譜法

高效液相法

氣相色譜法第二節(jié)香豆素定性分析2．顏色反應(yīng)（1）蛇床子的鑒別取蛇床子粉末2g，加乙醇20ml，加熱回流30min，濾過(guò)。取濾液數(shù)滴，點(diǎn)于白瓷板上，置紫外光燈（365nm）下觀察，顯藍(lán)紫色熒光；

另取濾液2ml，加等量的3％碳酸鈉溶液，加熱5min，放冷，再加新制的重氮對(duì)硝基苯胺試液1~2滴，即顯櫻紅色。（2）白芷的鑒別取少量樣品粉末，加乙醚，振搖5min后靜置20min，取上清液1ml，加入7%鹽酸羥胺甲醇溶液2~3滴，20%KOH甲醇溶液2~3滴，搖勻，在水溶上微熱，冷卻后加稀鹽酸調(diào)到pH3~4，然后加入1%三氯化鐵乙醇溶液1~2滴，溶液顯紫紅色。

1．應(yīng)用特點(diǎn)薄層色譜法可用于含多類成分的中藥的鑒別，可用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)藥材對(duì)照，再與上述熒光反應(yīng)、顏色反應(yīng)配合，即可方便、快速鑒別含香豆素類化合物的中藥。因香豆素類成分大都具熒光，含香豆素類中藥提取物，在硅膠板上的色譜指紋圖具一定的鑒別意義，可用化學(xué)對(duì)照品對(duì)照；可以使用經(jīng)準(zhǔn)確鑒定學(xué)名的標(biāo)準(zhǔn)藥材做對(duì)照品；薄層色譜法302、應(yīng)用實(shí)例

白芷的薄層定性分析取白芷粉末0.5g，加乙醚10ml，浸泡1h，時(shí)時(shí)振搖，濾過(guò)，濾液揮干乙醚，殘?jiān)哟姿嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。另取歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品，加醋酸乙酯制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30~60℃）-乙醚（3：2）為展開劑，在25℃以下展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。第三節(jié)香豆素定量分析

含香豆素成分的中藥定量測(cè)定方法有比色法、熒光法、極譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。每種方法都有其特點(diǎn)，有的簡(jiǎn)單，有的操作麻煩，有的則需要一定的儀器設(shè)備。相比之下，因該類成分多具有較強(qiáng)的熒光，故可熒光分光光度法進(jìn)行定量分析；薄層掃描法測(cè)其紫外吸收或熒光的方法較簡(jiǎn)便快速，兼有分離功能，應(yīng)用日趨普遍；近年來(lái)又有了分離效率較高的高效液相色譜技術(shù)，對(duì)復(fù)雜的中藥樣品更為合適。32一．熒光分光光度法

香豆素類化合物在紫外光的照射下顯藍(lán)色熒光，可用熒光分光光度法測(cè)定。如

7-羥基香豆素和香豆素混合物的測(cè)定，前者用370nm激發(fā)，在450nm測(cè)定，濃度為1~10μg／ml時(shí)熒光與濃度成線性失系。后者用361nm激發(fā)，在491nm測(cè)熒光。如果香豆素7位上有乙氧基（代謝產(chǎn)物）可使其變?yōu)?-羥基香豆素用390nm激發(fā)，440nm測(cè)定。1、應(yīng)用概況33

2．應(yīng)用實(shí)例

（1）佛手油中的香豆素分析可用硅膠GF254薄層分離，以己烷-醋酸乙酯（3：1）展開，分出4個(gè)熒光點(diǎn)即：檸美內(nèi)酯（Citropten）Ⅰ；5-牻牛兒氧基-7-甲氧基香豆素（5-geranyloxy-7-methydroxycoumarin）Ⅱ；佛手內(nèi)酯Ⅲ和佛手柑亭（bergamottin）Ⅳ，可直接在薄層上進(jìn)行熒光測(cè)定，對(duì)于Ⅰ和Ⅱ用330nm激發(fā)，424nm測(cè)定熒光，Ⅲ和Ⅳ用272nm激發(fā)，520nm測(cè)定。34二．薄層色譜法

1．熒光掃描法測(cè)定蛇床子中蛇床子素含量精密稱取在P2O5干燥器中減壓干燥至恒重的蛇床子粉末1g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20ml，振搖后放置過(guò)夜，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取蛇床子素對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制1mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取上述兩種溶液各1μl，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以苯-乙酸乙酯（30：1）為展開劑，展開，取出，晾干。照薄層色譜法進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)λX365nm，測(cè)量供試品與對(duì)照品熒光強(qiáng)度積分值.本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于1.0％。352．紫外光區(qū)掃描法測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素含量取獨(dú)活粗粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇20ml，超聲處理30min，放冷，濾過(guò)，濾液置25ml量瓶中，用少量乙醇分次洗殘?jiān)?，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取蛇床子素對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取供試品溶液2μl、對(duì)照品溶液1μl與2μl，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（30：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視定位，照薄層色譜法進(jìn)行掃描，λs322nm，λR370nm，測(cè)量供試品吸收度積分值與對(duì)照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于0.30%。三、高效液相色譜法1．白芷中3種香豆素的測(cè)定

測(cè)定氧化前胡素（oxypeucedanin，Ⅰ），歐前胡素（imperatorin，Ⅱ）和異歐前胡素（isoimperatorin，Ⅲ），其方法是：準(zhǔn)確稱?、?、Ⅱ、Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品各5mg，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，分別取此溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，均用乙酸乙酯定容至10m1，制得6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

按下述條件進(jìn)行HPLC分析：以μ-BondapakC18柱為色譜分離柱，加預(yù)柱以防樣品污染分析柱，流動(dòng)相為甲醇-水（70：30），流速1.0ml／min，UV254nm檢測(cè)各組分峰，進(jìn)樣10μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，各成分濃度為橫坐標(biāo)，得3條通過(guò)原點(diǎn)的直線，線性范圍0.005~0.05mg／ml，其回歸方程如下：氧化前胡素Y=1521X+25.40，r=0.999

歐前胡素Y=1953X+76.53，r=1.000

異歐前胡素Y=1930X+53.73，r=0.999

精密稱取白芷粉（40目）2g，置索氏提取器中，用乙醚提取9h，回收乙醚，真空干燥，殘?jiān)苡谝宜嵋阴ゲ⒍ㄈ莩?5ml，經(jīng)Millipore樣品過(guò)濾器過(guò)濾，同上色譜條件測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品分離情況（見圖13-1）較好。39四．其它定量分析方法

（一）比色法（1）該方法基于香豆素類化合物的內(nèi)酯環(huán)官能團(tuán)和苯環(huán)上的羥基的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色來(lái)進(jìn)行比色的方法。如異羥肟酸鐵、4-氨基安替比林或氨基比林、三氯化鐵、三氯化鐵-鐵氰化鉀、磷鉬酸、磷鎢酸。例如短茶素片中巖白菜素的測(cè)定40（2）如果酚羥基的對(duì)位或鄰位未被取代，在堿性溶液中則能和重氮化的對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成紫色或紅色。如佛手內(nèi)酯（bergapten）、傘花內(nèi)酯（umbelliferone）都能和重氮化對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)呈色。41（3）若香豆素衍生物C6位上沒有取代基，則能與Gibbs試劑反應(yīng)生成藍(lán)色。42（二）紫外分光光度法

1．應(yīng)用原理（1）香豆素類衍生物的紫外吸收光譜一般表現(xiàn)為λmin244士4nm（logε3.26~3.54）；λmax275士4nm（logε3.98~4.10）；λmin300士5nm（logε3.52~3.8）；λmax315士8nm（logε3.70~3.95）。（2）如果分子中有羥基存在，特別在C6或C7上，其主要最大吸收峰向紅位移。

（3）呋喃香豆素的吸收峰向紫位移，它的λmax在220~230nm及250nm。（4）pH影響：在堿性溶液中香豆素的最大吸收峰位置較其在中性或酸性溶液中多數(shù)有顯著地向紅位移現(xiàn)象，且吸收系數(shù)也有所增大。例如傘形花內(nèi)酯λmax325nm（logε4.15），但在堿性溶液中，其λmax372nm（logε4.23）。秦皮

秦皮為木犀科植物白蠟樹FraxinuschinensisRoxb.、苦栃白蠟樹F.rhynchophyllaHance、尖葉白蠟樹F.chinensisRoxb.var.acuminataLingelsh.、宿柱白蠟樹F.stylosaUngelsh.等的干燥樹皮或干皮。具清熱燥濕、收澀明目之功效。第四節(jié)舉例4547主含香豆素類成分七葉樹苷（aesculin，秦皮甲素）及其苷元七葉樹內(nèi)酯（aesculetin，秦皮乙素），并含白蠟樹苷（fraxin）、白蠟樹內(nèi)酯（fraxetin）、紫丁香苷（syringin）等。

481．定性分析

取秦皮粉末1g，加乙醇10ml，加熱回流10min，放冷，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取秦皮甲素與秦皮乙素對(duì)照品，加乙醇制成每1ml各含5mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各3μl，分別點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-乙醇-甲酸（3：4：2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。49502．定量分析

（1）薄層-分光光度法對(duì)照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)80℃干燥至恒重的秦皮甲素對(duì)照品20mg，置10ml量瓶中，加乙醇適量，振搖使溶解，必要時(shí)可微溫加熱，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取對(duì)照品溶液30、50、70、90與110μl，照薄層色譜法試驗(yàn)，沿硅膠Ｇ薄層板的起始線分別點(diǎn)成3~5cm的長(zhǎng)條（據(jù)點(diǎn)樣量的多少而定），以正丁醇-氯仿-甲苯-甲酸（8：1：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視定位，分別刮取對(duì)照品條斑置具塞錐形瓶中。同時(shí)刮取同一薄層板下端與條斑等面積的硅膠Ｇ作為空白，置另一具塞錐形瓶中，各瓶均精密加入乙醇10ml，45℃水浴小心加熱30min，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液，照分光光度法，在336nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。52

測(cè)定法：取秦皮粉末約1g，精密稱定，置50ml具塞錐形瓶中，精密加入乙醇10ml，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液50μl，沿硅膠Ｇ薄層板的起始線點(diǎn)成5cm的長(zhǎng)條，另精密吸取對(duì)照品溶液5μl，點(diǎn)于供試品條斑一側(cè)間隔1.5cm處，作為對(duì)照。以正丁醇-氯仿-甲苯-甲酸（8：1：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視，刮取與對(duì)照品色譜中斑點(diǎn)相應(yīng)位置上的供試品色譜中的條斑，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“置具塞錐形瓶中”起，依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中秦皮甲素的重量，計(jì)算，即得。本品含秦皮甲素（C15H16O9）不得少于1.36%。54

補(bǔ)骨脂:為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的果實(shí)。具溫腎助陽(yáng)、納氣、止瀉功效。55主含香豆素類成分補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（psoralen）、異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（isopsoralen）、補(bǔ)骨脂素（psoralidin）、異補(bǔ)骨脂素（isopsoralidin）等；另含