疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義

疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展衛(wèi)生毒理教研室疾病易感性與基因多態(tài)性衛(wèi)生毒理教研室1主要內(nèi)容一、疾病易感性與高危人群二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義

三、基因多態(tài)性的檢測方法

四、關(guān)于基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀五、目前基因多態(tài)性研究中存在的問題及對策六、展望

主要內(nèi)容一、疾病易感性與高危人群二、基因多態(tài)性的概念、生2環(huán)境污染對人類健康的威脅日趨嚴(yán)重環(huán)境污染對人類健康的威脅日趨嚴(yán)重3有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，由于先天的遺傳因素，造成胎兒畸形占10%-15%，環(huán)境因素則占10%-20%，其它為遺傳基因和環(huán)境因素的聯(lián)合作用。目前已發(fā)現(xiàn)具有致畸作用的環(huán)境化學(xué)污染物有甲基汞、四氯二苯、五氯酚鈉和有機(jī)磷殺蟲劑等。有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，由于先天的遺傳因素，造成胎兒畸形占10%-154Disease環(huán)境暴露Exposure

？遺傳因素Disease環(huán)境暴露Exposure？遺傳因素5HumanGenomeProject

人類基因組計(jì)劃（1990-）HumanGenomeProject人類基因組計(jì)劃（16一、易感基因與高危人群人們發(fā)現(xiàn)在同一環(huán)境因素變化條件下，有的人反應(yīng)強(qiáng)烈，出現(xiàn)患病甚至死亡，有的人反應(yīng)不大。例如，同是鋼鐵廠的冶煉工或電焊工，同在一個(gè)車間工作，同樣的作業(yè)環(huán)境，僅有部分人發(fā)生錳中毒。這說明不同個(gè)體對環(huán)境有害因素易感性存在差異。決定某個(gè)體對某種疾病易感性的基因稱為易感基因。對環(huán)境因素?fù)p害敏感的那部分人群稱為高危險(xiǎn)人群，在同一污染環(huán)境中，高危險(xiǎn)人群比正常人出現(xiàn)健康危害早而且程度也嚴(yán)重。在任何居民群體中都有高危險(xiǎn)人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年齡段，不同環(huán)境條件下，都有某一時(shí)間處于高危險(xiǎn)狀態(tài)的可能。一、易感基因與高危人群人們發(fā)現(xiàn)在同一環(huán)境因素7TheBeginning“Wehavejuststartedtherealjourneytowardsfullyunderstandingbiologicaldiversitiesaroundusfromitsfundamentalbuildingblocks,theDNA”TheBeginning“Wehavejuststa8疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義9疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義10二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義1突變(mutation)

DNA永久的結(jié)構(gòu)改變。在大多數(shù)情況下，這樣的DNA變化或者沒有影響或者導(dǎo)致傷害，但是有時(shí)突變能改善生物體生存的機(jī)會(huì)，將有利的突變傳給后代。

2在人群中，個(gè)體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因的多態(tài)性(genepolymorphism)。這種多態(tài)性可以分為兩類，即DNA位點(diǎn)多態(tài)性(sitepolymorphism)和長度多態(tài)性(lengthpolymorphism)。（一）基因突變與基因多態(tài)性二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義1突變(mutat11位點(diǎn)多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換），單個(gè)堿基的置換、缺失和插入。突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個(gè)堿基的置換又稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。據(jù)估計(jì)，單堿基變異的頻率在1/1000-2/1000。SNP在基因組中數(shù)量巨大，分布頻密，檢測易于自動(dòng)化和批量化，被認(rèn)為是新一代的遺傳標(biāo)記。位點(diǎn)多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在12AmutationintheDNAsequencewithafrequencyof>1%AmutationintheDNAsequence13單核苷酸多態(tài)性(ＳＮＰｓ)是指個(gè)體基因組內(nèi)特定核苷酸位置上的單個(gè)堿基發(fā)生突變,這種突變包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等。嚴(yán)格來說,只有當(dāng)?shù)任换虻念l率大于或等于1%時(shí)才能稱得上是ＳＮＰｓ,然而部分ＳＮＰｓ數(shù)據(jù)庫如ＨＧＶBase把等位基因的頻率小于1%的變異也包括在ＳＮＰｓ內(nèi)(見ＨＧＶBase數(shù)據(jù)庫首頁說明)。研究表明,人類每對等位染色體上每1000ｂｐ就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)ＳＮＰｓ,而整個(gè)人類基因組每300ｂｐ就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)ＳＮＰｓ。這樣在任意兩個(gè)個(gè)體之間,就有好幾百萬的單堿基差異和十萬個(gè)氨基酸的不同,所以ＳＮＰｓ在一定程度上反映了人類個(gè)體或群體的特異性。單核苷酸多態(tài)性(ＳＮＰｓ)是指個(gè)體基因組內(nèi)特定核苷酸位14疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義15長度多態(tài)性：一類為可變數(shù)目的重復(fù)序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTRS），它是由于相同的重復(fù)順序重復(fù)次數(shù)不同所致，它決定了小衛(wèi)星（minisatellite）DNA長度的多態(tài)性。小衛(wèi)星是由15-65bp的基本單位而成，重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。另一類長度多態(tài)性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星DNA（microsatellite），它們是由重復(fù)序列構(gòu)成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次。長度多態(tài)性是按照孟德爾方式遺傳的，它們在基因定位、DNA指紋分析，遺傳病的分析和診斷中被廣泛地應(yīng)用。長度多態(tài)性：一類為可變數(shù)目的重復(fù)序列（variablenu1699%ofoneindividualDNAsequenceswillbeidenticaltothatofanotherperson.Ofthe1%difference,over90%willbesinglenucleotidepolymorphisms(SNPs).GeneticVariationsSNPsDeletionsInsertionsMicrosatelliteMinisatellite99%ofoneindividualDNAsequ17疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義18（二）基因多態(tài)性的生物學(xué)作用與意義1生物學(xué)作用（1）遺傳密碼的改變錯(cuò)義突變(missensemutation)、無義突變(nonsensemutation)、同義突變(samesensemutation)、移碼突變(frame-shiftingmutation)（2）對mRNA剪接的影響：如果點(diǎn)突變發(fā)生在內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生兩種影響：一是原有的剪接位點(diǎn)消失，二是產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)。無論是那一種形式，都可以導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)誤剪接，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的表達(dá)產(chǎn)物，數(shù)個(gè)堿基的缺失、片段缺失等均有可能造成剪接位點(diǎn)的缺失。（二）基因多態(tài)性的生物學(xué)作用與意義1生物學(xué)作用19（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：無義突變和DNA片段的缺失都可以導(dǎo)致肽鏈中的片段缺失，致使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能。移碼突變不僅翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，而且也導(dǎo)致肽鏈中的大片段缺失。（4）啟動(dòng)子的突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變：可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性增強(qiáng)或降低。

（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：202基因多態(tài)性的生物學(xué)意義

在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多態(tài)性的研究涉及的范圍廣泛，包括基因多態(tài)性與病因未知的疾病關(guān)系的研究，也包括對已知特定環(huán)境因素致病易感基因的篩選。因此開展我國人群的基因多態(tài)性與環(huán)境的作用關(guān)系的研究具有重要的意義。而基因多態(tài)性的研究在職業(yè)病醫(yī)學(xué)中則更具有實(shí)際的意義。對易感基因和易感性生物標(biāo)志物的分析，將某些攜帶敏感基因型的人甄別開來，采取針對性預(yù)防措施，提高預(yù)防職業(yè)性危害工作的效率。對特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多態(tài)性研究，有助于闡明環(huán)境因素的致病機(jī)制，也推動(dòng)了遺傳易感性標(biāo)志物的研究。2基因多態(tài)性的生物學(xué)意義在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多21疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義22三、基因多態(tài)性的檢測方法

到目前為止，DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)記物的研究已經(jīng)歷了三個(gè)階段。

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限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP），這是第一代DNA遺傳標(biāo)記，是D.Botstein于1980年提出的。RFLP的原理：如果存在DNA的多態(tài)性，會(huì)使DNA分子的限制酶切位點(diǎn)及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組時(shí)，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個(gè)片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態(tài)性。最早是用SouthernBlot/RFLP方法檢測，后來采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與限制酶酶切相結(jié)合的方法?，F(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長度多態(tài)性。三、基因多態(tài)性的檢測方法到目前為止，DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)23

基于ＰＣＲ、酶切的方法除了以上的RFLP還有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)ＰＣＲ-ＲＦＬＰ是通過專一識(shí)別性內(nèi)切酶處理ＰＣＲ產(chǎn)物,電泳后檢測分型ＲＡＰＤ利用隨機(jī)引物(約10ｂｐ)對基因組進(jìn)行擴(kuò)增,尋找特征性條帶和分型;此外,還有突變酶學(xué)檢測(ＥＭＤ)和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ＡＲＭＳ)等。

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2DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記重復(fù)序列的多態(tài)性有小衛(wèi)星DNA多態(tài)性和微衛(wèi)星的DNA多態(tài)性等多種。

3單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP,singlenucleotidepolymorphism），是1996年被美國的E.Lander提出的，被稱為“第三代DNA遺傳標(biāo)記”。其分析的經(jīng)典方法是采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分析、RFLP、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、變性高效液相色譜(dHPLC)和高通量基因芯片技術(shù)(HA)等。2DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記重復(fù)序列的多態(tài)性有小衛(wèi)25

（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，就會(huì)形成不同的構(gòu)象。在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并保證在單鏈狀態(tài)下,然后在一定濃度的非變性聚丙稀酰胺凝膠中電泳,單鏈ＤＮＡ遷移率除與ＤＮＡ濃度有關(guān)外,更主要取決于ＤＮＡ單鏈所形成的空間構(gòu)象,相同長度的單鏈ＤＮＡ,可以因其順序或單個(gè)堿基差異,所形成的空間構(gòu)象就會(huì)不同,其在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣,從而顯示出帶型的差異,即多態(tài)型。（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA26(2)溫度梯度凝膠電泳(ＴＧＧＥ)

該方法主要是根據(jù)帶點(diǎn)突變和正常ＤＮＡ片斷由于Ｔｍ值的不同將表現(xiàn)出不同的解鏈行為,ＤＮＡ片斷在聚丙稀酰胺凝膠電泳中通過設(shè)置溫度梯度來進(jìn)行分離,片段到達(dá)最低熔解區(qū)即開始解鏈,使片斷呈Ｙ字結(jié)構(gòu),因而降低其遷移速率。一個(gè)堿基的不同足以導(dǎo)致遷移速率的不同。該法可用于200～900ｂｐ內(nèi)的ＤＮＡ片斷,檢出率達(dá)100%,其Ｔｍ值可通過軟件預(yù)測。

(2)溫度梯度凝膠電泳(ＴＧＧＥ)該方法主要是根據(jù)帶點(diǎn)突變27(3)變性梯度凝膠電泳(ＤＧＧＥ)ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ在一定梯度變性劑濃度的凝膠中電泳時(shí),有突變和無突變會(huì)在不同的地方開始解鏈,從而達(dá)到分離的目的。ＤＧＧＥ與ＴＧＧＥ類似,前者是依靠變性劑使Ｔｍ值不同的分子分離,而后者是依靠溫度梯度分離Ｔｍ值不同的分子。ＤＧＧＥ檢測的片斷長度可達(dá)1000ｂｐ,但條件較難優(yōu)化且費(fèi)時(shí)。

(3)變性梯度凝膠電泳(ＤＧＧＥ)ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ在一28(4)變性高效液相色譜(ＤＨＰＬＣ)變性高效液相色譜法(ＤＨＰＬＣ)是一項(xiàng)在ＳＳＣＰ和ＤＧＧＥ基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測ＳＮＰ的突變技術(shù),通過帶正電荷的流動(dòng)相將帶負(fù)電荷的ＤＮＡ分子吸附到固定相上,基于同源雙鏈和異源雙鏈解鏈溫度的不同,通過控制ＤＨＰＬＣ的溫度,將系統(tǒng)維持在使異源雙鏈發(fā)生變性的溫度,而同源雙鏈并未變性的情況下進(jìn)行分離,樣品在55℃左右的特殊吸附劑中,只需6ｍｉｎ即可完成50～700ｂｐ基因片段的分離。ＳＮＰ的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形和數(shù)目上,因?yàn)楫愒措p鏈的解鏈溫度較低,會(huì)先形成單螺旋ＤＮＡ從色譜柱中流出,在色譜圖中會(huì)形成兩個(gè)保留時(shí)間較短的色譜峰。

(4)變性高效液相色譜(ＤＨＰＬＣ)變性高效液相色譜法(Ｄ29DHPLC無法象酶切檢測對已知SNP實(shí)現(xiàn)100%檢出,但它在尋找未知的SNP有明顯的優(yōu)勢[1]，首先酶切無法尋找未知的堿基改變,而且并不是所有的堿基改變都能找到酶切位點(diǎn)。變性梯度凝膠電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性均耗時(shí)長、檢出率低,測序的成本高,DHPLC檢出一個(gè)樣品僅需幾分鐘,且全自動(dòng)化,因此可以采用DHPLC對大樣本進(jìn)行篩先,再對特異峰型者進(jìn)行測序,這樣可以降低成本、提高工作效率。DHPLC無法象酶切檢測對已知SNP實(shí)30

（5）基因芯片法：又稱為DNA微探針陣列（Microarray）。它集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術(shù)已用于基因多態(tài)性的檢測。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光探針雜交技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性、定量及檢測范圍。應(yīng)用高密度基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性，為分析SNPs提供了便捷的方法。(6)毛細(xì)管電泳(ＣＥ)采用20～100μｍ的細(xì)管代替瓊脂糖和聚丙烯酰胺電泳,ＤＮＡ片段因離子表面積和分子外形的變異導(dǎo)致遷移時(shí)間不同而檢測ＳＮＰｓ。（5）基因芯片法：又稱為DNA微探針陣列（Micro31

（7）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其應(yīng)用主要包括：病毒感染定量監(jiān)測、細(xì)胞因子表達(dá)分析、基因突變及其多態(tài)性。

在實(shí)時(shí)定量PCR中要使用熒光探針，其中有TAQman探針和分子燈塔（molecularbeaconMB)分子燈塔（molecularbeaconMB)又稱為分子信標(biāo)，由熒光能量傳遞技術(shù)和線性探針技術(shù)改進(jìn)發(fā)展而來。國外于1996年開始應(yīng)用研究，是目前最新的核酸檢測技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)有：特異性更高、操作進(jìn)一步簡化，檢測更加快捷，而且減少了影響結(jié)果的不確定因素。不足：由于該技術(shù)目前還未完全成熟在探針設(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記等方面技術(shù)要求高，檢測成本較高。（7）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基32四、幾類基因的多態(tài)性與環(huán)境疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀

1應(yīng)激蛋白及其基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系從原核生物的細(xì)菌到真核生物的人類,當(dāng)接觸高溫或其他應(yīng)激因素時(shí),可以合成一組被稱為熱休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)的蛋白質(zhì)。其最重要的功能是幫助細(xì)胞適應(yīng)一系列應(yīng)激反應(yīng),而且導(dǎo)致HSPs表達(dá)或表達(dá)亞型上的改變,將會(huì)對應(yīng)激因素產(chǎn)生不同的耐受性。因此,HSPs的多態(tài)性與疾病或機(jī)體遭受應(yīng)激的易感性或耐受性有關(guān)[2]。四、幾類基因的多態(tài)性與環(huán)境疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀1應(yīng)激33熱休克蛋白屬于多基因家族，以人類HSP70基因家族基因?yàn)槔鹤钕缺豢寺『丸b定的基因是HSP70-1、HSP70-2和HSP70-Hom除了以上三個(gè)基因，目前對HSP70家族其他基因研究的不多。HSP70家族成員均可以作為分子伴侶,促進(jìn)新合成蛋白質(zhì)的正確折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)變性或損傷蛋白質(zhì)的再折疊或降解等,參與機(jī)體的免疫功能。目前研究得最多的與HSP70多態(tài)性有關(guān)的疾病是一些與自身免疫紊亂有關(guān)的疾病，如：HSP70-2基因多態(tài)性被看作是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的一個(gè)新的易感性標(biāo)記物。

熱休克蛋白屬于多基因家族，以人類HSP70基因家族基因?yàn)槔?4Mestiri等的研究表明HSP70-2基因的變異不僅是乳腺癌危險(xiǎn)性增加的標(biāo)記物,而且可能預(yù)示其臨床結(jié)果的好壞[3]Jalbout等的研究表明HSP70-2的基因型是土耳其鼻咽癌危險(xiǎn)性增高的標(biāo)記物[4]。

Mestiri等的研究表明HSP70-2基因的變異不僅是乳腺352癌基因、抑癌基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的特征性基因有三種，即H-ras,K-ras,N-ras它們分別定位于11、12、1號(hào)染色體前二者是大鼠肉瘤病毒的轉(zhuǎn)化基因，后者是從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中分離得到的。它們編碼的蛋白質(zhì)分子量為21KD,稱為P21蛋白。在人類部分腫瘤中,只要3個(gè)ras基因中有一個(gè)基因發(fā)生點(diǎn)突變,就會(huì)引起突變位點(diǎn)上的基因發(fā)生改變,這些位點(diǎn)的突變使ras基因激活,導(dǎo)致P21蛋白的過度生成,持續(xù)不斷地將信號(hào)傳入細(xì)胞,造成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或惡變[5]。2癌基因、抑癌基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系36突變r(jià)as癌基因的種類與某些腫瘤類型密切相關(guān)。如：與肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的是K-ras基因的激活，造血系統(tǒng)腫瘤多發(fā)現(xiàn)N-ras的突變，泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹?。因此研究ras基因突變對于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重大意義。ahrendt等[6]對106例肺腺癌患者進(jìn)行K-ras基因突變研究,發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的29例患者全部是吸煙者,而未吸煙者肺癌中未檢測到K-ras基因突變,因此認(rèn)為肺腺癌患者中K-ras基因突變與吸煙有著密切聯(lián)系。突變r(jià)as癌基因的種類與某些腫瘤類型密切相關(guān)。如：與肺癌、37以ras基因作為分子標(biāo)記物,以肺癌患者的痰液、胸液、纖支鏡取材等材料作為檢測對象,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性分析及直接測序法等檢測手段,檢測組織中K-ras基因突變熱點(diǎn)12、13、61等密碼子的突變情況,同時(shí)結(jié)合熒光纖支鏡、高分辨CT、超聲、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描等檢查手段,可以發(fā)現(xiàn)肺癌高危人群,對肺癌的癌前病變及早期肺癌作出診斷[7,8]。

以ras基因作為分子標(biāo)記物,以肺癌患者的痰液、胸液、纖支鏡取383代謝酶基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

目前研究較多的是細(xì)胞色素P450，人類P450基因已知有17個(gè)家族,其中有20個(gè)亞家族已在人類基因組中定位。參與人體代謝的主要為CYP1至CYP3家族以及CYP4家族部分成員的基因產(chǎn)物[9]。外源化學(xué)物通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體,在大多數(shù)情況下,先經(jīng)由細(xì)胞色素P450酶催化的Ⅰ相反應(yīng)活化后,由前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物,與生物大分子發(fā)生加合,造成基因損傷,啟動(dòng)化學(xué)致癌過程。

3代謝酶基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系39研究發(fā)現(xiàn)CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4,CYP3A5等基因存在多態(tài)性。P450家族中存在的基因多態(tài)性使不同基因型攜帶個(gè)體對特定的外源化合物代謝能力不同,由此造成個(gè)體在環(huán)境因素暴露引起的健康損害存在易感性的差異。國內(nèi)有人研究了慢性錳中毒易感性與CYP2D6基因第2938位突變的聯(lián)系(該突變使酶活性降低),認(rèn)為野生型較突變型有更高的錳中毒易感性[10]。

研究發(fā)現(xiàn)CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CY40葉酸代謝通路與DNA合成和甲基化有關(guān)葉酸代謝通路與DNA合成和甲基化有關(guān)41MTHFRGenotypeCasesControlsAdjustedOR(95%CI)No%No%AllCasesC677T（AlaVal）CC(ref.)5529.46036.11.00CT9048.18048.21.24(0.77-2.01)TT4222.52615.71.87(1.00-3.48)GastricCardiaCancerCC(ref.)2226.86036.11.00CT3846.48048.21.29(0.69-2.44)TT2226.82615.72.47(1.14-5.32)ShenH.,

etal.IntJCancer2001;95:332-6.IF=4.06葉酸代謝酶基因MTHFR多態(tài)性與中國人胃癌（賁門癌）遺傳易感性MTHFRGenotypeCasesControlsAdj424修復(fù)基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系在外來有害因素作用下會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)堿基錯(cuò)配、插入、缺失等結(jié)構(gòu)改變，而人體內(nèi)的基因修復(fù)酶可通過不同機(jī)制幫助機(jī)體修復(fù)這些錯(cuò)誤，保護(hù)人體健康，相反如果修復(fù)基因出現(xiàn)突變以致修復(fù)酶功能缺陷可與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。如：MED1是一種堿基切除修復(fù)酶，能夠直接或間接地幫助細(xì)胞修復(fù)癌癥對基因的損害。研究中發(fā)現(xiàn)：缺陷的Med1基因與非息肉型的結(jié)腸直腸腫瘤（最常見的遺傳性結(jié)腸直腸癌）有關(guān)。因此對修復(fù)基因多態(tài)性進(jìn)行研究有助于深入了解某些疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并可采取有效措施如：對高危險(xiǎn)人群進(jìn)行篩選等對相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防。

4修復(fù)基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系43

2002年，劉汝清[11]等采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)DNA直接測序法對100例正常人和88例腫瘤患者外周血白細(xì)胞進(jìn)行MGMT基因多態(tài)性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MGMT基因第3、4、5外顯子上存在著多態(tài)性,其中第3、4外顯子的多態(tài)改變與腫瘤形成的關(guān)系較弱,而第5外顯子的多態(tài)僅見于腫瘤患者,可能與腫瘤的形成有關(guān)。MGMT基因的多態(tài)性主要表現(xiàn)為同義突變和錯(cuò)義突變,而且多為單個(gè)堿基的變異。點(diǎn)突變所致的單一氨基酸替換,如果發(fā)生在關(guān)鍵區(qū)域,可顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。弄清楚MGMT基因變異的特征是理解其多態(tài)現(xiàn)象意義的關(guān)鍵。2002年，劉汝清[11]等采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC44五、目前基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究中存在的問題及對策1

由于多種原因，目前的研究大多還只是泛泛地進(jìn)行頻率調(diào)查或是簡單地了解單個(gè)基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的聯(lián)系。沒有大量進(jìn)行多個(gè)基因之間多態(tài)性與疾病易感性的綜合分析研究。2研究的樣本要足夠大，具有充分的代表性。3對于多基因病，應(yīng)根據(jù)疾病病理生理學(xué)改變，選擇多個(gè)候選基因客觀地從不同的側(cè)面進(jìn)行分析。

五、目前基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究中存在的問題及對策1454

候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)：研究某種疾病基因多態(tài)性與其發(fā)病及的聯(lián)系，所選擇候選基因的基因產(chǎn)物在該病發(fā)病機(jī)制中所起的作用應(yīng)該得到肯定。5

當(dāng)病例調(diào)查從發(fā)生頻率及功能研究上均能確定某一候選基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生、發(fā)展有肯定的聯(lián)系后，應(yīng)進(jìn)行“復(fù)核驗(yàn)證”。即根據(jù)初步研究中所得出的結(jié)論在“散發(fā)”病例的觀察中進(jìn)行驗(yàn)證。明確前面所得到的假設(shè)是否可靠。

4候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)：研究某種疾病基因466研究過程中遇到的實(shí)際問題有：Whichgenes&whichSNPsshouldwestartwith（從哪些基因哪些位點(diǎn)開始）?PolymorphismsofLow-penetrancegenes:Whyaretheresultsalwaysinconsistent?

（為何相關(guān)性研究結(jié)果總是不一致？）Howlargethesamplesizeisinmolecularepidemiologicalstudies(SNPs)?

（樣本量多大合適？）6研究過程中遇到的實(shí)際問題有：47Whichgeneshouldwestartwith?Considerationofbiology-

Basedonthemechanismofthedisease(Biologicalplausibility,adefinitivescientifichypothesis)Susceptivegenese.g.BRCA1,MSH2Sensitivegenese.g.GSTM1,GSTT1XRCC1,XPDCyclinD1,P53

Whichgeneshouldwestartwit48Inconsistenceofpreviousassociationstudies

of

SNPsLow-penetrancegenesSmallsamplesizePublicationbiasExcessivelyemphasizethestratifiedresults(withoutthemaineffect!)LimitationsofobservationalstudiesInconsistenceofpreviousasso49PublicationbiasTheselectionfromeditorTheabandonbyresearcherhimselfToomanysubgroupresultsLargeindependentstudywithprecisedesignMulti-centercollaborationPublicationbiasTheselection50Howbigshouldthesamplesizebe?HowmanygenesandhowmanySNPsinvolvedHowhighthefrequencyofpolymorphismsHowstrongtheassociationbetweenpolymorphismsandcancerInformationfromMeta-analysise.g.NAT2GSTM1Howbigshouldthesamplesize517Strategies(I)Precisestudydesign(payattentiontoenvironmentalexposures)LargesamplesizeMulti-centercollaborationHigh-throughputtechnology7Strategies(I)Precisestudy52UnpublishedSNPswithfunctionalevaluationMulti-siteswithinonegeneMulti-genesinonepathway:thegene-geneinteractionThecombinedanalysisofgenesinvolvedinmulti-pathwayandmulti-phaseofthediseasedevelopmentStrategies(II)UnpublishedSNPswithfunction53AnalysisofhaplotypeandhaplotypeblockAnalysisofgene-environmentinteractionAnalysisofgenotype-phenotypecorrelationStrategies(III)Analysisofhaplotypeandhapl54六、展望

Informationfromthehumangenomesequencewillincreasethroughourunderstandingofdiseasemechanisms,andguidethedevelopmentofnewdrugsandtherapeuticprocedures.BellJ.Nature2004,429:453-456六、展望Informationfromt55EvansWE.Nature2004,429:464-468DifferencesinDNAsequencesthatalterthefunctionofproteinsthataretargetedbydrugscancontributesignificantlytovariationintheresponsesofindividuals.EvansWE.Nature2004,429:4656基因檢測-危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)基因檢測-57PERSONALMEDICINE:Studiesinpharmacogeneticsrevealedthattheresponsetoananti-leukemiadrugcanbeeithertherapeuticortoxic.Asimplebloodtestcannowdeterminetheappropriatedosingofthedrugforeachindividual.基因型-藥物選擇PERSONALMEDICINE:Studiesin58多通路基因多態(tài)性與晚期結(jié)直腸癌對

5-Fu化療敏感性的關(guān)系Stoehlmacheretal.

BritishJournalofCancer

2004多通路基因多態(tài)性與晚期結(jié)直腸癌對

5-Fu化療敏感性的關(guān)系S59多個(gè)基因多態(tài)性聯(lián)合作用與5-Fu化療敏感性的關(guān)系多個(gè)基因多態(tài)性聯(lián)合作用與5-Fu化療敏感性的關(guān)系60Collins和McKusick預(yù)言：到2010年，基因預(yù)測將投入實(shí)際應(yīng)用，那些希望了解遺傳易感性信息的個(gè)體將會(huì)被告之其基因多態(tài)的情況，這樣可以幫助他們采取某些措施來減少危險(xiǎn)暴露，甚至進(jìn)行藥物預(yù)防，以及在一定的年齡階段開始針對性的體檢，從而達(dá)到降低疾病發(fā)生可能性和早期發(fā)現(xiàn)疾病的目的。Collins和McKusick預(yù)言：61人類基因組的研究成果在疾病預(yù)防中的應(yīng)用一級(jí)預(yù)防：深入理解基因-環(huán)境交互作用（環(huán)境基因組學(xué)），確定高危險(xiǎn)人群，從宏觀和微觀兩方面確定預(yù)防措施(疾病預(yù)測和危險(xiǎn)度評(píng)價(jià))

二級(jí)預(yù)防：發(fā)展新的篩檢試驗(yàn)，通過對人群基因型和/或家族史的分層來早期預(yù)測和診斷疾病(疾病基因組學(xué))

三級(jí)預(yù)防和臨床治療：藥物基因組學(xué)，個(gè)性化治療，增加藥物的療效和減少副作用人類基因組的研究成果在疾病預(yù)防中的應(yīng)用一級(jí)預(yù)防：深入理解62Gene-EnvironmentInteractionspontaneous15%Gene-environmentinteraction78%puregenetic5%pureenvironment2%EnvironmentGenetic--++20%80%100%17%83%Schulte,1994Gene-EnvironmentInteracti63疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義64結(jié)語基因多態(tài)性研究為我們探索疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及表型多樣化產(chǎn)生的本質(zhì)開辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域。在今天人類基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果日新月異的形勢下，對多基因參與的一些常見病，通過候選基因來綜合分析疾病的發(fā)病機(jī)制，從而有效預(yù)防疾病發(fā)生是未來預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)重要方向，也是目前將人類基因結(jié)構(gòu)性研究成果應(yīng)用于預(yù)防醫(yī)學(xué)的一個(gè)較現(xiàn)實(shí)的途徑。結(jié)語基因多態(tài)性研究為我們探索疾病的發(fā)生、發(fā)65REFRENCES[1]沈靖,王潤田,徐希平.篩查未知ＳＮＰｓ的變性高效液相色譜(ＤＨＰＬＣ)技術(shù)[Ｊ].國外醫(yī)學(xué)·遺傳學(xué)分冊,2001,6:341～344.[2]FavatierFetal.CellStressChap,1997,2:141-155[2]XiaoCetal.CellStressChap,2003,8:86-92.[3]MestiriSetal.Cancer,2001,91:672-678[4]JalboutMetal.CancerLett,2003,193:75-81[5]ChangF,SteelmanLS,LeeJT,et,al.SignaltransductionmediatedbytheRas/Raf/MEK/ERKpathwayfromcytokinereceptorstotranscriptionfactors:potentialtargetingfortherapeuticintervention.Leukemia,2003,17(7):1263-1293REFRENCES[1]沈靖,王潤田,徐希平.篩查未知ＳＮＰ66[6]AhrendtSA,DeckerPA,AlawiEA,et,al.CigarettesmokingisstronglyassociatedwithmutationoftheK-rasgeneinpatientswithprimaryadenocarcinomaofthelung.Cancer,2001,92(6):1525-1530[7]MinamotoT,OugolkovAV,MaiM.Detectionofoncogenesinthediagnosisofcancerswithactiveoncogenicsignaling.ExpertRevMolDeign,2002,2(6):565-575[8]MinamotoT,MaiM,RonaiZ.K-rasmutation:earlydetectioninmoleculardiagnosisandriskassessmentofcolorectal,pancreas,andlungcancers-areview.CancerdetectPrev,2000,24(1):1-12[9]NelsonDR,KoymansL,KoymansL,KamatakiT,etal.P450superfamily,updateonnewsequences,genemapping,accessionnumbersandnomenclature[J].Pharmacogenetics,1996,6(1):1-42.[6]AhrendtSA,DeckerPA,Alaw67[10]鄭玉新，何鳳生，陳彪，等。慢性錳中毒易感性與基因多態(tài)性的病例對照研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1999，33(2):78-80.[11]劉汝清，莊志雄，何春華，等.O6甲基鳥嘌呤－DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)系[J].癌變.畸變.突變,2002,14(2):101-106[10]鄭玉新，何鳳生，陳彪，等。慢性錳中毒易感性與基因多態(tài)68Thanks!Thanks!69疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展衛(wèi)生毒理教研室疾病易感性與基因多態(tài)性衛(wèi)生毒理教研室70主要內(nèi)容一、疾病易感性與高危人群二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義

三、基因多態(tài)性的檢測方法

四、關(guān)于基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀五、目前基因多態(tài)性研究中存在的問題及對策六、展望

主要內(nèi)容一、疾病易感性與高危人群二、基因多態(tài)性的概念、生71環(huán)境污染對人類健康的威脅日趨嚴(yán)重環(huán)境污染對人類健康的威脅日趨嚴(yán)重72有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，由于先天的遺傳因素，造成胎兒畸形占10%-15%，環(huán)境因素則占10%-20%，其它為遺傳基因和環(huán)境因素的聯(lián)合作用。目前已發(fā)現(xiàn)具有致畸作用的環(huán)境化學(xué)污染物有甲基汞、四氯二苯、五氯酚鈉和有機(jī)磷殺蟲劑等。有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，由于先天的遺傳因素，造成胎兒畸形占10%-1573Disease環(huán)境暴露Exposure

？遺傳因素Disease環(huán)境暴露Exposure？遺傳因素74HumanGenomeProject

人類基因組計(jì)劃（1990-）HumanGenomeProject人類基因組計(jì)劃（175一、易感基因與高危人群人們發(fā)現(xiàn)在同一環(huán)境因素變化條件下，有的人反應(yīng)強(qiáng)烈，出現(xiàn)患病甚至死亡，有的人反應(yīng)不大。例如，同是鋼鐵廠的冶煉工或電焊工，同在一個(gè)車間工作，同樣的作業(yè)環(huán)境，僅有部分人發(fā)生錳中毒。這說明不同個(gè)體對環(huán)境有害因素易感性存在差異。決定某個(gè)體對某種疾病易感性的基因稱為易感基因。對環(huán)境因素?fù)p害敏感的那部分人群稱為高危險(xiǎn)人群，在同一污染環(huán)境中，高危險(xiǎn)人群比正常人出現(xiàn)健康危害早而且程度也嚴(yán)重。在任何居民群體中都有高危險(xiǎn)人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年齡段，不同環(huán)境條件下，都有某一時(shí)間處于高危險(xiǎn)狀態(tài)的可能。一、易感基因與高危人群人們發(fā)現(xiàn)在同一環(huán)境因素76TheBeginning“Wehavejuststartedtherealjourneytowardsfullyunderstandingbiologicaldiversitiesaroundusfromitsfundamentalbuildingblocks,theDNA”TheBeginning“Wehavejuststa77疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義78疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義79二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義1突變(mutation)

DNA永久的結(jié)構(gòu)改變。在大多數(shù)情況下，這樣的DNA變化或者沒有影響或者導(dǎo)致傷害，但是有時(shí)突變能改善生物體生存的機(jī)會(huì)，將有利的突變傳給后代。

2在人群中，個(gè)體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因的多態(tài)性(genepolymorphism)。這種多態(tài)性可以分為兩類，即DNA位點(diǎn)多態(tài)性(sitepolymorphism)和長度多態(tài)性(lengthpolymorphism)。（一）基因突變與基因多態(tài)性二、基因多態(tài)性的概念、生物學(xué)作用與意義1突變(mutat80位點(diǎn)多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換），單個(gè)堿基的置換、缺失和插入。突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個(gè)堿基的置換又稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。據(jù)估計(jì)，單堿基變異的頻率在1/1000-2/1000。SNP在基因組中數(shù)量巨大，分布頻密，檢測易于自動(dòng)化和批量化，被認(rèn)為是新一代的遺傳標(biāo)記。位點(diǎn)多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在81AmutationintheDNAsequencewithafrequencyof>1%AmutationintheDNAsequence82單核苷酸多態(tài)性(ＳＮＰｓ)是指個(gè)體基因組內(nèi)特定核苷酸位置上的單個(gè)堿基發(fā)生突變,這種突變包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等。嚴(yán)格來說,只有當(dāng)?shù)任换虻念l率大于或等于1%時(shí)才能稱得上是ＳＮＰｓ,然而部分ＳＮＰｓ數(shù)據(jù)庫如ＨＧＶBase把等位基因的頻率小于1%的變異也包括在ＳＮＰｓ內(nèi)(見ＨＧＶBase數(shù)據(jù)庫首頁說明)。研究表明,人類每對等位染色體上每1000ｂｐ就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)ＳＮＰｓ,而整個(gè)人類基因組每300ｂｐ就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)ＳＮＰｓ。這樣在任意兩個(gè)個(gè)體之間,就有好幾百萬的單堿基差異和十萬個(gè)氨基酸的不同,所以ＳＮＰｓ在一定程度上反映了人類個(gè)體或群體的特異性。單核苷酸多態(tài)性(ＳＮＰｓ)是指個(gè)體基因組內(nèi)特定核苷酸位83疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義84長度多態(tài)性：一類為可變數(shù)目的重復(fù)序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTRS），它是由于相同的重復(fù)順序重復(fù)次數(shù)不同所致，它決定了小衛(wèi)星（minisatellite）DNA長度的多態(tài)性。小衛(wèi)星是由15-65bp的基本單位而成，重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。另一類長度多態(tài)性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星DNA（microsatellite），它們是由重復(fù)序列構(gòu)成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次。長度多態(tài)性是按照孟德爾方式遺傳的，它們在基因定位、DNA指紋分析，遺傳病的分析和診斷中被廣泛地應(yīng)用。長度多態(tài)性：一類為可變數(shù)目的重復(fù)序列（variablenu8599%ofoneindividualDNAsequenceswillbeidenticaltothatofanotherperson.Ofthe1%difference,over90%willbesinglenucleotidepolymorphisms(SNPs).GeneticVariationsSNPsDeletionsInsertionsMicrosatelliteMinisatellite99%ofoneindividualDNAsequ86疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義87（二）基因多態(tài)性的生物學(xué)作用與意義1生物學(xué)作用（1）遺傳密碼的改變錯(cuò)義突變(missensemutation)、無義突變(nonsensemutation)、同義突變(samesensemutation)、移碼突變(frame-shiftingmutation)（2）對mRNA剪接的影響：如果點(diǎn)突變發(fā)生在內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生兩種影響：一是原有的剪接位點(diǎn)消失，二是產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)。無論是那一種形式，都可以導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)誤剪接，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的表達(dá)產(chǎn)物，數(shù)個(gè)堿基的缺失、片段缺失等均有可能造成剪接位點(diǎn)的缺失。（二）基因多態(tài)性的生物學(xué)作用與意義1生物學(xué)作用88（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：無義突變和DNA片段的缺失都可以導(dǎo)致肽鏈中的片段缺失，致使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能。移碼突變不僅翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，而且也導(dǎo)致肽鏈中的大片段缺失。（4）啟動(dòng)子的突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變：可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性增強(qiáng)或降低。

（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：892基因多態(tài)性的生物學(xué)意義

在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多態(tài)性的研究涉及的范圍廣泛，包括基因多態(tài)性與病因未知的疾病關(guān)系的研究，也包括對已知特定環(huán)境因素致病易感基因的篩選。因此開展我國人群的基因多態(tài)性與環(huán)境的作用關(guān)系的研究具有重要的意義。而基因多態(tài)性的研究在職業(yè)病醫(yī)學(xué)中則更具有實(shí)際的意義。對易感基因和易感性生物標(biāo)志物的分析，將某些攜帶敏感基因型的人甄別開來，采取針對性預(yù)防措施，提高預(yù)防職業(yè)性危害工作的效率。對特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多態(tài)性研究，有助于闡明環(huán)境因素的致病機(jī)制，也推動(dòng)了遺傳易感性標(biāo)志物的研究。2基因多態(tài)性的生物學(xué)意義在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多90疾病易感性與基因多態(tài)性研究進(jìn)展課件講義91三、基因多態(tài)性的檢測方法

到目前為止，DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)記物的研究已經(jīng)歷了三個(gè)階段。

1

限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP），這是第一代DNA遺傳標(biāo)記，是D.Botstein于1980年提出的。RFLP的原理：如果存在DNA的多態(tài)性，會(huì)使DNA分子的限制酶切位點(diǎn)及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組時(shí)，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個(gè)片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態(tài)性。最早是用SouthernBlot/RFLP方法檢測，后來采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與限制酶酶切相結(jié)合的方法?，F(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長度多態(tài)性。三、基因多態(tài)性的檢測方法到目前為止，DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)92

基于ＰＣＲ、酶切的方法除了以上的RFLP還有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)ＰＣＲ-ＲＦＬＰ是通過專一識(shí)別性內(nèi)切酶處理ＰＣＲ產(chǎn)物,電泳后檢測分型ＲＡＰＤ利用隨機(jī)引物(約10ｂｐ)對基因組進(jìn)行擴(kuò)增,尋找特征性條帶和分型;此外,還有突變酶學(xué)檢測(ＥＭＤ)和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ＡＲＭＳ)等。

93

2DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記重復(fù)序列的多態(tài)性有小衛(wèi)星DNA多態(tài)性和微衛(wèi)星的DNA多態(tài)性等多種。

3單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP,singlenucleotidepolymorphism），是1996年被美國的E.Lander提出的，被稱為“第三代DNA遺傳標(biāo)記”。其分析的經(jīng)典方法是采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分析、RFLP、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、變性高效液相色譜(dHPLC)和高通量基因芯片技術(shù)(HA)等。2DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記重復(fù)序列的多態(tài)性有小衛(wèi)94

（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，就會(huì)形成不同的構(gòu)象。在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并保證在單鏈狀態(tài)下,然后在一定濃度的非變性聚丙稀酰胺凝膠中電泳,單鏈ＤＮＡ遷移率除與ＤＮＡ濃度有關(guān)外,更主要取決于ＤＮＡ單鏈所形成的空間構(gòu)象,相同長度的單鏈ＤＮＡ,可以因其順序或單個(gè)堿基差異,所形成的空間構(gòu)象就會(huì)不同,其在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣,從而顯示出帶型的差異,即多態(tài)型。（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA95(2)溫度梯度凝膠電泳(ＴＧＧＥ)

該方法主要是根據(jù)帶點(diǎn)突變和正常ＤＮＡ片斷由于Ｔｍ值的不同將表現(xiàn)出不同的解鏈行為,ＤＮＡ片斷在聚丙稀酰胺凝膠電泳中通過設(shè)置溫度梯度來進(jìn)行分離,片段到達(dá)最低熔解區(qū)即開始解鏈,使片斷呈Ｙ字結(jié)構(gòu),因而降低其遷移速率。一個(gè)堿基的不同足以導(dǎo)致遷移速率的不同。該法可用于200～900ｂｐ內(nèi)的ＤＮＡ片斷,檢出率達(dá)100%,其Ｔｍ值可通過軟件預(yù)測。

(2)溫度梯度凝膠電泳(ＴＧＧＥ)該方法主要是根據(jù)帶點(diǎn)突變96(3)變性梯度凝膠電泳(ＤＧＧＥ)ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ在一定梯度變性劑濃度的凝膠中電泳時(shí),有突變和無突變會(huì)在不同的地方開始解鏈,從而達(dá)到分離的目的。ＤＧＧＥ與ＴＧＧＥ類似,前者是依靠變性劑使Ｔｍ值不同的分子分離,而后者是依靠溫度梯度分離Ｔｍ值不同的分子。ＤＧＧＥ檢測的片斷長度可達(dá)1000ｂｐ,但條件較難優(yōu)化且費(fèi)時(shí)。

(3)變性梯度凝膠電泳(ＤＧＧＥ)ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ在一97(4)變性高效液相色譜(ＤＨＰＬＣ)變性高效液相色譜法(ＤＨＰＬＣ)是一項(xiàng)在ＳＳＣＰ和ＤＧＧＥ基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測ＳＮＰ的突變技術(shù),通過帶正電荷的流動(dòng)相將帶負(fù)電荷的ＤＮＡ分子吸附到固定相上,基于同源雙鏈和異源雙鏈解鏈溫度的不同,通過控制ＤＨＰＬＣ的溫度,將系統(tǒng)維持在使異源雙鏈發(fā)生變性的溫度,而同源雙鏈并未變性的情況下進(jìn)行分離,樣品在55℃左右的特殊吸附劑中,只需6ｍｉｎ即可完成50～700ｂｐ基因片段的分離。ＳＮＰ的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形和數(shù)目上,因?yàn)楫愒措p鏈的解鏈溫度較低,會(huì)先形成單螺旋ＤＮＡ從色譜柱中流出,在色譜圖中會(huì)形成兩個(gè)保留時(shí)間較短的色譜峰。

(4)變性高效液相色譜(ＤＨＰＬＣ)變性高效液相色譜法(Ｄ98DHPLC無法象酶切檢測對已知SNP實(shí)現(xiàn)100%檢出,但它在尋找未知的SNP有明顯的優(yōu)勢[1]，首先酶切無法尋找未知的堿基改變,而且并不是所有的堿基改變都能找到酶切位點(diǎn)。變性梯度凝膠電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性均耗時(shí)長、檢出率低,測序的成本高,DHPLC檢出一個(gè)樣品僅需幾分鐘,且全自動(dòng)化,因此可以采用DHPLC對大樣本進(jìn)行篩先,再對特異峰型者進(jìn)行測序,這樣可以降低成本、提高工作效率。DHPLC無法象酶切檢測對已知SNP實(shí)99

（5）基因芯片法：又稱為DNA微探針陣列（Microarray）。它集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術(shù)已用于基因多態(tài)性的檢測。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光探針雜交技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性、定量及檢測范圍。應(yīng)用高密度基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性，為分析SNPs提供了便捷的方法。(6)毛細(xì)管電泳(ＣＥ)采用20～100μｍ的細(xì)管代替瓊脂糖和聚丙烯酰胺電泳,ＤＮＡ片段因離子表面積和分子外形的變異導(dǎo)致遷移時(shí)間不同而檢測ＳＮＰｓ。（5）基因芯片法：又稱為DNA微探針陣列（Micro100

（7）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其應(yīng)用主要包括：病毒感染定量監(jiān)測、細(xì)胞因子表達(dá)分析、基因突變及其多態(tài)性。

在實(shí)時(shí)定量PCR中要使用熒光探針，其中有TAQman探針和分子燈塔（molecularbeaconMB)分子燈塔（molecularbeaconMB)又稱為分子信標(biāo)，由熒光能量傳遞技術(shù)和線性探針技術(shù)改進(jìn)發(fā)展而來。國外于1996年開始應(yīng)用研究，是目前最新的核酸檢測技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)有：特異性更高、操作進(jìn)一步簡化，檢測更加快捷，而且減少了影響結(jié)果的不確定因素。不足：由于該技術(shù)目前還未完全成熟在探針設(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記等方面技術(shù)要求高，檢測成本較高。（7）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基101四、幾類基因的多態(tài)性與環(huán)境疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀

1應(yīng)激蛋白及其基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系從原核生物的細(xì)菌到真核生物的人類,當(dāng)接觸高溫或其他應(yīng)激因素時(shí),可以合成一組被稱為熱休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)的蛋白質(zhì)。其最重要的功能是幫助細(xì)胞適應(yīng)一系列應(yīng)激反應(yīng),而且導(dǎo)致HSPs表達(dá)或表達(dá)亞型上的改變,將會(huì)對應(yīng)激因素產(chǎn)生不同的耐受性。因此,HSPs的多態(tài)性與疾病或機(jī)體遭受應(yīng)激的易感性或耐受性有關(guān)[2]。四、幾類基因的多態(tài)性與環(huán)境疾病易感性關(guān)系研究的現(xiàn)狀1應(yīng)激102熱休克蛋白屬于多基因家族，以人類HSP70基因家族基因?yàn)槔鹤钕缺豢寺『丸b定的基因是HSP70-1、HSP70-2和HSP70-Hom除了以上三個(gè)基因，目前對HSP70家族其他基因研究的不多。HSP70家族成員均可以作為分子伴侶,促進(jìn)新合成蛋白質(zhì)的正確折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)變性或損傷蛋白質(zhì)的再折疊或降解等,參與機(jī)體的免疫功能。目前研究得最多的與HSP70多態(tài)性有關(guān)的疾病是一些與自身免疫紊亂有關(guān)的疾病，如：HSP70-2基因多態(tài)性被看作是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的一個(gè)新的易感性標(biāo)記物。

熱休克蛋白屬于多基因家族，以人類HSP70基因家族基因?yàn)槔?03Mestiri等的研究表明HSP70-2基因的變異不僅是乳腺癌危險(xiǎn)性增加的標(biāo)記物,而且可能預(yù)示其臨床結(jié)果的好壞[3]Jalbout等的研究表明HSP70-2的基因型是土耳其鼻咽癌危險(xiǎn)性增高的標(biāo)記物[4]。

Mestiri等的研究表明HSP70-2基因的變異不僅是乳腺1042癌基因、抑癌基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的特征性基因有三種，即H-ras,K-ras,N-ras它們分別定位于11、12、1號(hào)染色體前二者是大鼠肉瘤病毒的轉(zhuǎn)化基因，后者是從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中分離得到的。它們編碼的蛋白質(zhì)分子量為21KD,稱為P21蛋白。在人類部分腫瘤中,只要3個(gè)ras基因中有一個(gè)基因發(fā)生點(diǎn)突變,就會(huì)引起突變位點(diǎn)上的基因發(fā)生改變,這些位點(diǎn)的突變使ras基因激活,導(dǎo)致P21蛋白的過度生成,持續(xù)不斷地將信號(hào)傳入細(xì)胞,造成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或惡變[5]。2癌基因、抑癌基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系105突變r(jià)as癌基因的種類與某些腫瘤類型密切相關(guān)。如：與肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的是K-ras基因的激活，造血系統(tǒng)腫瘤多發(fā)現(xiàn)N-ras的突變，泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹鳌Ｒ虼搜芯縭as基因突變對于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重大意義。ahrendt等[6]對106例肺腺癌患者進(jìn)行K-ras基因突變研究,發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的29例患者全部是吸煙者,而未吸煙者肺癌中未檢測到K-ras基因突變,因此認(rèn)為肺腺癌患者中K-ras基因突變與吸煙有著密切聯(lián)系。突變r(jià)as癌基因的種類與某些腫瘤類型密切相關(guān)。如：與肺癌、106以ras基因作為分子標(biāo)記物,以肺癌患者的痰液、胸液、纖支鏡取材等材料作為檢測對象,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性分析及直接測序法等檢測手段,檢測組織中K-ras基因突變熱點(diǎn)12、13、61等密碼子的突變情況,同時(shí)結(jié)合熒光纖支鏡、高分辨CT、超聲、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描等檢查手段,可以發(fā)現(xiàn)肺癌高危人群,對肺癌的癌前病變及早期肺癌作出診斷[7,8]。

以ras基因作為分子標(biāo)記物,以肺癌患者的痰液、胸液、纖支鏡取1073代謝酶基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

目前研究較多的是細(xì)胞色素P450，人類P450基因已知有17個(gè)家族,其中有20個(gè)亞家族已在人類基因組中定位。參與人體代謝的主要為CYP1至CYP3家族以及CYP4家族部分成員的基因產(chǎn)物[9]。外源化學(xué)物通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體,在大多數(shù)情況下,先經(jīng)由細(xì)胞色素P450酶催化的Ⅰ相反應(yīng)活化后,由前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物,與生物大分子發(fā)生加合,造成基因損傷,啟動(dòng)化學(xué)致癌過程。

3代謝酶基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系108研究發(fā)現(xiàn)CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4,CYP3A5等基因存在多態(tài)性。P450家族中存在的基因多態(tài)性使不同基因型攜帶個(gè)體對特定的外源化合物代謝能力不同,由此造成個(gè)體在環(huán)境因素暴露引起的健康損害存在易感性的差異。國內(nèi)有人研究了慢性錳中毒易感性與CYP2D6基因第2938位突變的聯(lián)系(該突變使酶活性降低),認(rèn)為野生型較突變型有更高的錳中毒易感性[10]。

研究發(fā)現(xiàn)CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CY109葉酸代謝通路與DNA合成和甲基化有關(guān)葉酸代謝通路與DNA合成和甲基化有關(guān)110MTHFRGenotypeCasesControlsAdjustedOR(95%CI)No%No%AllCasesC677T（AlaVal）CC(ref.)5529.46036.11.00CT9048.18048.21.24(0.77-2.01)TT4222.52615.71.87(1.00-3.48)GastricCardiaCancerCC(ref.)2226.86036.11.00CT3846.48048.21.29(0.69-2.44)TT2226.82615.72.47(1.14-5.32)ShenH.,

etal.IntJCancer2001;95:332-6.IF=4.06葉酸代謝酶基因MTHFR多態(tài)性與中國人胃癌（賁門癌）遺傳易感性MTHFRGenotypeCasesControlsAdj1114修復(fù)基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系在外來有害因素作用下會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)堿基錯(cuò)配、插入、缺失等結(jié)構(gòu)改變，而人體內(nèi)的基因修復(fù)酶可通過不同機(jī)制幫助機(jī)體修復(fù)這些錯(cuò)誤，保護(hù)人體健康，相反如果修復(fù)基因出現(xiàn)突變以致修復(fù)酶功能缺陷可與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。如：MED1是一種堿基切除修復(fù)酶，能夠直接或間接地幫助細(xì)胞修復(fù)癌癥對基因的損害。研究中發(fā)現(xiàn)：缺陷的Med1基因與非息肉型的結(jié)腸直腸腫瘤（最常見的遺傳性結(jié)腸直腸癌）有關(guān)。因此對修復(fù)基因多態(tài)性進(jìn)行研究有助于深入了解某些疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并可采取有效措施如：對高危險(xiǎn)人群進(jìn)行篩選等對相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防。

4修復(fù)基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系112

2002年，劉汝清[11]等采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)DNA直接測序法對100例正常人和88例腫瘤患者外周血白細(xì)胞進(jìn)行MGMT基因多態(tài)性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MGMT基因第3、4、5外顯子上存在著多態(tài)性,其中第3、4外顯子的多態(tài)改變與腫瘤形成的關(guān)系較弱,而第5外顯子的多態(tài)僅見于腫瘤患者,可能與腫瘤的形成有關(guān)。MGMT基因的多態(tài)性主要表現(xiàn)為同義突變和錯(cuò)義突變,而且多為單個(gè)堿基的變異。點(diǎn)突變所致的單一氨基酸替換,如果發(fā)生在關(guān)鍵區(qū)域,可顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。弄清楚MGMT基因變異的特征是理解其多態(tài)現(xiàn)象意義的關(guān)鍵。2002年，劉汝清[11]等采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC113五、目前基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究中存在的問題及對策1

由于多種原因，目前的研究大多還只是泛泛地進(jìn)行頻率調(diào)查或是簡單地了解單個(gè)基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的聯(lián)系。沒有大量進(jìn)行多個(gè)基因之間多態(tài)性與疾病易感性的綜合分析研究。2研究的樣本要足夠大，具有充分的代表性。3對于多基因病，應(yīng)根據(jù)疾病病理生理學(xué)改變，選擇多個(gè)候選基因客觀地從不同的側(cè)面進(jìn)行分析。

五、目前基因多態(tài)性與疾病易感性關(guān)系研究中存在的問題及對策11144

候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)：研究某種疾病基因多態(tài)性與其發(fā)病及的聯(lián)系，所選擇候選基因的基因產(chǎn)物在該病發(fā)病機(jī)制中所起的作用應(yīng)該得到肯定。5

當(dāng)病例調(diào)查從發(fā)生頻率及功能研究上均能確定某一候選基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生、發(fā)展有肯定的聯(lián)系后，應(yīng)進(jìn)行“復(fù)核驗(yàn)證”。即根據(jù)初步研究中所得出的結(jié)論在“散發(fā)”病例的觀察中進(jìn)行驗(yàn)證。明確前面所得到的假設(shè)是否可靠。

4候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)：研究某種疾病基因1156研究過程中遇到的實(shí)際問題有：Whichgenes&whichSNPsshouldwestartwith（從哪些基因哪些位點(diǎn)開始）?PolymorphismsofLow-penetrancegenes:Whyaretheresultsalwaysinconsistent?

（為何相關(guān)性研究結(jié)果總是不一致？）Howlargethesamplesizeisinmolecularepidemiologicalstudies(SNPs)?

（樣本量多大合適？）6研究過程中遇到的實(shí)際問題有：116Whichgeneshouldwestartwith?Considerationofbiology-

Basedonthemechanismofthedisease(Biologicalplausibility,adefinitivescientifichypothesis)Susceptivegenese.g.BRCA1,MSH2Sensitivegenese.g.GSTM1,GSTT1XRCC1,XPDCyclinD1,P53

Whichgeneshouldwestartwit117Inconsistenceofpreviousassociationstudies

of

SNPsLow-penetrancegenesSmallsamplesizePublicationbiasExcessivelyemphasizethestratifiedresults(withoutthemaineffect!)LimitationsofobservationalstudiesInconsistenceofpreviousasso118PublicationbiasTheselectionfromeditorTheabandonbyresearcherhimselfToomanysubgroupresultsLargeindependentstudywithprecisedesignMulti-centercollaborationPublicationbiasTheselection119Howbigshouldthesamplesizebe?HowmanygenesandhowmanySNPsinvolvedHowhighthefrequencyofpolymorphismsHowstrongtheassociationbetweenpolymorphismsandcancerInformationfromMet