多角度激光光散射與GPC聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)

標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用文案大全文案大全文案大全文案大全6300HollisterAwemje?SantaBartrara,CA931176&1-W9*FAX{8Q5jeei-0123E-mail;info@wyHtt.cOni■URLhttp;//www.wyatt.oorn多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀

聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)MALLS/GPC(SEC)WYATTTECHNOLOGYCORPORTION(BEIJINGOFFICE)地址：北京西直門北大街58號金暉嘉園7-2302美國懷雅特技術(shù)公司北京代表處郵編：100082電話：8610-82292806傳真：8610-82290337多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀的聯(lián)接與應(yīng)用WYATTTECHNOLOGYCORPORATION.前言近十幾年來，光散射技術(shù)(Lightscattering)在高分子特征分析領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。將光散射技術(shù)和凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography,GPC)或尺寸排阻色譜(SizeExclusionChromatography)分離技術(shù)相結(jié)合，不但可以測得大分子的絕對分子量，分子旋轉(zhuǎn)半徑與第二維里系數(shù)，還可測得分子量分布，分辨分子量大小不同的族群以及分子的形狀，分枝率及聚集態(tài)等。目前，該技術(shù)已成為一種非常有效的工具，在美國，日本及歐洲已廣為使用，國內(nèi)近年來亦引進(jìn)了此項技術(shù)。光散射簡介早在十九世紀(jì)初，人們就開始對光散射原理進(jìn)行研究。自六十年代激光被發(fā)明以來，光散射的原理與技術(shù)便得以迅速發(fā)展，至今已成為檢測微小粒子形狀，粒徑大小，分子量，界面電位及粒子間效應(yīng)的重要工具。隨著電腦技術(shù)的日新月異，許多過去需花費數(shù)小時甚至數(shù)日才能完成的實驗，如今只需數(shù)分鐘即可完成，而其準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性也大幅度提高了。光散射現(xiàn)象，如圖1所示，當(dāng)一束光通過一間充滿煙霧的房間就會產(chǎn)生散射。利用在不同角度，不同時間所測得的光散射強度，再借助各種光學(xué)理論及軟件，硬件設(shè)備就可以測得微粒的許多特性。入射光散射光圖1光散射現(xiàn)象在光散射發(fā)展的歷程中，以下是一些具有代表性的人物▲JamesClerkMaxwell(1833-1879)解釋了光是一種電磁波，并正確地計算出光的速度?！鳯ordRayleigh(1842-1919)研究了遠(yuǎn)小于波長的微粒散射現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了散射強度與波長的四次方成反比，并解釋了藍(lán)天被太陽光穿透大氣層所產(chǎn)生的散射現(xiàn)象?！鳤bertEinstein（1879-1955）研究了液體的光散射現(xiàn)象?！鳦handrasekharaV.Raman（1888-1970）印度籍物理大師，提出了Raman效應(yīng)，其著作多次發(fā)表于印度文期刊，直至第二次世界大戰(zhàn)結(jié)束后才逐漸被人所知。▲PeterDebye（1884-1966）延續(xù)了Einstein的理論，描述了分子溶解于溶劑中所產(chǎn)生的光散射現(xiàn)象，提出用Debyeplot,求得重量平均分子量Mw。光散射理論激光照射到樣品時，會在各個方向產(chǎn)生散射光，于是我們可以在一個角度或多個角度收集散射光的強度。光散射所透在任何方向的光散射強度與分子量和溶液的濃度成正比；散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關(guān)。當(dāng)分子小于10nm時，各個角度的散射強度都相同；當(dāng)分子介于10至30nm時，散射強度則由低角度向高角度呈直線下降的趨勢；而當(dāng)分子大于30nm時，散射強度則隨角度增大呈曲線下降的趨勢。基本理論由Maxwell，Einstein，Debye及Zimm等人陸續(xù)發(fā)展起來，有關(guān)溶劑中分子量的光散射現(xiàn)象可由下列公式表達(dá)：K*c1R（e）mp（e）w式中：常數(shù)K*=4n2（d/d）2n2（N入4）nc0A0n是溶劑的折光指數(shù)。0C是溶質(zhì)分子的濃度（g/mol）。N是阿佛加德羅常數(shù)。A入是入射光的波長。0DN/DC是溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù)變化。R（）是單個角度的散射光（大于溶劑的散射光數(shù)量）除以入射光強度所得的分?jǐn)?shù)即不同角度光散射強度。Mw是重均分子量。

A是第二維里系數(shù)2P(是光散射強度的函數(shù)將P(__在上式中，R()是測得值，K*c、入Mw、A、r0、2g為未知值。ZimmPlot可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K將可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K0為調(diào)整橫坐標(biāo)的設(shè)定值。圖2ZimmPlo當(dāng)0TO時，(2)式簡化為斜率即是AK*12+2Ac2R(0)M當(dāng)CT當(dāng)CT0時，(2)式簡化為斜率是r2g當(dāng)0TO,CT0,(2)式簡化為K*1R(0)M在縱座標(biāo)上交點的倒數(shù)即為Mw。實驗的方法為配制一組不同濃度的溶液，依次在不同的角度測量其散射光強度，由計算機程序按照上列的公式繪出ZimmPlot,并求得Mw,<r2>及A值，這是極少數(shù)能直接測得絕對分子量的方法之一。但由于結(jié)果僅為單g2一平均值,因此較適用于成分單一,分布較窄的分子,對于分布較寬或有不同族群分布的樣品,則較難看出全貌。

光散射與GPC/SECGPC/SEC可以將溶劑中的分子按重量或尺寸大小依次洗脫出來。利用此項技術(shù)將光散射儀器與GPC/SEC聯(lián)用，除了可以分出不同的族裙，還可測得不同族群的分布，并且不需要另外標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于光散射信號直接與分子量大小有關(guān)，因此可圖4圖4光散射強度與GPC層析圖ChromatographywithLSSet-up圖5光散射強度與GPC/SEC圖5光散射強度與GPC/SEC聯(lián)用1Debyeplot通常GPC/SEC的樣品注射濃度就很低，再經(jīng)過色譜柱得到進(jìn)一步的稀釋，圖4中光散射信號上的任何一點，其濃度都極低(趨近于零)。根據(jù)公式，當(dāng)2ACT0,2Peak,Slice:1,184Peak,Slice:1,184Volume:13.067mLFitdegree:1Cone.:(1.488?0.006)e-5g/mLMw:(6.505?0.088)e+6g/molRadius:158.8?0.5nm將K*C/R對sin2(q/2)+kc作圖6,其縱坐標(biāo)交點即為1/Mw，由直線的斜率可得9到＜r2＞，圖4光散射信號的每點都可以得到上述結(jié)果，由此可以求得分子量及旋轉(zhuǎn)半g徑＜r2＞的分布，如圖7所示：g—A—TVAJAsin?theta/2)90?&AUXdetectors圖7分子量對洗脫體積作圖MolarMassig/mol)MUoCJeLrl-cd譽容岳子形狀的數(shù)據(jù)。球形分子r38MTlogr=k+iii無規(guī)則線團(tuán)狀分子r28MTlogr=k+iii棒狀分子r18MTlogr=kii1/31/21/1logMilogMilogMi將logri，logM作圖，i有直線的斜率可以獲知分子的形狀，如圖9所示：圖9-1M、rg與分子形狀的關(guān)系g\.^n(suuuaHSMRMolarMass(g/mol)構(gòu)型判斷，r對M作圖。斜率為0.540.01。表明分子是具有無規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象的線性聚合100.0RMSRadiusvs.MolarMassgw100.0RMSRadiusvs.MolarMassGATD4_010.68?0「04GATD5_010.69?0.~i0410.01.01.0x1041.0x10510.01.01.0x1041.0x105MolarMass(g/mol)1.0x1069-3構(gòu)型判斷，r對M作圖。斜率大于0.6，表明分子具有伸展結(jié)構(gòu)。斜率為1.0,表明是棒狀gwGATE201RMSRadiusvs.MolarMassGATE201100.010.01.0x1051.0x10610.01.0x1051.0x1061.0x1071.0x108MolarMass(g/mol)標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用圖11圖11三個檢測角度圖9-4構(gòu)型判斷，r對M作圖。其U型曲線表明為典型的高支化度結(jié)構(gòu)。3需要量多少個角度在低角度的時候，有雜質(zhì)所產(chǎn)生的噪音信號干擾會很大，如圖10所示，所以只取低角度，加上九十度兩個角度，其誤差就會相對很大；若只取九十度則只能求得分子量，無法測得旋轉(zhuǎn)半徑，所以最起碼要加上一組高角度來修正，則誤差會較少很多。的GPC層4光散射儀器最基本的儀器miniDAWNTREOS如圖11所示，在與入射光成45度、90度、135度角配置三組光電二極管檢測器，同時檢測不同角度的光散射強度，而激光經(jīng)由樣品槽的毛細(xì)管通道，樣品槽為石英材質(zhì)。如果要增加測量角度，可以如DAWNHELEOS在樣品槽的兩側(cè)以不對稱得方式增加檢測器的數(shù)目，如圖12所示可高達(dá)18個角度之多。五應(yīng)用光散射強度與分子的大小及分子量有直接的關(guān)系，而SEC/GPC能分離不同尺寸及分子量的分子，結(jié)合此兩種特性，可以得到許多有用的信息，并廣泛地應(yīng)用于高分子，生化及動力學(xué)等研究領(lǐng)域。

圖12十八角度檢測器1高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系統(tǒng)(Multi-AngleLaserLightScattering_MALLS)結(jié)合SEC/GPC，不必依賴泵的流速，校正曲線及其它任何的假設(shè)，即可直接求得重均絕對分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。IntensitMAT1:3DPlot圖13光散射強度，洗脫體積與角度作圖MALLS利用色譜柱分離出的樣品在各個角度的光散射量(如圖13)，由RI檢測器得到的洗脫液濃度及dn/dc值，即可計算出各個切片的分子量。MALLS測得絕對分子量所需的各種物性均可由實驗直接求得，無需作任何假設(shè)。而GPC的色譜柱又有分離雜質(zhì)的功能，可以避免傳統(tǒng)的光散射需極小心準(zhǔn)備樣品的麻煩。圖14顯示高分子混合物經(jīng)SEC分離后MALLS及RIMAT1:3DPlot圖13光散射強度，洗脫體積與角度作圖StrioChart-PEPTA"、區(qū)2aw4_「一.._?〕a1心案文標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用文案大全文案大全文案大全文案大全1BSA67,00064,300±7001%2溶解酵素14,30014,600±3001%3緩激肽1,0601,090±102%4亮氨酸腦啡肽556592±63%Molarh/lassvs.Volume圖15分子量對洗脫體積圖，有四個明顯J.0X10-1H___ri.DxlO32?蛋白質(zhì)在各種應(yīng)用上，以量和是否有以往，在水相中用低角度光散射測量法（LALLS）受到溶劑大。而MAL的重現(xiàn)性結(jié)果。圖16卞匸匚（含O.05M的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行RI為Wyatt.0Optilab903,.流速為O.lmL/mi.n柱為ShodexKW-803和KW-804。雖然此樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，但MALLS仍很清楚地聚集現(xiàn)象，3.及其聚合體工業(yè)應(yīng)用中，決定蛋白質(zhì)的絕對特性不僅嚴(yán)格而且必要，例如在生蛋白質(zhì)為基質(zhì)的產(chǎn)品必須很純而且無任何聚集存在。。而測定蛋白質(zhì)的分子聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。匕工程LS的多測量大大降低了背景噪

顯示蛋白質(zhì)混合物的mall*｛純的物質(zhì)干干擾，并能提供完整的信

RI-。樣品在0』此現(xiàn)象在RI幾乎無法辨認(rèn)。擾相當(dāng)和良好aCl中，色譜檢測到3?分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學(xué)性質(zhì)的一個重要因素。采用多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS）與GPC/SEC系統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方法。標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用標(biāo)準(zhǔn)實用文案大全文案大全雖然也有其他確定分枝的方法，但都不能直接且需要眾多假設(shè)及“虛擬因子”。由傳統(tǒng)的RI或Viscometer（粘度檢測器）測定的高枝化分子的分子量與絕對值有很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測物成分相同的標(biāo)準(zhǔn)品作校正。若標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測物的成分或組分不同，則會產(chǎn)生很大的誤差。例如分子量相同的球形高分子的洗脫時間比無規(guī)則線團(tuán)狀分子要長。因為MALLS所求得分子量和大小為絕對值，因此計算分枝系數(shù)g不需要任何假設(shè)。M由MALLS直接所求得的分子大小會直接影響分枝率。對分子量相同的長鏈狀分子而言，其值越小，則分枝程度越大。分枝比的定義為分枝分子的旋轉(zhuǎn)半徑與長鏈分子的旋轉(zhuǎn)半徑之比，即g=<r2>/<門>由MALLS測得。Mbl圖17為由MALLS測得的分枝狀和長鏈形的高分子（PS）的旋轉(zhuǎn)半徑和分子量對照圖。由圖中可看出，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖18為r對Mw做圖。g1x10s1x101x10s1x106MolecularWeight1x10?

圖18旋轉(zhuǎn)半徑對分子量圖（分子構(gòu)型圖），可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構(gòu)型的變化。6.動力學(xué)/反應(yīng)速率MALLS還可以用于如抗原，抗體等反應(yīng)迅速的溶液系統(tǒng)，粒子和蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象的檢測。因為MALLS內(nèi)部同時裝有數(shù)個固定的檢測器，所以不需移動任何儀器硬件來掃描樣品，即可及時多方位同時捕捉反應(yīng)速率的現(xiàn)象。使用MALLS，可研究抗原-抗體反應(yīng)，反應(yīng)發(fā)生時就可決定聚集粒子的大小。當(dāng)改變溫度，濃度或催化劑時,MALLS可記錄下反應(yīng)發(fā)生時，分子的特殊變化。5￡J3503002502005￡J35030025020015010C450400ProteinMassvs.Concentrationoa020.4a.60.8Concent!stion(ntg7rnL)圖19濃度變化對蛋白聚集的影響MoarMassvs.Volume使用DAWN檢測器研究了濃度對分子量為75KD單分子蛋白質(zhì)聚集作用的影響。圖19描述了這種特殊蛋白質(zhì)從30ug/ml到1mg/ml范圍內(nèi)得到的濃度相關(guān)性。如圖所示,該蛋白質(zhì)在低濃度作為單一分子而在濃度大于700ug/ml時聚集為六聚體。該結(jié)果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術(shù)所得結(jié)合完全相符。MoarMassvs.Volumep站/日E勺-PAMcCCJAmbientPAMAmbientPAM圖20溫度變化對PMMA分子量和大小的影響7.低分子量的測定DAWNHELEOS或miniDAWNTREOS的固定光電二極管檢測器可以捕捉到很微弱的光散射信號，使得分子量的測定成為可能。使用DAWN系列標(biāo)準(zhǔn)配制的任何一款激光器，都可以輕易地測量分子量低于2000D的聚合物，并具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。由于DAWNHELEOS或miniDAWNTREOS具有三個以上的多角度同時捕捉散射信號的能力，即使極微弱的信號，如只比背景值略