microRNA解讀教學(xué)講解課件

2023/1/3非編碼RNA真核生物中存在兩種主要的非編碼RNA(non-codingRNA),在真核生物中發(fā)揮重要作用：一類為微小RNA(microRNA,miRNA),另一為小干擾RNA(siRNA)。miRNA大小為19~25nt,在體內(nèi)與蛋白質(zhì)形成核糖核蛋白復(fù)合體(miRNP),在真核基因的表達(dá)調(diào)控、生長發(fā)育中起重要作用。siRNA在RNA干擾(RNAinterference,RNAi)途徑中起定位特異mRNA的作用。2022/12/26非編碼RNA真核生物中存在兩種主要的非編編碼蛋白的基因2023/1/3非編碼RNA的基因2%20%60%98%98%人果蠅線蟲結(jié)核桿菌編碼蛋白的基因2022/12/26非編碼RNA的基因2%98

表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA。

非編碼RNA：是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子?？醇曳蔷幋aRNA：tRNA,rRNA調(diào)控非編碼RNA：長鏈非編碼RNA

（lncRNA）

短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）

Non-codingRNA表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及

非編碼RNA的功能

1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

2.調(diào)控轉(zhuǎn)錄

3.參與mRNA選擇性剪接

4.參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控過程

5.影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)

非編碼RNA的功能1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

近年來大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)修飾中扮演了重要的角色,能在基因組水平及染色體水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,決定細(xì)胞分化的命運(yùn)。非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)中的作用近年來大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)修飾中l(wèi)ncRNA（Longnon-codingRNA）轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的長鏈非編碼RNA分子；可在多個層面（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)；分類:正義(Sense)lncRNA反義(Antisense)lncRNA雙向(Bidirectional)lncRNA基因內(nèi)(Intronic)lncRNA基因間(Intergenic)lncRNAlncRNA（Longnon-codingRNA）轉(zhuǎn)錄lncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)；參與X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程；lncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)；1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；siRNA

siRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNA，它的長度一般為21~25nt。它在RNA干擾途徑中通過引導(dǎo)目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表達(dá)。siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果，這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項重要工具。也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。siRNAsiRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNSmallinterferingRNAs(siRNAs).AclassofdoublestrandedRNAs(dsRNAs)of~21nucleotidesinlength.siRNAsareproducedfromlongerdouble-stranded(bimolecular)RNAsorlonghairpins,oftenofexogenousorigin,andusuallytargethomologoussequencesatthesamelocusorelsewhereinthegenomefordestruction(genesilencing),thephenomenontermedRNAi.However,thedistinctionbetweenmiRNAsandsiRNAsisbecomingblurredasbothareproducedbysimilarpathwaysandhavesimilarmechanismsofaction.

siRNASmallinterferingRNAs(siRNAsmiRNA

概念：miRNA是長約21～25nt的單鏈RNA,其中50%定位于易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的染色體區(qū)域。特點：miRNA是內(nèi)源性的,是生物體基因的表達(dá)產(chǎn)物;miRNA是由不完整的發(fā)卡狀雙鏈RNA,經(jīng)Drosha和Dicer酶加工而成。miRNA

miRNA最開始的形成是源于內(nèi)源性的生物體基因產(chǎn)生的發(fā)卡結(jié)構(gòu),該發(fā)卡結(jié)構(gòu)在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)Drosha-DGCR8復(fù)合物加工產(chǎn)生pre-miRNA。然后pre-miRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步由Dicer酶切形成miRNA-miRNA二聚體，最后裝載至Argonaute蛋白1(AGO1)而發(fā)揮作用。miRNA目前研究表明:哺乳動物細(xì)胞內(nèi)miRNA的調(diào)控機(jī)制反映了miRNA的特異裝載蛋白AGO以及miRNA與mRNA之間的互補(bǔ)程度；

miRNA可通過調(diào)控組蛋白修飾引起染色質(zhì)重塑；

miRNA可通過調(diào)控DNA甲基化酶的表達(dá)而影響DNA甲基化。目前研究表明:piRNApiRNA是近年來在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為24～31nt的RNA分子,因在生理狀態(tài)下能與piwi蛋白偶聯(lián),故命名piRNA。由于Piwi為一表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子,能與PcG蛋白共同結(jié)合于基因組PcG應(yīng)答元件上,協(xié)助PcG沉默同源異型基因,因此推測與Piwi相關(guān)的piRNA也應(yīng)具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用piRNA

piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，能在u位點進(jìn)行切割形成piRNA反義鏈，piRNA反義鏈能與轉(zhuǎn)座子識別，并使切割后的轉(zhuǎn)座子與AGO3蛋白結(jié)合，從而進(jìn)一步對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行修飾切割，切割后的轉(zhuǎn)座子可以與piRNA前體結(jié)合，并且在U位點切割前體，從而使切割后的前體與piwi蛋白結(jié)合，進(jìn)過剪切修飾形成PiRNA和PiRNA與Piwi蛋白結(jié)合的復(fù)合體，從而使PiRNA數(shù)量增多。piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，非編碼RNA的比較種類長度（nt）來源主要功能siRNA~21~25

長雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄基因沉默miRNA~21~25

含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pri-miRNA轉(zhuǎn)錄基因沉默piRNA~24~31

長單鏈前體或起始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等多途徑生殖細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子的沉默lncRNA>200

多種途徑基因組印記和X染色體失活非編碼RNA的比較種類長度（nt）來源主要功能siRNA~結(jié)語：

非編碼RNA是生物體內(nèi)一個重要的調(diào)控分子家族，有人提出了“RNA世界”的概念。但是，迄今為止，對非編碼RNA的研究仍然是初步的，大部分功能尚未探明，主要原因是至今對它們在基因調(diào)控方面的作用還不清楚，同時非編碼RNA在細(xì)胞中是低豐度存在的，不易被檢測到。近來的一些研究顯示，非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的一些復(fù)合物中占有很大的比例，使人們意識到它們是重要的、有潛力的調(diào)控分子。我們相信對非編碼RNA的研究將日益受到重視，對其研究也將越來越深入，有更多種類的非編碼RNA分子將被發(fā)現(xiàn)，其功能也將逐步被闡明，非編碼RNA也必將在醫(yī)藥等實踐中得到廣泛的應(yīng)用。結(jié)語：2023/1/3細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的新途徑

----miRNA介導(dǎo)的基因沉默miRNA的發(fā)現(xiàn)miRNA的作用機(jī)制miRNA的應(yīng)用領(lǐng)域miRNA研究的技術(shù)路線2022/12/26細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的新途徑

----mi2023/1/31993年，VictorAmbros小組以線蟲為對象，用基因打靶技術(shù)研究某些基因?qū)ζ浒l(fā)育的影響。他們找到了一個對發(fā)育有明顯干擾的基因lin-4。通常線蟲要通過四個幼蟲階段才能成熟，lin-4基因的突變使其只停留在第一階段。。miRNA的發(fā)現(xiàn)microRNApioneer2022/12/261993年，VictorAmbros小2023/1/3令人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)

lin-4并非編碼一種調(diào)控蛋白，而編碼小RNA分子：22nt和61nt；序列分析顯示，22nt的小RNA分子是66nt（頸環(huán)結(jié)構(gòu)的5’臂部分）的一部分。Ambros和GaryRuvkun(Harvard)又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，22nt的lin-4能部分的和LIN-14mRNA的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合，所以他們推測，lin-4以類似反義RNA的作用機(jī)制通過與lin-14mRNA結(jié)合而下調(diào)LIN-14蛋白的表達(dá)。miRNA的發(fā)現(xiàn)LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993,75(5):843—8542022/12/26令人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)lin-4并非編2023/1/3Specifically,lin-4wasresponsiblefortheprogressiverepressionoftheproteinLIN-14duringlarvaldevelopmentoftheworm;mutantwormsdeficientinlin-4functionhadpersistentlyhighlevelsofLIN-14anddisplayeddevelopmentaltimingdefects.

在線蟲發(fā)育階段，Lin-4負(fù)責(zé)連續(xù)抑制LIN-14蛋白的表達(dá)在lin-4基因突變的線蟲中，LIN-14蛋白的濃度持續(xù)偏高，導(dǎo)致了線蟲的發(fā)育停留在第一階段。miRNA的發(fā)現(xiàn)2022/12/26Specifically,lin-42023/1/3In2000,anotherC.eleganssmallRNAregulatorymolecule,let-7,wascharacterizedbytheRuvkunlabandfoundtobeconservedinmanyspecies,includingvertebrates.ThesediscoveriesconfirmedthatAmbroshadinfactdiscoveredaclassofsmallRNAswithconservedsequenceandfunctions.ThesemoleculesarenowknownasmicroRNA.

miRNA的發(fā)現(xiàn)ReinhartBJ,SlackFJ,BassonM,etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature,2000,403(6772):901—906PasquinelliAE,ReinhartBJ,SlackF,etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature,2000,408(6808):86—89NorthernblotS1核酸酶作圖2022/12/26In2000,anotherC.2023/1/3miRNA的特征長度一般為19－25nt，是內(nèi)源性、非編碼、小分子單鏈RNA。一般來源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段；能通過與靶基因mRNA的側(cè)翼區(qū)域特異性配對結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。廣泛存在于在果蠅、軟體動物、魚類以及人等真核生物中。目前,人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400余種miRNA，可以調(diào)控人體中1/3基因的表達(dá)水平。部分miRNA基因以基因簇形式存在于基因組中，它們多以順反子的形式轉(zhuǎn)錄出前體轉(zhuǎn)錄本，再由Dicer切割前體的雙鏈部分而生成；相當(dāng)一部分miRNA位于基因的內(nèi)含子區(qū)域；植物的miRNA前體比動物的長約3倍；miRNA在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。2022/12/26miRNA的特征長度一般為19－25n2023/1/3miRNA的產(chǎn)生和功能在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前體轉(zhuǎn)錄本被RNaseIII核酸酶Drosha加工成約70-90nt的發(fā)夾狀pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)被DICER加工成成熟的miRNA雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA進(jìn)入一個核糖蛋白復(fù)合體miRNP(RISC)通過與靶基因的3’UTR區(qū)互補(bǔ)配對，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對靶基因mRNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制。miRNA基因序列pri-miRNApre-miRNADrosha成熟miRNADicer轉(zhuǎn)錄pre-miRNA細(xì)胞核出核細(xì)胞質(zhì)2022/12/26miRNA的產(chǎn)生和功能在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前2023/1/32022/12/262023/1/3miRNA與siRNA的區(qū)別miRNAsiRNA單雙鏈單鏈雙鏈前體70nt的ssRNA,莖-環(huán)結(jié)構(gòu)dsRNA作用部位靶mRNA的3’-UTR靶mRNA與靶序列配對不完全，最多配對8nt完全配對2022/12/26miRNA與siRNA的區(qū)別miRNAs2023/1/3Dicer是一種RNaseⅢ類核酸酶,RNaseⅢ酶的產(chǎn)物的特征是3′羥基和5′磷酸的核苷酸片段；miRNA并不是DICER生成的惟一產(chǎn)物,siRNA也是由Dicer剪切dsRNA而產(chǎn)生的。Dicer反應(yīng)生成miRNA和siRNA都需要ATP參與，在Dicer的氨基端有一個ATP依賴的螺旋酶結(jié)構(gòu)域。線蟲中，dcr-1（dicer）的突變體由于不能正確加工miRNA前體，生成成熟的miRNA，突變體始終在進(jìn)行類似干細(xì)胞那樣的不斷分裂，而不進(jìn)入下一個發(fā)育階段。2022/12/26Dicer是一種RNaseⅢ類核酸酶,R2023/1/3miRNA序列的保守性成熟miRNAs22個堿基中5′端的第2到8個核苷酸被稱為核心序列,它與靶基因序列的3′端UTR有很高的互補(bǔ)性。2----------82022/12/26miRNA序列的保守性成熟miRNAs2023/1/3miRNA的作用機(jī)制完全互補(bǔ)mRNA剪切降解不完全互補(bǔ)mRNA的翻譯受阻2022/12/26miRNA的作用機(jī)制完全互補(bǔ)mRNA剪切2023/1/3miRNA的調(diào)控特點交叉調(diào)節(jié)：動物miRNA與靶mRNA之間的不完全配對使得任何一個miRNA都可能作用于不同的mRNA，一個mRNA也可能受到多個不同miRNA的調(diào)節(jié)。自我調(diào)節(jié)：自我調(diào)節(jié)參與了miRNA的生物合成和功能。例如，參與miRNA生物合成的一些酶也受到其他產(chǎn)物miRNA的調(diào)節(jié)。Dcl1mRNA編碼一種植物Dicer蛋白，參與miRNA的生成，同時它也是miR2162的靶分子。可逆性調(diào)節(jié)：miRNA所致的翻譯抑制在某些條件下是可逆的。當(dāng)mRNA作為miRNA抑制的靶分子后，mRNA會被送至胞漿內(nèi)的P體（Pbodies）重新定位。2022/12/26miRNA的調(diào)控特點交叉調(diào)節(jié)：動物miR2023/1/3miRNA調(diào)節(jié)方式的優(yōu)點與蛋白水平的調(diào)節(jié)相比，更加節(jié)省能量；與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)相比，miRNA調(diào)節(jié)更迅速，而且是可逆的；內(nèi)含子所編碼的miRNA是一種對基因組資源的高效利用。2022/12/26miRNA調(diào)節(jié)方式的優(yōu)點與蛋白水平的調(diào)節(jié)2023/1/3microRNA基因組分布60%獨(dú)立表達(dá)15%成簇表達(dá)25%的miRNAs位于內(nèi)含子2022/12/26microRNA基因組分布60%獨(dú)立表達(dá)2023/1/3植物與動物miRNA的區(qū)別動物植物前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)短，簡單長，復(fù)雜，折回長度變異明顯加工過程先在細(xì)胞核，后在細(xì)胞質(zhì)僅在細(xì)胞核中作用機(jī)制大部分作為翻譯阻遏子，小部分導(dǎo)致靶mRNAs降解大部分介導(dǎo)靶mRNAs的降解長度22-23nt21nt保守性高更高2022/12/26植物與動物miRNA的區(qū)別動物植物前體莖2023/1/3miRNP與RISC都是一種核糖核蛋白（RNP）;二者的大小相近,miRNP約550kDa,RISC約500kDa;都含有PPD蛋白(人的miRNP含有EIF2C2，是一種PPD蛋白，果蠅的RISC中也含有PPD蛋白AGO-2)。PPD蛋白：具有PAZ和PiWi兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白。2022/12/26miRNP與RISC都是一種核糖核蛋白（2023/1/3應(yīng)用領(lǐng)域疾病治療miRNA干細(xì)胞研究病毒研究腫瘤研究植物研究動物研究2022/12/26應(yīng)用領(lǐng)域疾病治療miRNA干細(xì)胞研究病毒2023/1/3microRNA與腫瘤研究腫瘤發(fā)生：miRNA能作為腫瘤抑制劑或致癌因子行使功能，特定miRNA的敲除或過表達(dá)可用于研究miRNA在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中的作用；近年發(fā)現(xiàn)50％以上的miRNA基因定位于腫瘤相關(guān)的染色體座位或其脆性位點，直接或間接導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。腫瘤診斷：正常組織和腫瘤組織中miRNA表達(dá)明顯改變，這些特點使miRNA有可能成為腫瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)；慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中miR-15a和miR-16-1存在缺失或下調(diào)。癌旁組織相比，癌腫組織的miR一122表達(dá)是下降的。腫瘤治療：由于大多數(shù)致癌基因能夠引發(fā)癌癥，因而可以設(shè)計一些人造miRNA阻礙其表達(dá)，從而達(dá)到抑制癌癥形成的目的。體外實驗表明，let-7對多種人類肺癌組織有明顯抑制作用，移植到小鼠肺癌模型中，let-7作為鼻內(nèi)藥物能減少小鼠肺癌模型的腫瘤形成。2022/12/26microRNA與腫瘤研究腫瘤發(fā)生：mi2023/1/3miRNA與干細(xì)胞研究miRNAs在干細(xì)胞的自我更新、未分化狀態(tài)的維持、繼續(xù)分化增殖都有重要的調(diào)控作用。將miRNAs作用與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控等相結(jié)合，有助于全面了解干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能的分子機(jī)制。2022/12/26miRNA與干細(xì)胞研究miRNAs在干細(xì)2023/1/3miRNA與病毒研究miRNAs可以通過與病毒的靶mRNA結(jié)合，從而滅活RNA病毒；宿主細(xì)胞編碼miRNA對抗病毒感染的同時，病毒本身的基因組也可以編碼自己的miRNA攻擊宿主細(xì)胞的防御系統(tǒng)；2022/12/26miRNA與病毒研究miRNAs可以通過2023/1/3miRNA與植物研究miRNAs可以調(diào)控植物生長發(fā)育；如miR166能與轉(zhuǎn)錄因子ATHB15mRNA結(jié)合并直接切割，調(diào)節(jié)維管植物中維管組織的發(fā)育；介導(dǎo)植物對病毒、病菌的抗性；調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的耐受脅迫，如抗旱、抗鹽、抗嚴(yán)寒等。2022/12/26miRNA與植物研究miRNAs可以調(diào)控2023/1/3miRNA與動物研究miRNAs可以調(diào)控動物生長發(fā)育；介導(dǎo)動物細(xì)胞的增殖與凋亡；調(diào)節(jié)激素的分泌。2022/12/26miRNA與動物研究miRNAs可以調(diào)控2023/1/3miRNA的作用是多種多樣的，它既可以通過關(guān)閉一些關(guān)鍵基因來改變細(xì)胞的命運(yùn)，也可能與其靶基因產(chǎn)物相互作用，形成調(diào)節(jié)環(huán)與其他調(diào)節(jié)通路交織作用形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。大多數(shù)miRNA并非獨(dú)立作用，而是參與到復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；2022/12/26miRNA的作用是多種多樣的，它既可以通2023/1/3回收<200bp的小分子RNAAmbion公司：mirVanamiRNAIsolationKitRT-PCRqPCRNorthernBlot2022/12/26回收<200bp的小分子RNART-2023/1/3利用人工microRNAs對擬南芥DUF647

家族基因的特異沉默DUF647(Domainofunknownfunction)基因家族是擬南芥基因組中一個功能未知的基因家族,由基因AT1G13770、AT2G23470、AT2G31190、AT3G45890、AT5G01510和AT5G49820組成。

EMS誘變篩選已獲得了基因AT2G3l190和AT3G45890的突變體研究目標(biāo)：試圖通過人工微小RNAs(artificialmicroRNAs,amiRNAs)基因沉默技術(shù)得到這4個基因敲除的突變體

2022/12/26利用人工microRNAs對擬南芥DUF2023/1/3利用人工microRNAs對擬南芥DUF647

家族基因的特異沉默設(shè)計靶向基因的amiRNAs；重疊PCR合成含有所設(shè)計amiRNAs序列的amiRNA前體；將前體序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入擬南芥；卡那篩選

PCR檢測確認(rèn)基因組中含有amiRNAs；RT-PCR檢測到靶基因表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)基因株系，表現(xiàn)出了明顯的突變表型；2022/12/26利用人工microRNAs對擬南芥DUF2023/1/3非編碼RNA真核生物中存在兩種主要的非編碼RNA(non-codingRNA),在真核生物中發(fā)揮重要作用：一類為微小RNA(microRNA,miRNA),另一為小干擾RNA(siRNA)。miRNA大小為19~25nt,在體內(nèi)與蛋白質(zhì)形成核糖核蛋白復(fù)合體(miRNP),在真核基因的表達(dá)調(diào)控、生長發(fā)育中起重要作用。siRNA在RNA干擾(RNAinterference,RNAi)途徑中起定位特異mRNA的作用。2022/12/26非編碼RNA真核生物中存在兩種主要的非編編碼蛋白的基因2023/1/3非編碼RNA的基因2%20%60%98%98%人果蠅線蟲結(jié)核桿菌編碼蛋白的基因2022/12/26非編碼RNA的基因2%98

表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA。

非編碼RNA：是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子?？醇曳蔷幋aRNA：tRNA,rRNA調(diào)控非編碼RNA：長鏈非編碼RNA

（lncRNA）

短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）

Non-codingRNA表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及

非編碼RNA的功能

1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

2.調(diào)控轉(zhuǎn)錄

3.參與mRNA選擇性剪接

4.參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控過程

5.影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)

非編碼RNA的功能1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

近年來大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)修飾中扮演了重要的角色,能在基因組水平及染色體水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,決定細(xì)胞分化的命運(yùn)。非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)中的作用近年來大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)修飾中l(wèi)ncRNA（Longnon-codingRNA）轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的長鏈非編碼RNA分子；可在多個層面（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)；分類:正義(Sense)lncRNA反義(Antisense)lncRNA雙向(Bidirectional)lncRNA基因內(nèi)(Intronic)lncRNA基因間(Intergenic)lncRNAlncRNA（Longnon-codingRNA）轉(zhuǎn)錄lncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)；參與X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程；lncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)；1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；siRNA

siRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNA，它的長度一般為21~25nt。它在RNA干擾途徑中通過引導(dǎo)目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表達(dá)。siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果，這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項重要工具。也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。siRNAsiRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNSmallinterferingRNAs(siRNAs).AclassofdoublestrandedRNAs(dsRNAs)of~21nucleotidesinlength.siRNAsareproducedfromlongerdouble-stranded(bimolecular)RNAsorlonghairpins,oftenofexogenousorigin,andusuallytargethomologoussequencesatthesamelocusorelsewhereinthegenomefordestruction(genesilencing),thephenomenontermedRNAi.However,thedistinctionbetweenmiRNAsandsiRNAsisbecomingblurredasbothareproducedbysimilarpathwaysandhavesimilarmechanismsofaction.

siRNASmallinterferingRNAs(siRNAsmiRNA

概念：miRNA是長約21～25nt的單鏈RNA,其中50%定位于易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的染色體區(qū)域。特點：miRNA是內(nèi)源性的,是生物體基因的表達(dá)產(chǎn)物;miRNA是由不完整的發(fā)卡狀雙鏈RNA,經(jīng)Drosha和Dicer酶加工而成。miRNA

miRNA最開始的形成是源于內(nèi)源性的生物體基因產(chǎn)生的發(fā)卡結(jié)構(gòu),該發(fā)卡結(jié)構(gòu)在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)Drosha-DGCR8復(fù)合物加工產(chǎn)生pre-miRNA。然后pre-miRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步由Dicer酶切形成miRNA-miRNA二聚體，最后裝載至Argonaute蛋白1(AGO1)而發(fā)揮作用。miRNA目前研究表明:哺乳動物細(xì)胞內(nèi)miRNA的調(diào)控機(jī)制反映了miRNA的特異裝載蛋白AGO以及miRNA與mRNA之間的互補(bǔ)程度；

miRNA可通過調(diào)控組蛋白修飾引起染色質(zhì)重塑；

miRNA可通過調(diào)控DNA甲基化酶的表達(dá)而影響DNA甲基化。目前研究表明:piRNApiRNA是近年來在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為24～31nt的RNA分子,因在生理狀態(tài)下能與piwi蛋白偶聯(lián),故命名piRNA。由于Piwi為一表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子,能與PcG蛋白共同結(jié)合于基因組PcG應(yīng)答元件上,協(xié)助PcG沉默同源異型基因,因此推測與Piwi相關(guān)的piRNA也應(yīng)具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用piRNA

piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，能在u位點進(jìn)行切割形成piRNA反義鏈，piRNA反義鏈能與轉(zhuǎn)座子識別，并使切割后的轉(zhuǎn)座子與AGO3蛋白結(jié)合，從而進(jìn)一步對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行修飾切割，切割后的轉(zhuǎn)座子可以與piRNA前體結(jié)合，并且在U位點切割前體，從而使切割后的前體與piwi蛋白結(jié)合，進(jìn)過剪切修飾形成PiRNA和PiRNA與Piwi蛋白結(jié)合的復(fù)合體，從而使PiRNA數(shù)量增多。piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，非編碼RNA的比較種類長度（nt）來源主要功能siRNA~21~25

長雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄基因沉默miRNA~21~25

含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pri-miRNA轉(zhuǎn)錄基因沉默piRNA~24~31

長單鏈前體或起始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等多途徑生殖細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子的沉默lncRNA>200

多種途徑基因組印記和X染色體失活非編碼RNA的比較種類長度（nt）來源主要功能siRNA~結(jié)語：

非編碼RNA是生物體內(nèi)一個重要的調(diào)控分子家族，有人提出了“RNA世界”的概念。但是，迄今為止，對非編碼RNA的研究仍然是初步的，大部分功能尚未探明，主要原因是至今對它們在基因調(diào)控方面的作用還不清楚，同時非編碼RNA在細(xì)胞中是低豐度存在的，不易被檢測到。近來的一些研究顯示，非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的一些復(fù)合物中占有很大的比例，使人們意識到它們是重要的、有潛力的調(diào)控分子。我們相信對非編碼RNA的研究將日益受到重視，對其研究也將越來越深入，有更多種類的非編碼RNA分子將被發(fā)現(xiàn)，其功能也將逐步被闡明，非編碼RNA也必將在醫(yī)藥等實踐中得到廣泛的應(yīng)用。結(jié)語：2023/1/3細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的新途徑

----miRNA介導(dǎo)的基因沉默miRNA的發(fā)現(xiàn)miRNA的作用機(jī)制miRNA的應(yīng)用領(lǐng)域miRNA研究的技術(shù)路線2022/12/26細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的新途徑

----mi2023/1/31993年，VictorAmbros小組以線蟲為對象，用基因打靶技術(shù)研究某些基因?qū)ζ浒l(fā)育的影響。他們找到了一個對發(fā)育有明顯干擾的基因lin-4。通常線蟲要通過四個幼蟲階段才能成熟，lin-4基因的突變使其只停留在第一階段。。miRNA的發(fā)現(xiàn)microRNApioneer2022/12/261993年，VictorAmbros小2023/1/3令人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)

lin-4并非編碼一種調(diào)控蛋白，而編碼小RNA分子：22nt和61nt；序列分析顯示，22nt的小RNA分子是66nt（頸環(huán)結(jié)構(gòu)的5’臂部分）的一部分。Ambros和GaryRuvkun(Harvard)又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，22nt的lin-4能部分的和LIN-14mRNA的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合，所以他們推測，lin-4以類似反義RNA的作用機(jī)制通過與lin-14mRNA結(jié)合而下調(diào)LIN-14蛋白的表達(dá)。miRNA的發(fā)現(xiàn)LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993,75(5):843—8542022/12/26令人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)lin-4并非編2023/1/3Specifically,lin-4wasresponsiblefortheprogressiverepressionoftheproteinLIN-14duringlarvaldevelopmentoftheworm;mutantwormsdeficientinlin-4functionhadpersistentlyhighlevelsofLIN-14anddisplayeddevelopmentaltimingdefects.

在線蟲發(fā)育階段，Lin-4負(fù)責(zé)連續(xù)抑制LIN-14蛋白的表達(dá)在lin-4基因突變的線蟲中，LIN-14蛋白的濃度持續(xù)偏高，導(dǎo)致了線蟲的發(fā)育停留在第一階段。miRNA的發(fā)現(xiàn)2022/12/26Specifically,lin-42023/1/3In2000,anotherC.eleganssmallRNAregulatorymolecule,let-7,wascharacterizedbytheRuvkunlabandfoundtobeconservedinmanyspecies,includingvertebrates.ThesediscoveriesconfirmedthatAmbroshadinfactdiscoveredaclassofsmallRNAswithconservedsequenceandfunctions.ThesemoleculesarenowknownasmicroRNA.

miRNA的發(fā)現(xiàn)ReinhartBJ,SlackFJ,BassonM,etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature,2000,403(6772):901—906PasquinelliAE,ReinhartBJ,SlackF,etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature,2000,408(6808):86—89NorthernblotS1核酸酶作圖2022/12/26In2000,anotherC.2023/1/3miRNA的特征長度一般為19－25nt，是內(nèi)源性、非編碼、小分子單鏈RNA。一般來源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段；能通過與靶基因mRNA的側(cè)翼區(qū)域特異性配對結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。廣泛存在于在果蠅、軟體動物、魚類以及人等真核生物中。目前,人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400余種miRNA，可以調(diào)控人體中1/3基因的表達(dá)水平。部分miRNA基因以基因簇形式存在于基因組中，它們多以順反子的形式轉(zhuǎn)錄出前體轉(zhuǎn)錄本，再由Dicer切割前體的雙鏈部分而生成；相當(dāng)一部分miRNA位于基因的內(nèi)含子區(qū)域；植物的miRNA前體比動物的長約3倍；miRNA在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。2022/12/26miRNA的特征長度一般為19－25n2023/1/3miRNA的產(chǎn)生和功能在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前體轉(zhuǎn)錄本被RNaseIII核酸酶Drosha加工成約70-90nt的發(fā)夾狀pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)被DICER加工成成熟的miRNA雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA進(jìn)入一個核糖蛋白復(fù)合體miRNP(RISC)通過與靶基因的3’UTR區(qū)互補(bǔ)配對，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對靶基因mRNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制。miRNA基因序列pri-miRNApre-miRNADrosha成熟miRNADicer轉(zhuǎn)錄pre-miRNA細(xì)胞核出核細(xì)胞質(zhì)2022/12/26miRNA的產(chǎn)生和功能在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前2023/1/32022/12/262023/1/3miRNA與siRNA的區(qū)別miRNAsiRNA單雙鏈單鏈雙鏈前體70nt的ssRNA,莖-環(huán)結(jié)構(gòu)dsRNA作用部位靶mRNA的3’-UTR靶mRNA與靶序列配對不完全，最多配對8nt完全配對2022/12/26miRNA與siRNA的區(qū)別miRNAs2023/1/3Dicer是一種RNaseⅢ類核酸酶,RNaseⅢ酶的產(chǎn)物的特征是3′羥基和5′磷酸的核苷酸片段；miRNA并不是DICER生成的惟一產(chǎn)物,siRNA也是由Dicer剪切dsRNA而產(chǎn)生的。Dicer反應(yīng)生成miRNA和siRNA都需要ATP參與，在Dicer的氨基端有一個ATP依賴的螺旋酶結(jié)構(gòu)域。線蟲中，dcr-1（dicer）的突變體由于不能正確加工miRNA前體，生成成熟的miRNA，突變體始終在進(jìn)行類似干細(xì)胞那樣的不斷分裂，而不進(jìn)入下一個發(fā)育階段。2022/12/26Dicer是一種RNaseⅢ類核酸酶,R2023/1/3miRNA序列的保守性成熟miRNAs22個堿基中5′端的第2到8個核苷酸被稱為核心序列,它與靶基因序列的3′端UTR有很高的互補(bǔ)性。2----------82022/12/26miRNA序列的保守性成熟miRNAs2023/1/3miRNA的作用機(jī)制完全互補(bǔ)mRNA剪切降解不完全互補(bǔ)mRNA的翻譯受阻2022/12/26miRNA的作用機(jī)制完全互補(bǔ)mRNA剪切2023/1/3miRNA的調(diào)控特點交叉調(diào)節(jié)：動物miRNA與靶mRNA之間的不完全配對使得任何一個miRNA都可能作用于不同的mRNA，一個mRNA也可能受到多個不同miRNA的調(diào)節(jié)。自我調(diào)節(jié)：自我調(diào)節(jié)參與了miRNA的生物合成和功能。例如，參與miRNA生物合成的一些酶也受到其他產(chǎn)物miRNA的調(diào)節(jié)。Dcl1mRNA編碼一種植物Dicer蛋白，參與miRNA的生成，同時它也是miR2162的靶分子?？赡嫘哉{(diào)節(jié)：miRNA所致的翻譯抑制在某些條件下是可逆的。當(dāng)mRNA作為miRNA抑制的靶分子后，mRNA會被送至胞漿內(nèi)的P體（Pbodies）重新定位。2022/12/26miRNA的調(diào)控特點交叉調(diào)節(jié)：動物miR2023/1/3miRNA調(diào)節(jié)方式的優(yōu)點與蛋白水平的調(diào)節(jié)相比，更加節(jié)省能量；與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)相比，miRNA調(diào)節(jié)更迅速，而且是可逆的；內(nèi)含子所編碼的miRNA是一種對基因組資源的高效利用。2022/12/26miRNA調(diào)節(jié)方式的優(yōu)點與蛋白水平的調(diào)節(jié)2023/1/3microRNA基因組分布60%獨(dú)立表達(dá)15%成簇表達(dá)25%的miRNAs位于內(nèi)含子2022/12/26microRNA基因組分布60%獨(dú)立表達(dá)2023/1/3植物與動物miRNA的區(qū)別動物植物前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)短，簡單長，復(fù)雜，折回長度變異明顯加工過程先在細(xì)胞核，后在細(xì)胞質(zhì)僅在細(xì)胞核中作用機(jī)制大部分作為翻譯阻遏子，小部分導(dǎo)致靶mRNAs降解大部分介導(dǎo)靶mRNAs的降解長度22-23nt21nt保守性高更高2022/12/26植物與動物miRNA的區(qū)