基因工程大實(shí)驗(yàn)

基因工程大實(shí)驗(yàn)專業(yè)：生物技術(shù)授課教師：恩和、邰麗華目錄實(shí)驗(yàn)一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、堿變性法抽提質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)四、DNA的純度、濃度及分子量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)五、DNA的酶切、連接與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)六、動(dòng)物基因組DNA的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)七、植物基因組DNA的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)----隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析實(shí)驗(yàn)四、DNA的純度、濃度

及分子量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)學(xué)習(xí)掌握凝膠成像系統(tǒng)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用方法相關(guān)知識(shí)及原理瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)DNA分子的大小和構(gòu)型質(zhì)粒構(gòu)型：cccDNA

L-DNAOC-DNA儀器、材料和試劑儀器瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)材料

pUC18試劑

DNAMarkerTAE/TBE緩沖液點(diǎn)樣緩沖液溴化乙錠（EB）

瓊脂糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

計(jì)算DNA濃度、純度濃度計(jì)算：OD260=1DNA濃度=50ng/mlDNA的濃度=稀釋倍數(shù)(350)×OD260×50

純度計(jì)算：OD260/OD280＜1.9蛋白多

OD260/OD280＞2RNA多

在紫外燈（360nm，312nm或254nm）下觀察染色后的電泳凝膠操作步驟DNA的濃度、純度測(cè)定（1）稀釋DNA(350倍)

10μlDNA+3490μlTE

（2）紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

用TE作對(duì)照，石英比色皿（3）濃度計(jì)算：OD260=1時(shí)

DNA的濃度=50μg/mlDNA的濃度=稀釋倍數(shù)(350)×OD260×50

純度計(jì)算：OD260/OD280操作步驟DNA分子量測(cè)定（1）瓊脂糖凝膠的制備取0.7g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加100ml0.5倍TBE/TAE緩沖液，置微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為0.7%瓊脂糖凝膠。待凝膠冷卻至60℃，加入EB，使終濃度為0.5μg/ml。

操作步驟（2）膠板的制備①將有機(jī)玻璃內(nèi)槽、梳子等洗凈烘干。②將有機(jī)玻璃放置于凝膠槽內(nèi)，并放好梳子。③將60℃左右的瓊脂糖凝膠液緩慢而連續(xù)地倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠板（注意：若有氣泡產(chǎn)生，用小槍頭吸出）。操作步驟

④待膠凝固后，取出梳子（豎直、迅速拔出），取有機(jī)玻璃內(nèi)槽（帶膠板），放在電泳槽內(nèi)。⑤加電泳緩沖液至稍沒(méi)過(guò)膠面（不要太多或太少）。（3）加樣①用移液槍將樣品DNA與上樣緩沖液混勻。

操作步驟

②將吸有混合液的槍頭緩慢插入加樣孔液面以下，緩慢將液體加入（注意：加樣后槍頭離開(kāi)液面后再松開(kāi)槍）。注意：記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量（4）電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源（DNA帶負(fù)電）。②當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距膠前沿1—2cm處，停止電泳。實(shí)驗(yàn)八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)——

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)學(xué)習(xí)掌握PCR儀的使用方法相關(guān)知識(shí)及原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。操作步驟1、在0.2mLEppendorf管內(nèi)配置20μL反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積/μLddH2O1210×PCR緩沖2.02.5mmol/LdNTP2.0

隨機(jī)引物1.0

模版DNA2.0

Taq酶1.0（1U）點(diǎn)動(dòng)混勻，加10μL礦物油。操作步驟2、按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)條件：（1）94oC預(yù)變性4min；（2）94oC變性30sec；（3）36oC退火40sec；（4）72oC延伸100s；（5）重復(fù)步驟（2）?（4）35次；（6）72oC延伸7min。操作步驟3、瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果配置1.4%瓊脂糖凝膠，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)六、動(dòng)物基因組DNA

的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)掌握從動(dòng)物組織提取基因組

DNA的原理和方法，以及相對(duì)分子質(zhì)量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。相關(guān)知識(shí)及原理

在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得到哺乳動(dòng)物基因組DNA，用此方法得到的

DNA長(zhǎng)度為100?150kb，適用于λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)和Southern分析。儀器、材料和試劑儀器臺(tái)式離心機(jī)玻璃勻漿器高壓滅菌鍋恒溫水浴器材料兔肝試劑蛋白酶K

組織勻漿液酶解液

RNA酶

TE溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取的DNA應(yīng)為一條帶實(shí)驗(yàn)七、植物基因組DNA

的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握從植物組織中提取DNA的方法學(xué)習(xí)掌握液氮的使用相關(guān)知識(shí)及原理

利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白變性而沉淀下來(lái)。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿提取的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。儀器、材料和試劑儀器低溫離心機(jī)恒溫水浴器臺(tái)式離心機(jī)瓊脂糖凝膠系統(tǒng)材料

試劑

CTAB提取緩沖液

TE實(shí)驗(yàn)步驟

CTAB提取法：（1）稱取0.5克植物材料放入預(yù)冷至-20℃的研缽中（提前滅菌），加入少量石英沙，再倒入液氮

(分批加入)，研成粉末狀，置于滅菌的10ml離心管中。（2）加入2ml65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液充分混勻后在65℃保溫90min;

實(shí)驗(yàn)步驟

CTAB提取緩沖液:2%（w/v）十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）:1.4MNaCl；20mMEDTApH8.0；

100MmTris-HClpH8.0；

2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；

5%（v/v）巰基乙醇（使用前加入）（3）加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）充分搖勻后，4℃6000r/min離心15min。實(shí)驗(yàn)步驟（4）用擴(kuò)口吸頭取上清液移入另一10ml離心管中，加入2/3體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒搖勻后，-20℃放置20min,在冷凍離心機(jī)上于

4℃5000r/min離心10min,緩慢傾倒出上清液。（5）在沉淀中加入1ml65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，溫浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等體積氯仿：異戊醇，充分混勻，4℃6000r/min離心

10min。實(shí)驗(yàn)步驟（6）重復(fù)第4步；（7）用70%乙醇洗沉淀兩次，在室溫晾干，加入200μlTE緩沖液溶解DNA2h。（8）配制0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分析，取

5μl的樣品電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取的DNA應(yīng)為靠近點(diǎn)樣孔的一條帶，操作步驟1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于4ml勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無(wú)明顯組織塊存在（冰浴操作）。2、將組織細(xì)胞移至10ml離心管中,4℃4000rpm離心1.5min,棄上清。3、沉淀加1ml無(wú)菌水迅速吹散，再加1ml酶解液，翻轉(zhuǎn)混勻（動(dòng)作一定要輕）55℃水浴處理12?18h。操作步驟4、加RNase至終濃度100μg/m（222μl）,37℃水浴2h。5、加入等體積酚(約2ml)抽提一次，（慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，水平搖床搖10min），4℃8000rpm離心10min。6、用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的水相（注意勿吸出雙相界面蛋白層），加等體積(約2ml)氯仿：異戊醇（24：1）4℃10min,8000rpm離心

10min。（有時(shí)如果DNA含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀察）操作步驟7、用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，移入

10ml離心管，加入250μl5mol/lNaCI(終濃度0.1---0.25mol/l),小心混勻（要充分），在向每管中加入2.5倍體積(約6ml)的無(wú)水乙醇-20℃2h。8、12000rpm離心15min，棄上清，70%冷乙醇洗滌一次，12000rpm離心15min，室溫干燥，加入100μlTE緩沖液，輕搖混勻，存放4℃

過(guò)夜（或2h）。9、電泳鑒定（0.7%的瓊脂糖凝膠）。儀器、材料和試劑儀器

PCR儀瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)材料兔基因組DNA

隨機(jī)引物試劑

PCR緩沖（10×）

dNTPTaq酶礦物油實(shí)驗(yàn)五、

DNA的酶切、連接

與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握重組DNA連接以及鑒定重組子的方法。學(xué)習(xí)掌握X-gal等試劑的配制保存。相關(guān)知識(shí)及原理重組子T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng):

（1）酶+ATP=酶-AMP復(fù)合物（2）酶-AMP復(fù)合物結(jié)合DNA切口上，使

DNA腺苷化（3）形成新的磷酸二酯鍵，封閉切口藍(lán)白斑選擇（Xgal

、IPTG）、α互補(bǔ)儀器、材料和試劑儀器電熱恒溫水浴臺(tái)式/低溫離心機(jī)恒溫?fù)u床恒溫培養(yǎng)箱恒溫水浴材料

DH5α、TOP10pUC18/19

植物DNA試劑

X-galIPTG

BamHIT4DNA連接酶操作步驟制備重組DNA（1）在滅菌的Eppendorf管（0.5ml）中,加入15μlpUC18,2μl酶切緩沖液，1μl（2U）BamHI酶,2μlBSA

（酶和緩沖液放在冰上),混合物總體積20μl，離心混勻，37℃反應(yīng)3h。（2）在另一無(wú)菌管中，加入植物DNA1.5μg，1μl

酶切緩沖液，1μl（2U）BamHI酶,2μlBSA

，無(wú)菌水6.5μl，混合物總體積10μl,離心混勻，37℃反應(yīng)3h。操作步驟（3）各取2μl酶解液做電泳分析。（4）剩余酶解液加入1/10體積的3mol/lKAc(PH5.2)

溶液，再加2倍體積的無(wú)水乙醇，置-20℃冰箱2h（沉淀DNA）。12000rpm4℃離心15min,

棄上清，加70%乙醇洗沉淀物，再離心，去上清，倒置干燥，加5μlTE溶液溶解。(替代方案：剩余酶解液65℃,保溫15min)操作步驟（5）將酶切后的2個(gè)DNA片段混合于一管中，加T4DNA

連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl，14℃

保溫14h。（6）制備感受態(tài)細(xì)胞（Top10）。（7）同時(shí)制備含100μg/ml氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻，培養(yǎng)基（90mm）中央滴加

40μl2%X-gal和7μl20%IPTG(Top10不加)，用無(wú)菌涂棒使之均勻涂布于培養(yǎng)基表面，然后37℃

溫浴直至液體全部消失。操作步驟（8）轉(zhuǎn)化第一組：5μl(50ng)重組子+200μl感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。第二組：5μl無(wú)菌水+200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液。（9）實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別取80μl懸液均勻涂布在含

X-gal、Amp的固體LB培養(yǎng)基和含Amp的固體LB培養(yǎng)基上；再取40μl懸液均勻涂布普通固體LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果含X-gal、Amp的固體LB培養(yǎng)基白色菌落（重組子）和蘭色菌落（pUC18）蘭色菌落（pUC18）或無(wú)菌落含Amp的固體LB培養(yǎng)基有菌落無(wú)菌落普通固體LB培養(yǎng)基有菌落無(wú)菌落成功成功成功失敗成功失敗實(shí)驗(yàn)一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵苽涓惺軕B(tài)細(xì)胞的的意義掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法和技術(shù)掌握感受態(tài)細(xì)胞的保存方法相關(guān)知識(shí)及原理感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞原理：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl2

等化學(xué)試劑法或電擊法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞基本方法：細(xì)菌經(jīng)0℃的低滲CaCl2處理，使細(xì)菌處于感受態(tài)，然后加入甘油-70℃條件下保存

儀器、材料和試劑

材料

大腸桿菌DH5αTOP10試劑

0.1mol／L

CaCl2溶液

LB培養(yǎng)基（液態(tài)）儀器超凈工作臺(tái)電熱恒溫水浴分光光度計(jì)低溫離心機(jī)制冰機(jī)

操作步驟

（1）從DH5α(或TOP10)菌平板上挑取一單落，接種于15mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右。（2）取該菌懸液150μl轉(zhuǎn)接于15mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2h左右（OD600≤0.5）（3）將菌液轉(zhuǎn)移到10ml離心管（每管8ml），放冰上10min。（4）離心10min（4000r/min），回收細(xì)胞（從這一步開(kāi)始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）。（5）倒凈上清培養(yǎng)液(倒置1min)，用1.6ml冰冷的

0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，立即放在冰上30min。

（6）4℃離心10min（5000r/min），棄上清液，回收細(xì)胞。操作步驟操作步驟（7）用320ul冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，立即放在冰上。（8）分裝細(xì)胞，每管170ul細(xì)胞懸液再加30ul甘油（滅菌）。（9）作標(biāo)記，-70℃保存。實(shí)驗(yàn)二、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

及轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆崭惺軕B(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基本知識(shí)掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法了解感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的的意義相關(guān)知識(shí)及原理轉(zhuǎn)化原理:轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃

短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。轉(zhuǎn)化是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系,使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化方法：熱擊法、電轉(zhuǎn)化法儀器、材料和試劑儀器無(wú)菌超凈臺(tái)電熱恒溫水浴分光光度計(jì)低溫離心機(jī)微型離心管移液器材料

感受態(tài)細(xì)胞

pUC18、pUC19試劑

CaCl2溶液（0.1mol／L）

LB培養(yǎng)基氨芐青霉素操作步驟（1）分別取2個(gè)200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液第一組——轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組：

0.5μl(50ng)pUC18/pUC19+200μl感受態(tài)細(xì)胞第二組——受體菌對(duì)照組：

0.5μl無(wú)菌水+200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液（2）將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min，于

42℃水浴中保溫1.5min，然后迅速冰上冷卻

2min。操作步驟（3）立即向上述管中分別加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到1ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約1.5h（170rpm）。（4）取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基和普通LB平板培養(yǎng)基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過(guò)后稍微涼一下再用，不要過(guò)燙）。（5）菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(12-16小時(shí))，出現(xiàn)菌落。操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果含抗生素LB平板培養(yǎng)基第一組有菌落，第二組無(wú)菌落第一組、第二組均無(wú)或有菌落普通LB平板培養(yǎng)基第一組、第二組均無(wú)菌落第一組、第二組均有菌落

成功失敗失敗成功實(shí)驗(yàn)一、堿變性法提取

質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識(shí)及原理儀器、材料和試劑操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法和技能；學(xué)習(xí)掌握質(zhì)粒DNA濃度、純度的檢測(cè)方法；學(xué)習(xí)掌握瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法；相關(guān)知識(shí)及原理堿裂解法提取法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。pH介于12.0—12.5范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋解開(kāi)變性；質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)斷，但兩鏈彼此盤繞。當(dāng)恢復(fù)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確；線性染色體DNA復(fù)性不迅速