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文檔簡介
核酸含量測定定磷法1核酸定量測定常見的方法1.定磷法:將核酸消化,測定其無機磷量,由此計算出核酸含量,反應(yīng)靈敏。2.紫外吸收法:利用核酸在260nm處有吸收高峰,操作簡便,受蛋白質(zhì)和核苷酸的干擾影響。3.地衣酚法:用于測定RNA的含量,RNA與濃鹽酸共熱,降解形成的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?,利用地衣酚反?yīng)來測定,特異性差,戊糖均有此反應(yīng)。4.二苯胺法:DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉(zhuǎn)化為ω-羥-γ-酮基戊醛,利用二苯胺試劑反應(yīng),除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應(yīng)。2定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷,利用定磷試劑測定無機磷量。反應(yīng)式為:(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O
H3P(Mo3O10)4Mo2O3?
MoO3(鉬藍)Vit?C3
還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值,當(dāng)無機磷含量在1—25μg范圍內(nèi),光吸收和含磷量成正比。
RNA的含磷量為9.5%,即1μgRNA磷相當(dāng)于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。4試劑酵母RNA樣品溶液:2000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)磷原液:含磷量為1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)磷溶液:含磷量為10μg/mL,每組用干試管取15mL定磷試劑:含硫酸、鉬酸銨、Vit.C,淺黃色,如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL5實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化,將有機磷轉(zhuǎn)化成無機磷;2.制定定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線;3.測定回收率和樣品總磷量。61.樣品消化(每兩組或三組做一份)消化管123RNA/mL010標(biāo)準(zhǔn)磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮爐中消化2—6h至溶液無色透明,冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min(分解焦磷酸),冷卻用dH2O定容/mL505050混勻72.定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定(每人做一份)
每人取18支試管,按照下表平行操作:
1
234
5
6標(biāo)準(zhǔn)磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL1.51.51.51.51.51.5用漩渦混合器混勻,45℃恒溫水浴保溫25分鐘用去離子水作為空白,660nm測定吸光值A(chǔ)660(1)A660(2)A660平均值A(chǔ)660平均值—空白08
3.測定總磷量和回收率(與2同時進行)7(空白)
8(樣品)9(標(biāo)準(zhǔn))定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷試劑/mL1.51.51.5用漩渦混合器混勻,45℃恒溫水浴保溫25分鐘A660(1)A660(2)A660平均值A(chǔ)660平均值—空白09數(shù)據(jù)處理關(guān)于空白:1—6號管用于繪制定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線,1號管作為空白。7—9號管用于樣品及回收率的測定,7號管作為空白。以每管含磷量(μg)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)畫標(biāo)準(zhǔn)曲線,直線應(yīng)過原點。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品(x)和標(biāo)準(zhǔn)磷(y)的含磷量(μg)。10計算回收率:
(2)計算樣品總磷量:
(3)計算RNA量:
(4)樣品RNA含量:11操作注意事項1.每人獨立操作,不允許兩人穿插取樣;2.要求試劑及所有器皿清潔,不含磷;3.每管加樣和測定均要求平行操作;4.消化溶液定容后務(wù)必上下顛倒混勻后再取樣;5.各種試劑必須用移液管按順序準(zhǔn)確量取,移液管口用吸水紙擦凈,溶液盡量加到試管下部,標(biāo)準(zhǔn)溶液要求用差量法。6.漩渦混合器的使用:用點動檔,試管豎直或稍傾斜垂直向下用力。7.測定吸光值時,用一個比色杯裝去離子水調(diào)節(jié)分光光度計零點,另一個比色杯按照從低濃度到高濃度的順序測定,不用潤洗,切忌甩比色杯,將藍色溶液撒在儀器和地面上。
12思考題1.回收率的意義;2
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