RNA提取及常見失敗原因

探討基因的表達(dá)和調(diào)控時，須要從組織或細(xì)胞中分別純化RNA。RNA質(zhì)量的凹凸常常影響RT-PCR、cDNA庫構(gòu)建和NorthernBlot等分子生物學(xué)試驗的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能快速裂開細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。目的主要試劑1.Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，留意操作。2.RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，留意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)；3.細(xì)胞裂解必需充分且操作快速。裂解不完全會降低最終得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。4.酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并猛烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。2-8℃避光保存一年。準(zhǔn)備工作RNA酶（Rnase）是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶特殊穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可短暫失活，但限制因素去除后又快速復(fù)原活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使全部的Rnase完全失活。1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必需戴手套。2.RNase的又一污染源是取液器。依據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理。一般狀況下接受以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求。3.塑料制品、玻璃和金屬物品的處理（1）塑料制品：盡量運用一次性無菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒有開封運用過，通常不必再處理。

處理的步驟如下：在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中當(dāng)心運用）將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的全部部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃或室溫下處理過夜。將DEPC-H2O當(dāng)心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC-H2O處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。滅菌塑料制品烘烤干燥，置干凈處備用。

（2）

玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上。

DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而運用時需當(dāng)心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后猛烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消退殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。DEPC(二乙基焦碳酸酯)試驗步驟如下：1.取50~100mg的組織,加入1mlTrizol試劑，用勻漿器打勻(Trizol先放于冰上)。2.將勻漿室溫放置5min。3.加入200μl氯仿,猛烈震蕩混勻30s，冰上靜置3min。4.12000rpm，4℃離心15min。5.將上清液當(dāng)心轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中（取400μl），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15min。（此步中留意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。）6.12000rpm，4℃離心15min。7.當(dāng)心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。8.用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時RNA是不溶解的）9.8000rpm，室溫離心10min。10.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失。11.真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉。12.沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如發(fā)覺沉淀難溶，68℃處理10min。13.RNA檢測(1)測定樣品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/mlRNA計算RNA的產(chǎn)量。OD260/OD280在1.8-2.0。(2)進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染狀況。

28S—18S—5S—低得率A．樣品裂解或勻漿處理不徹底B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65A．檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280值會較高。B．樣品勻漿時加的試劑量太少。C．勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。D．水相中混有有機(jī)相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。R