基因診斷與基因治療

第二十一章基因診斷與基因治療1第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）亦稱分子診斷、DNA診斷。采用分子生物學的技術方法來分析受檢者的某一特定基因的結構（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來對相應的疾病進行診斷。2二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理

檢測相關基因的結構及其表達功能特別是RNA產物是否正常

2基因診斷的方法 （1）DNA診斷 （2）RNA診斷3（1）DNA診斷

1）限制性片段長度多態(tài)性2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）單鏈構象多態(tài)性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA診斷1）RNA印跡（Northernblot）2)RT-PCR41）限制性片段長度多態(tài)性 —基因連鎖分析（1）方法原理：

待測DNA序列中的點突變導致了某一限制性內切酶識別位點的改變可引起其特異的限制性內切酶片段的大小與多少隨之改變，即而通過Southern印跡雜交和限制性內切酶酶譜分析診斷出點突變。56（2）診斷原理

在人群中，個體間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性可以改變限制性內切酶的切割位點，產生DNA限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。67

RFLP按照孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某一種致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種遺傳性標志來判斷家族成員或胎兒的基因組中是否攜帶致病基因。7889（2）應用A

sickle-cellanemia的基因診斷a.

病因血紅蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常為谷氨酸，貧血時突變?yōu)轭R氨酸。9101234561011b.檢測限制性內切切酶：Sau1酶切位點：：CCTNAGG探針：標標記的β珠珠蛋白1112c.結果分析切割正常待待測血紅蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA與探針針雜交后產產生1.1kb切割異常待待測血紅蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA與探針針雜交后產產生1.3kb121313141415（1）原理理根據已知的的基因突變變位點的核核苷酸序列列，人工合合成相應于于突變基因因異常核核苷酸序列列的寡核苷苷酸作為雜雜交探針，，從而直接接檢測和鑒鑒定突變基基因。2）等位基基因特異性性寡核苷酸酸探針雜交交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）1516相應于突變變基因異常常相應于正常常基因核苷酸序列列的寡核苷苷核苷酸序列列的寡核苷苷雜交探針酸雜交探針針與受檢者DNA進進行分子雜雜交發(fā)生雜交均可雜交與異常不不發(fā)生雜交交(突變純和和子）（雜和子）與正常發(fā)生生雜交(正常純和和子）161717181）病因H-ras（（化學誘導導）ras家族族K-ras編碼P21蛋白N-ras（（自然然發(fā)生)ras家族族點突變好好發(fā)于12、13、61位位密碼子（2）應用用——大腸癌K-ras的基因因診斷18192）檢測a、PCR擴增用人工合成成的位于待待測點突變變兩側的引引物，分別別擴增含12、13、及61位點的基基因片段。。1920b、ASO分析①將擴增產物物結合在尼尼龍膜上分分別與ras原癌基基因密碼子子12、13、61所有可能能引起堿基基突變的寡寡核苷酸探探針進行雜雜交；②②雜交后，膜膜經嚴格的的洗滌，僅僅允許完全全相配的雜雜交雙鏈存存在；③針針結合處在在光膠片上上呈陽性斑斑點2021223）mRNA的檢測測（1）原理理通過對mRNA進行行定量、檢檢測其剪剪接加工的的缺陷以及及外顯子變變異等判斷斷基因能否否轉錄、轉轉錄物（mRNA））是否正常常以及轉錄錄效率的高高低。2223*mRNA不穩(wěn)定可可將其轉為為cDNA再用PCR技術進進行研究（（RT-PCR）2324（2）應用用視網膜母細細胞瘤：Rb基因缺缺陷Rb1基因因的mRNA全長4.7kb采用RT-PCR技術分析析外顯子突突變或mRNA前體體剪接異常常。2425分析外顯子子19至22間的基基因突變逆轉錄引物物：外顯子子22反義義鏈序列5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3`PCR引物物:外外顯顯子22正正義鏈序列列5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`外顯子19正義鏈序序列5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2526用RT-PCR檢測測艾滋病26三、基因診診斷的應用用1.遺傳傳疾病的診診斷產前診斷、、遺傳病易易感性2感染性性疾病（1）病毒毒性感染（2）細菌菌性感染（3）寄生生蟲（4）其他他273惡性腫腫瘤4法醫(yī)學學中應用28（1）DNA指紋分分析（DNAfingerprinting）可變串聯重重復序列小衛(wèi)星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（2）短串串聯重復（（shorttandemrepeat,STR）多態(tài)性性分析微衛(wèi)星DNASTR—PCR30第二節(jié)基基因治療的的基本概念念和基本策略一基基因治療（（genetherapy）的概念念1、背景與與歷史疾病的分子子生物學了了解新技術新方方法（特別別是重組DNA）的的迅速發(fā)展展311989年年5月28日

第一一個基因標標記計劃（TIL-NeoR）1990年年9月11日第第一個基因因治療計劃劃（ADA-SCID）321995年年NIH組組織Orkin、、Motoksy對頭頭5年基因因治療評估估3點建議：：發(fā)展載體技術術疾病的分子機機制動物模型成立3個國家家實驗室2000年2月532個計劃，3400余個個病人33病種：惡性腫腫瘤62.2%遺傳性疾病13.3%AIDS6.8%心血管疾病6.8%其他1.3%342、定義基因角度：正正常或有功功能的基因置置換或增補缺陷陷基因。治療角度：新新的遺傳物物轉移到某個個體獲治療效果果。353、方式基因矯正和置置換:同源源重組基因增補:ADA、、血友病基因封閉:myc基因因過度表達達，反義抑抑制活化前體藥物物基因治療：：36單純皰疹病毒毒胸腺嘧啶激激酶基因導入腫瘤細胞合成HSV-TK無毒性的抗病病毒有有毒性的抗病病毒藥物（GCV）藥藥物（GCV三磷磷酸）細胞死亡374、導入方式式exvivo基基因轉移移invivo基基因轉移移38第三節(jié)基因因治療的條件件1、目的基因的種種類：細胞因子、缺缺陷基因、抑抑癌基因、受體基因391、目的基因的獲獲得方法1）真核基因組DNA文庫中中目目的基基因的克隆2）cDNA文庫庫中目的基因因的克克隆3）人工合成基因因片段4）PCR法篩選選擴增目的基基因401、外源基因的要要求1）含信號肽的cDNA，序序列正正確確

2））必要的調控元元件（順式作作用元件件啟動子子、增強子子、靜止子子）413）外源基因進入入細胞核轉錄錄，再再轉移至細細胞漿，間隔隔序列列（內含含子），剪接接信號（（SA,SD）PolyA信號，核核內內轉錄因子子4）翻譯的起始密密碼子、終止止密密碼子、內核核糖體進入位位點點（IRES）元件5）外源基因的丟丟失、失活、、甲基化化424、基因治療療的靶細胞（（targetcell）1）生殖細胞全世界受嚴格格控制2）體細細胞選擇的標準：：A、容易取出和移移植B、容易體外培養(yǎng)養(yǎng)C、目的基因高效效導入D、細胞壽命長43常用靶細胞；；自體、同同種異異體、異異種、、淋淋巴、骨骨髓、皮膚、、肝、肌、腫腫瘤細胞等4445基因導入的方方式：exvivo——體外將基因導導入targetcell,然后將將此修飾過的的細胞胞回輸給病人人。Invivo——外源基因直接接導入體內內有關的的組織器官。。463、基因導導入（轉移））的工具與方方法。將外源基因或或DNA片斷斷導入宿主細細胞進行擴增增或表達，需需要有一個能能在該宿主細細胞進行復制制和表達的載載體（vector）來來攜帶。前者者與后者在體體外構成重組組DNA分子子，然后導入入宿主細胞。471）非病毒方方法4849（一）磷酸鈣鈣轉染技術磷酸鈣--DNA導入細胞吞噬體轉運細胞器瞬時穩(wěn)穩(wěn)定外源基因存在在外外源源基因非特異異于染色體DNA外與與宿主主染色體DNA重組12小時內表表達持續(xù)約3-4天降解穩(wěn)穩(wěn)定定轉化細胞株株50（二）DEAE-葡葡聚糖轉染技技術（略）51（三）脂質體體轉染法（（20%）聚陽離子脂質質體-DNA脂質體DNA陽離子復合合物負電荷的細胞胞膜吸收此復復合物（融合吸收））優(yōu)點：簡便、、低毒性、無無免疫原性、、無病毒產生、、化學成分已已知可大量商業(yè)供應應缺點：轉染效效率低，短暫暫表達52（四）電穿孔孔轉染技術靶細胞（懸浮浮態(tài)）+外源源目的DNA電穿孔儀高高壓壓電脈沖靶細胞膜發(fā)生生瞬時可逆性性破裂形形成微孔外源目的DNA進入靶細細胞53（五）基因槍槍技術電子發(fā)射裝置置或高壓氣流流金或鎢顆粒包包裹外源目的的DNA形成成“子彈”打入靶細胞54上述物理、化化學方法轉移移基因的缺缺點：1）轉移效率低，，多應用于實實驗驗研研究2）維持時間短2、病毒方方法55在以基因治療療為目的的載載體系統中，，以病毒載體體最為常用，，其優(yōu)點：1）易于改造與操操作2）轉移效率高3）較高的靶靶細胞特異性性56病毒載體：逆轉錄病毒(retrovirus)載體————用于具有分裂裂功能的細細胞中進行行基因轉移與與表達57腺病毒(adenovirus)、腺相關病病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性性細胞中進行行基因轉移與與表達58（六）逆轉錄錄病毒載體1、逆轉錄病病毒的結構由2條相同的的38S單鏈鏈RNA組成成2、逆轉錄病毒的的生活周期596061感染宿主細胞胞病毒基因組的的整和原病毒DNA的轉錄與翻翻譯逆轉錄病毒顆顆粒的釋放623、原病毒DNA的結構構特點63644、逆轉錄病病毒載體的構構建65665、包裝細胞胞系的構建1）沒有包裝裝細胞，逆轉轉錄病毒載體體就不能裝配配成假病毒顆粒感染染靶細胞，完完成外源源基因的高效效轉移672）去除除莫洛尼氏小小鼠5’端含含有包裝信號號ψ一段序列列輔助病毒整和NIH3T3染色體形成包裝細胞系轉錄編碼病毒毒結構基因攜攜帶帶外源基因的的逆不能包裝成病病毒顆粒轉轉錄病病毒載體（含含有包裝信號號）導入該細細胞系提供病病毒結結構基因提提供包包裝裝信號包裝成僅含有有外源目的基基因假病毒686、逆轉錄病病毒-包裝細細胞系的特特點1）感染增殖分裂裂的細胞2）轉移效率高3）有效整和、傳傳代4）宿主范圍廣（七）腺病毒毒載體1、腺病毒載載體的結構6970713、腺病毒載載體的特點1）可感染非增殖殖分裂的細胞胞2）易于培養(yǎng)與儲儲存3）非整和4）可致免疫反應應（八）質粒DNA直接接注射72基因治療的基基本過程73靶基因+載體體————重重組DNA分分子——————靶細胞—————病人人74舉例：細胞因子修飾飾腫瘤細胞降降低低其致瘤性性提高其免疫疫原性751、靶基因：細細胞因子（αα-TNF,IL-2,γ-IFN,等等）2載體體：逆轉轉錄病毒ψLTRgagpolenvLTR76逆轉錄病毒載載體PLN系系列：ψLTRNEOLTR773、包裝細細胞：PA317,包包裝為為病毒4、感染靶靶細胞5、在靶細細胞中表達基基因產物78基因治療的安安全性問題:2次事故靶向性、效、、基因整合位位點、表達調控控79基因敲除（knockout）與與基因添加（knockin）遺傳工程生物物中，一個正正?；蚩杀槐粠追N方式所改變方法1：正常基因完全全被基因的突突變拷貝所替替換可以在沒有正正?；虻母筛蓴_下提供供突變基因活性的信信息80方法2正正常常基因徹底失失活應用于獲得正正?；蛟谡w生物中的可能功功能的信息方法3一一個個突變基因加加入到基因組組最易進行的遺遺傳工程8182轉基因動物的的概念用實驗方法把把外源基因導導入動物的受受精卵，再將將這一受精卵卵接種到借腹腹懷孕的寄養(yǎng)養(yǎng)雌性動物（（fostermother）的的子宮內，使使之發(fā)育繁殖殖，這時外源源基因與動物物本身的基因因組整合，外外源基因就能能隨細胞分裂裂而增殖，再再體內表達，，并傳給下一一代，這樣生生育的動物稱稱為轉基因動物8384小鼠基因置換換過程的總結結8586動物藥廠的基基本概念87889、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。1月月-231月月-23Sunday,January1,202310、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:07PM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。1月-2313:54:0713:54Jan-2301-Jan-2312、故故人人江江海海別別，，幾幾度度隔隔山山川川。。。。13:54:0713:54:0713:54Sunday,January1,202313、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。1月-231月-2313:54:0713:54:07January1,202314、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。01一一月20231:54:07下午午13:54:071月-2315、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。一月月231:54下下午午1月月-2313:54January1,202316、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2023/1/113:54:0713:54:0701January202317、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時時，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點點的射線線向前。。。1:54:07下午午1:54下午午13:54:071月-239、沒有失敗敗，只有暫暫時停止成成功！。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事情努努力了未必有有結果，但是是不努力卻什什么改變也沒沒有。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:08PM11、成成功功就就是是日日復復一一日日那那一一點點點點小小小小努努力力的的積積累累。。。。1月月-2313:54:0813:54Jan-2301-Jan-2312、世間成事事，不求其其絕對圓滿滿，留一份份不足，可可得無限完完美。。13:54:0813:54:0813:54Sunday,January1,202313、不知香積寺寺，數里入云云峰。。1月-231月-2313:54:0813:54:08January1,202314、意志堅強的的人能把世界界放在手中像像泥塊一樣任任意揉捏。01一月20231:54:08下午13:54:081月-2315、楚塞三三湘接，，荊門九九派通。。。。一月231:54下午午1月-2313:54January1,202316、少年十十五二十十時，步步行奪得得胡馬騎騎。。2023/1/113:54:0813:54:0801January202317、空山新雨后后，天氣晚來來秋。。1:54:08下午1:54下下午13:54:081月-239、楊柳柳散和和風，，青山山澹吾吾慮。。。1月-231月-23Sunday,January1,2