綜合性實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量

綜合性實(shí)驗(yàn)：

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邢維賢實(shí)驗(yàn)原理流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry）是利用流式細(xì)胞儀（flowcytometer）對(duì)懸浮細(xì)胞或微粒進(jìn)行快速、多參數(shù)分析的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，能夠同時(shí)定量檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)指標(biāo)。流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)化的研究。1934年，moldvan報(bào)道了對(duì)流動(dòng)的細(xì)胞如紅細(xì)胞、染色后的酵母菌的檢測(cè)方法。1947年，Gucker等首次采用了鞘液原理對(duì)氣體中的微粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。1953年，Crosland-Taylor成功設(shè)計(jì)了鞘液系統(tǒng)。將待測(cè)的細(xì)胞懸液緩慢的注入一個(gè)快速流動(dòng)的液流中，使該細(xì)胞液包繞在細(xì)胞懸液的外側(cè)，形成鞘流（sheathflow），而細(xì)胞懸液始終處于軸流狀態(tài)。根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的認(rèn)識(shí)：鞘流速度越快，載物通過(guò)的能力越強(qiáng)，并且具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用，據(jù)此，設(shè)計(jì)了流動(dòng)室。實(shí)驗(yàn)原理1956年，coulter原理：在一個(gè)微孔兩側(cè)充滿(mǎn)電解質(zhì)溶液，通電時(shí)電流通過(guò)微孔，在壓力系統(tǒng)控制下細(xì)胞或者顆粒流過(guò)微孔時(shí)，使微孔的截面積減小，由于細(xì)胞或顆粒的電阻與電解質(zhì)相差較大，可以檢測(cè)出微孔兩側(cè)電壓變化脈沖，電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可以獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目的信息?，F(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)采集和分析的技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個(gè)新的設(shè)想（1）細(xì)胞的組分是可以通過(guò)分光光度學(xué)來(lái)定量測(cè)量的；（2）細(xì)胞的不同組分可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。因此，對(duì)同一細(xì)胞可以同時(shí)獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，以此作為鑒別細(xì)胞的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)原理VanDilla和LosAlamos小組在1967年研制出液流束、照明光軸、檢測(cè)細(xì)胞光軸三者相互正交，這是流式細(xì)胞計(jì)的基礎(chǔ)。首次采用Feulgen反應(yīng)對(duì)DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并能夠在DNA直方圖上清楚的顯示出細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。1972年，LenHerzenberg等人在斯坦福大學(xué)研制出一臺(tái)熒光激活細(xì)胞分選儀（fluorescence-activatedcellsorter,FACS），它標(biāo)志著流式細(xì)胞儀商品化時(shí)代的到來(lái)。流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)

StructureofFlowCytometer

流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀激光光源激光束成形系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成信號(hào)監(jiān)測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)

流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

FlowChamber(FlowCell)將待測(cè)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管?chē)姵?，從而使鞘液能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。激光光源與光束成形系統(tǒng)

Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation流式細(xì)胞儀以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過(guò)聚焦后產(chǎn)生的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向角散射（FSC），與細(xì)胞直徑正相關(guān)，常以此做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。側(cè)向角散射（SSC），與激光束正交90度方向的散射信號(hào)，它對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核膜的折射率更敏感，可以提供細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和顆粒的信息。僅僅根據(jù)FSC/SSC就可以區(qū)分外周血中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成。它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器。在FCM的光學(xué)系統(tǒng)中最主要的光學(xué)元件是濾光片，主要有三類(lèi)：長(zhǎng)通濾片（LP）、短通濾片(SP)和帶通濾片(BP)。信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)

SignalScanandAnalysis熒光信號(hào)的面積和寬度1、所謂熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)DNA倍體測(cè)量采用面積，這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。2、熒光信號(hào)的寬度常用來(lái)區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞。3、通過(guò)設(shè)“門(mén)”可以將雙聯(lián)體細(xì)胞排除，其原理是雙聯(lián)體細(xì)胞所得到的熒光寬度信號(hào)（FL-W）要比單個(gè)G2期細(xì)胞大，因此射門(mén)后才能得到真正的DNA含量分布曲線和細(xì)胞周期。常用的熒光標(biāo)記染料流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)表示形式實(shí)驗(yàn)儀器及材料實(shí)驗(yàn)儀器：流式細(xì)胞儀partec-cyflow實(shí)驗(yàn)材料：Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)試劑：磷酸鹽緩沖液、PI染液實(shí)驗(yàn)步驟制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為1X106個(gè)/ml。加入PBS，300-400g離心5min。棄上清加入70%乙醇，4℃固定過(guò)夜。離心，棄乙醇，加入PBS重懸。篩網(wǎng)過(guò)濾，離