一種參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系及其建立方法0818

一種參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系及其建立方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及未分化的非人類(lèi)細(xì)胞，具體涉及一種參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系。背影技術(shù)參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)來(lái)源于鉅蚓科環(huán)毛蚓屬，是《中華人民共和國(guó)藥典》2010版“地龍”項(xiàng)下收載的4種原動(dòng)物之一。因其主產(chǎn)于廣東和廣西兩地，故被稱(chēng)為“廣地龍”。由于廣地龍療效確切，藥材加工精細(xì)講究而被業(yè)內(nèi)公認(rèn)為品質(zhì)最優(yōu)。中藥地龍?jiān)凇吨腥A人民共和國(guó)藥典》收錄品種還有櫛盲環(huán)毛Pheretimapectinifera(Michaelsen)、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)以及通俗環(huán)毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)的干燥體，后三種習(xí)稱(chēng)“滬地龍”。地龍性寒、味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng),具有清熱息風(fēng)、通經(jīng)絡(luò)、平喘、利尿之功。主治高熱驚癇，氣虛兩滯，半身不遂，肺熱哮喘，小便不利及熱痹等癥。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)地龍的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用的研究報(bào)道相對(duì)較多。大量研究表明，地龍不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，還含有多種藥理活性成分，其藥理作用幾乎涉及人體各個(gè)系統(tǒng)，主要有降壓、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增強(qiáng)免疫、抗?jié)?、解熱?zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、平喘、抗菌等作用。由此可見(jiàn)，地龍不論作為藥品還是營(yíng)養(yǎng)保健品開(kāi)發(fā)利用，在經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)方面都有巨大的效益潛力。目前地龍藥材大多仍靠野生資源，加上不同環(huán)境條件以及采收加工技術(shù)等的影響，造成藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，特別是重金屬超標(biāo)一直難以控制的問(wèn)題。近年，在國(guó)家科技部“十五”國(guó)家重大科技攻關(guān)項(xiàng)目“廣地龍規(guī)范化養(yǎng)殖研究”的資助下，我們?cè)S機(jī)抽取12批在我國(guó)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的廣地龍藥材進(jìn)行了重金屬含量調(diào)查，由中國(guó)廣州分析測(cè)試中心的檢測(cè)報(bào)告(編號(hào)2004093019)表明：其中7批次的鎘(Cd2+)含量超過(guò)中華人民共和國(guó)對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部發(fā)布的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的限量，其超過(guò)的倍數(shù)從23倍至143倍不等。由此可見(jiàn)，市場(chǎng)上廣地龍重金屬超標(biāo)問(wèn)題令人堪憂，已嚴(yán)重制約其出口量和臨床用藥安全。為進(jìn)一步深化參環(huán)毛蚓的重金屬富集機(jī)制，制定降低或消除廣地龍重金屬超標(biāo)的研究，建立參環(huán)毛蚓的細(xì)胞系是至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，目前關(guān)于蚯蚓細(xì)胞培養(yǎng)報(bào)道并不多，還存在大量空白，僅涉及到的品種是正蚓科Lumbricidae的陸正蚓Lumbricusterrestis和赤子愛(ài)勝蚓Eiseniafoetida，且為70年代和90年代的初步嘗試，距今時(shí)間較久，研究進(jìn)展方面見(jiàn)到零星報(bào)道?！稄V州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》2011年5月第28卷第3期刊載了題為“參環(huán)毛蚓細(xì)胞原代培養(yǎng)滅菌方法的研究”一文，該文所公開(kāi)的參環(huán)毛蚓細(xì)胞原代培養(yǎng)滅菌方法雖然也是常見(jiàn)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，但是在培養(yǎng)過(guò)程及后續(xù)的觀察中發(fā)現(xiàn)其存在細(xì)胞傳代時(shí)分裂增長(zhǎng)慢，且容易出現(xiàn)早期細(xì)胞凋亡的缺陷。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種改進(jìn)的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系，該細(xì)胞系不僅長(zhǎng)時(shí)間保藏成活率高，而且在傳代培養(yǎng)時(shí)仍然表現(xiàn)出快速分裂增長(zhǎng)的活性。本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)解決方案是：一種參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系，其特征在于，其保藏號(hào)為CCTCC—C201294。上述參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系的建立方法由以下步驟組成：將收集野外采集的參環(huán)毛蚓置于實(shí)驗(yàn)室泥土(溫度28°C、PH=4.5、土壤含水量21.5%)中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周后，置于墊有用蒸餾水濕潤(rùn)的濾紙的燒杯中，保持適宜的溫度28C，濕度60%,每天換濾紙1次，吐泥3?4天；取吐泥3?4天后的參環(huán)毛蚓于超凈臺(tái)上，用75%酒精體表消毒后解剖，將獲得的腸道部位用LBSS緩沖液沖洗，再用抗生素組合液滅菌2?3min；棄抗生素組合液得到的腸道部分先加入體積為腸道體積的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后棄去酶解液，再加入體積為腸道體積的10倍的CollagenaseTypeI酶解液酶解20分鐘,過(guò)100目的細(xì)胞篩除去較大的組織碎片，然后以1000r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞；其中，所述的抗生素組合液是將青霉素鈉、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素組合液中，青霉素鈉的濃度為200U/ml，硫酸鏈霉素的濃度為400pg/ml，硫酸慶大霉素的濃度為300U/ml，兩性霉素B的濃度為5pg/ml；所述的Thermolysin酶解液是將Thermolysin粉末加入到濃度為10mmol/ml的HEPES溶液中過(guò)濾滅菌混合制成，所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的濃度為25“g/mL所述的CollagenaseTypeI的酶解液是將CollagenaseTypeI粉末加入到不含Ca2+、Mg2+的HBSS(1x)溶液中過(guò)濾滅菌而成，所制的CollagenaseTypeI酶解液中CollagenaseTypeI的濃度為0.2mg/mL；往收集的細(xì)胞中加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1x105/ml接種于透氣培養(yǎng)瓶中，置于28C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞貼壁面積達(dá)到80%時(shí)，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用LBSS沖洗1?2遍；如果培養(yǎng)到第五天細(xì)胞貼壁面積還達(dá)到80%，便進(jìn)行半量更換液培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；其中所述的培養(yǎng)液由91.55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin試劑、0.75%的濃度為40000U/ml的硫酸慶大霉素、0.2%的青霉素鈉試劑、0.4%的硫酸鏈霉素試劑、0.1%的兩性霉素B試劑組成，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為10mmol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200》g/ml；所述的青霉素鈉試劑是將青霉素鈉溶解到LBSS中制成，其中青霉素鈉在試劑的濃度為100000U/ml；所述的硫酸鏈霉素試劑是將硫酸鏈霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸鏈霉素在試劑中的濃度為800000》g/ml；所述的兩性霉素B試劑是將兩性霉素B溶解到DMSO中制成，其中兩性霉素B在試劑中的濃度為5000》g/ml；然后，刮下上皮樣細(xì)胞克隆區(qū)域以外的細(xì)胞群，再往培養(yǎng)瓶加入傳代培養(yǎng)液淹沒(méi)貼壁面的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到上皮樣細(xì)胞克隆區(qū)域達(dá)到85%以上，即得到所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系；其中所述的傳代培養(yǎng)液是由體積百分比為91.5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的濃度為2000ng/mlEGF溶液；1%的濃度為200膽/mlinsulin試劑；1.45%青霉素-鏈霉素溶液(1x),其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為10mmol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200》g/ml。由于本發(fā)明所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上作了較大的改進(jìn)，尤其是抗生素組合液、酶解液和培養(yǎng)液進(jìn)行大幅度的改良，附圖說(shuō)明圖1(a)是本發(fā)明的廣地龍形態(tài)圖圖1(b)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮隱窩樣單位圖1(c)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓原代腸細(xì)胞200倍圖1(d)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮樣細(xì)胞克隆200倍圖2(a)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖3（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞PCR檢測(cè)圖圖4（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞CAKP染液的陽(yáng)性400倍圖4（b）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞CAKP染液的陽(yáng)性2000倍圖4（c）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸細(xì)胞CAKP染液的陽(yáng)性和陽(yáng)性1000倍圖5（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞SOD酶鑒定圖圖5（b）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞MDH酶鑒定圖圖5（c）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞考馬斯亮藍(lán)鑒定圖具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系的建立方法，該方法包括以下步驟：1、參環(huán)毛蚓腸細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)，確立提取細(xì)胞的最佳原動(dòng)物生長(zhǎng)期：1）收集野外采集樣品后，置于實(shí)驗(yàn)室泥土中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周以上，然后取活體置于燒杯吐泥3?4d,測(cè)量參環(huán)毛蚓濕重詳細(xì)記錄，取樣品活體于超凈臺(tái)上，用75%酒精體表消毒后解剖。將樣品的腸道解剖分離，然后用LBSS緩沖液沖洗多次，然后用抗生素組合液滅菌2?3min。2）將已滅菌的各部分組織移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中切細(xì)成約1mm3小塊，置于離心管中，添加3?5mL聯(lián)合酶酶解30min（酶液必須浸過(guò)組織塊）。3）用100目細(xì)胞篩過(guò)濾，并用LBSS多次沖洗濾渣，以獲得更多細(xì)胞，取其液體，轉(zhuǎn)速1000r/min,離心5min,棄去上清液，加入培養(yǎng)基終止酶解。再次離心，棄去上清液，收集細(xì)胞。該聯(lián)合酶是25yg/mLThermolysin+0.2mg/mLCollagenaseTypeI。將收集的細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打成均勻的細(xì)胞懸液，分別將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5x105個(gè)/ml后接種至培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)液是F12DMEM+5%FBS+20ng/mlEGF+2yg/mlinsulin+200U/ml青霉素鈉+400yg/ml硫酸鏈霉素+300U/ml硫酸慶大霉素+5yg/mL兩性霉素B的培養(yǎng)液。2、 將分離培養(yǎng)的原代參環(huán)毛蚓腸細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化：將酶解后的參環(huán)毛蚓腸細(xì)胞培養(yǎng)6天后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并記錄原代細(xì)胞培養(yǎng)貼壁時(shí)間及貼壁面積7天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并半量換液。待細(xì)胞出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞克隆和肌肉細(xì)胞克隆，用機(jī)械分離法進(jìn)行分選：1）用倒置顯微鏡下用筆在培養(yǎng)皿上標(biāo)記出上皮樣細(xì)胞克隆區(qū)域；2）吸去培養(yǎng)液，用LBSS洗1?2遍；3）用消毒過(guò)的細(xì)胞刮刀將上皮樣以外區(qū)域刮掉，然后補(bǔ)加培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。4）重復(fù)上面第3）步，如此反復(fù)，直到獲得上皮樣細(xì)胞克隆。3、 檢測(cè)并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系。具體實(shí)現(xiàn)方式是：1）待細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液在37°C條件下消化lmin左右，棄上清液。然后加0.1mg/mLDispaseI+300U/mLCollagenaseTypeXI消化；2）等量細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將經(jīng)過(guò)消化的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞在1000r/min,離心5min；3）棄上清，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度5x105個(gè)/ml將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿上，加細(xì)胞培養(yǎng)液；4）連續(xù)培養(yǎng)6?8代后，肌肉細(xì)胞逐漸減少消失，80%以上表現(xiàn)為上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞大量擴(kuò)增，即建立成參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞系參見(jiàn)圖1，用以上方法獲得的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞，并穩(wěn)定傳到9代，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生改變。對(duì)分離培養(yǎng)的參環(huán)毛蚓腸上皮細(xì)胞進(jìn)一步檢測(cè)方法：1、 群體倍增時(shí)間的測(cè)定及細(xì)胞周期的檢測(cè)，測(cè)得參環(huán)毛蚓腸細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。具有方法是：取p4代細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每天抽取一板在酶標(biāo)儀上,490nm波長(zhǎng)，測(cè)其吸光度OD,計(jì)算平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。參見(jiàn)圖2,細(xì)胞潛伏期1?3天，細(xì)胞群倍增時(shí)間為7d,衰退時(shí)間13d,2、 取p5代細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，提取細(xì)胞基因組DNA，利用COI基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中用GV染色進(jìn)行檢測(cè)擴(kuò)增效果，PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后委托測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，序列較為吻合，鑒定為鉅蚓科環(huán)毛蚓屬Pheretimaaspergillum（E.Perrier）。PCR引物序列 引物 核苷酸序列P1 5'-GGTCAACAAATCATAAGATATTGG-3'P2 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PT-PCR反應(yīng)體系如下：10XPCRBuffer(含15mMMgCl2)5gl模板DNA(20-50ng/yl)2glMgCl2(25mM)4gl引物1(IpM)2gl引物2(1pM)2gldNTPs(10mMeach)1glTaq酶(1U/yl)1glddH2033glPCR的反應(yīng)條件為：①：94C預(yù)變性4min；②：94C變性45s；③：49C退火40s；④:72C延伸1.5min；⑤：②-④30個(gè)循環(huán)；⑥：72C終延伸7min。之后于4°C保存。參見(jiàn)圖3(a)細(xì)胞提取的PCR產(chǎn)物其大小在650bp左右，其條帶清晰明亮，無(wú)拖尾。3、取p5代細(xì)胞消化制成懸液，離心收集細(xì)胞，用PBS沖洗1?2遍，冰浴提取細(xì)胞蛋白，-80°C保存?zhèn)溆?，作為同工酶點(diǎn)樣樣品。同工酶聚丙酰胺凝膠制備分離膠制備體積(V)濃縮膠膠制備體積(V)ddHO28.2mlddHO26.0ml30%Arc-Bis10ml30%Arc-Bis1.5ml分離緩沖液6.3ml濃縮緩沖液1.5ml10%AP0.25ml10%AP0.1mlTEMED原液0.0