一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系及其建立方法0818

一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系及其建立方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及未分化的非人類細胞，具體涉及一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。背影技術(shù)參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)來源于鉅蚓科環(huán)毛蚓屬，是《中華人民共和國藥典》2010版“地龍”項下收載的4種原動物之一。因其主產(chǎn)于廣東和廣西兩地，故被稱為“廣地龍”。由于廣地龍療效確切，藥材加工精細講究而被業(yè)內(nèi)公認為品質(zhì)最優(yōu)。中藥地龍在《中華人民共和國藥典》收錄品種還有櫛盲環(huán)毛Pheretimapectinifera(Michaelsen)、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)以及通俗環(huán)毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)的干燥體，后三種習稱“滬地龍”。地龍性寒、味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng),具有清熱息風、通經(jīng)絡(luò)、平喘、利尿之功。主治高熱驚癇，氣虛兩滯，半身不遂，肺熱哮喘，小便不利及熱痹等癥。近20年來，國內(nèi)外有關(guān)地龍的化學成分、藥理作用、臨床應(yīng)用的研究報道相對較多。大量研究表明，地龍不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，還含有多種藥理活性成分，其藥理作用幾乎涉及人體各個系統(tǒng)，主要有降壓、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增強免疫、抗?jié)?、解熱?zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、平喘、抗菌等作用。由此可見，地龍不論作為藥品還是營養(yǎng)保健品開發(fā)利用，在經(jīng)濟、社會和生態(tài)方面都有巨大的效益潛力。目前地龍藥材大多仍靠野生資源，加上不同環(huán)境條件以及采收加工技術(shù)等的影響，造成藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，特別是重金屬超標一直難以控制的問題。近年，在國家科技部“十五”國家重大科技攻關(guān)項目“廣地龍規(guī)范化養(yǎng)殖研究”的資助下，我們曾隨機抽取12批在我國市場上銷售的廣地龍藥材進行了重金屬含量調(diào)查，由中國廣州分析測試中心的檢測報告(編號2004093019)表明：其中7批次的鎘(Cd2+)含量超過中華人民共和國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部發(fā)布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中規(guī)定的限量，其超過的倍數(shù)從23倍至143倍不等。由此可見，市場上廣地龍重金屬超標問題令人堪憂，已嚴重制約其出口量和臨床用藥安全。為進一步深化參環(huán)毛蚓的重金屬富集機制，制定降低或消除廣地龍重金屬超標的研究，建立參環(huán)毛蚓的細胞系是至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)，目前關(guān)于蚯蚓細胞培養(yǎng)報道并不多，還存在大量空白，僅涉及到的品種是正蚓科Lumbricidae的陸正蚓Lumbricusterrestis和赤子愛勝蚓Eiseniafoetida，且為70年代和90年代的初步嘗試，距今時間較久，研究進展方面見到零星報道?！稄V州中醫(yī)藥大學學報》2011年5月第28卷第3期刊載了題為“參環(huán)毛蚓細胞原代培養(yǎng)滅菌方法的研究”一文，該文所公開的參環(huán)毛蚓細胞原代培養(yǎng)滅菌方法雖然也是常見的動物細胞培養(yǎng)方法，但是在培養(yǎng)過程及后續(xù)的觀察中發(fā)現(xiàn)其存在細胞傳代時分裂增長慢，且容易出現(xiàn)早期細胞凋亡的缺陷。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改進的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，該細胞系不僅長時間保藏成活率高，而且在傳代培養(yǎng)時仍然表現(xiàn)出快速分裂增長的活性。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)解決方案是：一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，其特征在于，其保藏號為CCTCC—C201294。上述參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的建立方法由以下步驟組成：將收集野外采集的參環(huán)毛蚓置于實驗室泥土(溫度28°C、PH=4.5、土壤含水量21.5%)中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周后，置于墊有用蒸餾水濕潤的濾紙的燒杯中，保持適宜的溫度28C，濕度60%,每天換濾紙1次，吐泥3?4天；取吐泥3?4天后的參環(huán)毛蚓于超凈臺上，用75%酒精體表消毒后解剖，將獲得的腸道部位用LBSS緩沖液沖洗，再用抗生素組合液滅菌2?3min；棄抗生素組合液得到的腸道部分先加入體積為腸道體積的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后棄去酶解液，再加入體積為腸道體積的10倍的CollagenaseTypeI酶解液酶解20分鐘,過100目的細胞篩除去較大的組織碎片，然后以1000r/min離心5min，棄上清，收集細胞；其中，所述的抗生素組合液是將青霉素鈉、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素組合液中，青霉素鈉的濃度為200U/ml，硫酸鏈霉素的濃度為400pg/ml，硫酸慶大霉素的濃度為300U/ml，兩性霉素B的濃度為5pg/ml；所述的Thermolysin酶解液是將Thermolysin粉末加入到濃度為10mmol/ml的HEPES溶液中過濾滅菌混合制成，所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的濃度為25“g/mL所述的CollagenaseTypeI的酶解液是將CollagenaseTypeI粉末加入到不含Ca2+、Mg2+的HBSS(1x)溶液中過濾滅菌而成，所制的CollagenaseTypeI酶解液中CollagenaseTypeI的濃度為0.2mg/mL；往收集的細胞中加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1x105/ml接種于透氣培養(yǎng)瓶中，置于28C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時，觀察細胞生長情況，當細胞貼壁面積達到80%時，吸去細胞培養(yǎng)液，用LBSS沖洗1?2遍；如果培養(yǎng)到第五天細胞貼壁面積還達到80%，便進行半量更換液培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；其中所述的培養(yǎng)液由91.55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin試劑、0.75%的濃度為40000U/ml的硫酸慶大霉素、0.2%的青霉素鈉試劑、0.4%的硫酸鏈霉素試劑、0.1%的兩性霉素B試劑組成，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為10mmol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200》g/ml；所述的青霉素鈉試劑是將青霉素鈉溶解到LBSS中制成，其中青霉素鈉在試劑的濃度為100000U/ml；所述的硫酸鏈霉素試劑是將硫酸鏈霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸鏈霉素在試劑中的濃度為800000》g/ml；所述的兩性霉素B試劑是將兩性霉素B溶解到DMSO中制成，其中兩性霉素B在試劑中的濃度為5000》g/ml；然后，刮下上皮樣細胞克隆區(qū)域以外的細胞群，再往培養(yǎng)瓶加入傳代培養(yǎng)液淹沒貼壁面的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到上皮樣細胞克隆區(qū)域達到85%以上，即得到所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系；其中所述的傳代培養(yǎng)液是由體積百分比為91.5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的濃度為2000ng/mlEGF溶液；1%的濃度為200膽/mlinsulin試劑；1.45%青霉素-鏈霉素溶液(1x),其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為10mmol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200》g/ml。由于本發(fā)明所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的構(gòu)建方法在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上作了較大的改進，尤其是抗生素組合液、酶解液和培養(yǎng)液進行大幅度的改良，附圖說明圖1(a)是本發(fā)明的廣地龍形態(tài)圖圖1(b)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮隱窩樣單位圖1(c)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓原代腸細胞200倍圖1(d)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮樣細胞克隆200倍圖2(a)是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞生長曲線圖3（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞PCR檢測圖圖4（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞CAKP染液的陽性400倍圖4（b）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞CAKP染液的陽性2000倍圖4（c）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸細胞CAKP染液的陽性和陽性1000倍圖5（a）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞SOD酶鑒定圖圖5（b）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞MDH酶鑒定圖圖5（c）是本發(fā)明的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞考馬斯亮藍鑒定圖具體實施方式本發(fā)明提供了一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的建立方法，該方法包括以下步驟：1、參環(huán)毛蚓腸細胞的原代分離培養(yǎng)，確立提取細胞的最佳原動物生長期：1）收集野外采集樣品后，置于實驗室泥土中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周以上，然后取活體置于燒杯吐泥3?4d,測量參環(huán)毛蚓濕重詳細記錄，取樣品活體于超凈臺上，用75%酒精體表消毒后解剖。將樣品的腸道解剖分離，然后用LBSS緩沖液沖洗多次，然后用抗生素組合液滅菌2?3min。2）將已滅菌的各部分組織移入無菌培養(yǎng)皿中切細成約1mm3小塊，置于離心管中，添加3?5mL聯(lián)合酶酶解30min（酶液必須浸過組織塊）。3）用100目細胞篩過濾，并用LBSS多次沖洗濾渣，以獲得更多細胞，取其液體，轉(zhuǎn)速1000r/min,離心5min,棄去上清液，加入培養(yǎng)基終止酶解。再次離心，棄去上清液，收集細胞。該聯(lián)合酶是25yg/mLThermolysin+0.2mg/mLCollagenaseTypeI。將收集的細胞沉淀物加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打成均勻的細胞懸液，分別將細胞濃度調(diào)節(jié)至5x105個/ml后接種至培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)液是F12DMEM+5%FBS+20ng/mlEGF+2yg/mlinsulin+200U/ml青霉素鈉+400yg/ml硫酸鏈霉素+300U/ml硫酸慶大霉素+5yg/mL兩性霉素B的培養(yǎng)液。2、 將分離培養(yǎng)的原代參環(huán)毛蚓腸細胞進行機械分離純化：將酶解后的參環(huán)毛蚓腸細胞培養(yǎng)6天后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并記錄原代細胞培養(yǎng)貼壁時間及貼壁面積7天后觀察細胞生長情況，并半量換液。待細胞出現(xiàn)上皮樣細胞克隆和肌肉細胞克隆，用機械分離法進行分選：1）用倒置顯微鏡下用筆在培養(yǎng)皿上標記出上皮樣細胞克隆區(qū)域；2）吸去培養(yǎng)液，用LBSS洗1?2遍；3）用消毒過的細胞刮刀將上皮樣以外區(qū)域刮掉，然后補加培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。4）重復上面第3）步，如此反復，直到獲得上皮樣細胞克隆。3、 檢測并進行擴大培養(yǎng)，建立參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。具體實現(xiàn)方式是：1）待細胞長至融合時，棄去培養(yǎng)液，用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液在37°C條件下消化lmin左右，棄上清液。然后加0.1mg/mLDispaseI+300U/mLCollagenaseTypeXI消化；2）等量細胞培養(yǎng)液終止消化，將經(jīng)過消化的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞在1000r/min,離心5min；3）棄上清，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度5x105個/ml將細胞懸液接種到培養(yǎng)皿上，加細胞培養(yǎng)液；4）連續(xù)培養(yǎng)6?8代后，肌肉細胞逐漸減少消失，80%以上表現(xiàn)為上皮樣細胞，細胞大量擴增，即建立成參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系參見圖1，用以上方法獲得的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞，并穩(wěn)定傳到9代，細胞形態(tài)沒有發(fā)生改變。對分離培養(yǎng)的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞進一步檢測方法：1、 群體倍增時間的測定及細胞周期的檢測，測得參環(huán)毛蚓腸細胞的生長曲線。具有方法是：取p4代細胞，消化制成細胞懸液，接種于96孔板，每天抽取一板在酶標儀上,490nm波長，測其吸光度OD,計算平均值，繪制生長曲線。參見圖2,細胞潛伏期1?3天，細胞群倍增時間為7d,衰退時間13d,2、 取p5代細胞，消化制成細胞懸液，提取細胞基因組DNA，利用COI基因的通用引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中用GV染色進行檢測擴增效果，PCR產(chǎn)物進行純化后委托測序公司進行雙向測序。測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，序列較為吻合，鑒定為鉅蚓科環(huán)毛蚓屬Pheretimaaspergillum（E.Perrier）。PCR引物序列 引物 核苷酸序列P1 5'-GGTCAACAAATCATAAGATATTGG-3'P2 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PT-PCR反應(yīng)體系如下：10XPCRBuffer(含15mMMgCl2)5gl模板DNA(20-50ng/yl)2glMgCl2(25mM)4gl引物1(IpM)2gl引物2(1pM)2gldNTPs(10mMeach)1glTaq酶(1U/yl)1glddH2033glPCR的反應(yīng)條件為：①：94C預變性4min；②：94C變性45s；③：49C退火40s；④:72C延伸1.5min；⑤：②-④30個循環(huán)；⑥：72C終延伸7min。之后于4°C保存。參見圖3(a)細胞提取的PCR產(chǎn)物其大小在650bp左右，其條帶清晰明亮，無拖尾。3、取p5代細胞消化制成懸液，離心收集細胞，用PBS沖洗1?2遍，冰浴提取細胞蛋白，-80°C保存?zhèn)溆?，作為同工酶點樣樣品。同工酶聚丙酰胺凝膠制備分離膠制備體積(V)濃縮膠膠制備體積(V)ddHO28.2mlddHO26.0ml30%Arc-Bis10ml30%Arc-Bis1.5ml分離緩沖液6.3ml濃縮緩沖液1.5ml10%AP0.25ml10%AP0.1mlTEMED原液0.0