生物技術(shù)代謝工程

代謝工程導(dǎo)讀2023/2/31張星元：發(fā)酵原理（講座）

研究代謝工程的就是為了能精確地處理好微生物細胞自身的利益與人類對微生物細胞提出的要求之間的對立與統(tǒng)一的關(guān)系。2023/2/32張星元：發(fā)酵原理（講座）代謝工程的導(dǎo)讀1.代謝工程的醞釀2.代謝流及其控制的的概念3.代謝工程的兩個組成部分4.代謝工程的含義5.代謝工程的應(yīng)用2023/2/33張星元：發(fā)酵原理（講座）1.1半個多世紀(jì)生理與育種知識的累積1.2基因工程理論和技術(shù)的成熟1.3代謝流定量分析技術(shù)的發(fā)展1.4生化工程在線檢測和建模方法的發(fā)展1.代謝工程的醞釀2023/2/34張星元：發(fā)酵原理（講座）用代謝途徑操作的手段來改造微生物以獲得期望的性質(zhì)，這確實并不是新的觀念。在氨基酸、抗生素、溶劑和維生素的發(fā)酵法生產(chǎn)中，都可以找到采用這個路子實現(xiàn)人類理想的一些突出的例子。這些方法主要依賴于用化學(xué)誘變劑處理微生物，并用進行設(shè)計的篩選技術(shù)來檢出已獲得優(yōu)良性狀的突變株。盡管這種方法已被廣泛地接受并已取得好的效果，但人們對突變株的遺傳和代謝性狀的精確變化，知之甚少。1.1半個多世紀(jì)生理與育種知識的累積2023/2/35張星元：發(fā)酵原理（講座）

盡管在所有的菌種改良方案中都有某種定向的含義，但傳統(tǒng)的誘變是隨機的。“定向”與隨機誘變沒有直接關(guān)系。

事實上，我們早就根據(jù)隨機誘變后從突變株中篩得的高產(chǎn)突變株遺傳標(biāo)記，及這些突變株的優(yōu)良性質(zhì)的實驗結(jié)果，來推測途徑及其控制的機制。

2023/2/36張星元：發(fā)酵原理（講座）

有人把這樣的做法叫做“逆行的代謝工程”（reversemetabolicengineering）,“逆行的代謝工程”

為代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和完善，以及代謝工程的進展提供了大量的生理學(xué)和遺傳學(xué)信息。2023/2/37張星元：發(fā)酵原理（講座）二十多年來，基因工程的理論和DNA重組的分子生物學(xué)技術(shù)已成熟。DNA重組的分子生物學(xué)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，把代謝操作引進了一個新的層面，人們已能對代謝途徑的指定酶反應(yīng)進行精確的修飾，因此，有可能構(gòu)建精心設(shè)計的遺傳背景。1.2基因工程理論和技術(shù)的成熟2023/2/38張星元：發(fā)酵原理（講座）1.3代謝流定量分析技術(shù)的發(fā)展

代謝流量分析（metabolicfluxanalysis）是一種研究胞內(nèi)代謝的方法，根據(jù)已有的代謝網(wǎng)絡(luò)的信息建立胞內(nèi)主要反應(yīng)的化學(xué)計量模型和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量平衡，以實際測得的分泌到胞外的代謝中間產(chǎn)物的濃度，來推算代謝代謝流量。2023/2/39張星元：發(fā)酵原理（講座）這種分析方法的基礎(chǔ)是擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，即假設(shè)在產(chǎn)物形成速率最大的階段各種代謝中間物的胞內(nèi)濃度變化速率為零。根據(jù)質(zhì)量平衡，由n個中間代謝物即可得到n個關(guān)于速率的方程，通過測定胞外代謝產(chǎn)物的濃度，計算未知途徑的流量。2023/2/310張星元：發(fā)酵原理（講座）1.4生化工程在線檢測和建模方法的發(fā)展

色譜、質(zhì)譜、紅外等等在線檢測手段，以及生物傳感技術(shù)的發(fā)展，可為發(fā)酵在線檢測和反饋提供可靠的原始數(shù)據(jù)。建模方法也有發(fā)展。2023/2/311張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝流的概念本身實際上并不是新的概念。代謝流及其控制引起生化研究人員中的少數(shù)先知的注意，大約已有30多年歷史了。作為他們工作的結(jié)果，代謝控制的觀念成熟了，并且被嚴(yán)格的定義了，盡管這些觀念并不是始終被傳統(tǒng)的生物學(xué)家廣泛地接受。2代謝流及其控制的的概念2023/2/312張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程最初僅僅被設(shè)想為特定的途徑操作（在生物化學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)的領(lǐng)域）。后來，發(fā)酵工程師們驚喜地發(fā)現(xiàn)利用代謝流控制分析這個有效的平臺，可以向工業(yè)發(fā)酵過程導(dǎo)入嚴(yán)密性；并把它變成了發(fā)酵工程的領(lǐng)域工程數(shù)據(jù)分析的輸出端。2023/2/313張星元：發(fā)酵原理（講座）

盡管代謝和細胞生理學(xué)可為反應(yīng)途徑的分析提供主要的背景知識；還應(yīng)該指出，代謝流量測定和控制的結(jié)果具有廣闊的適用范圍和實際應(yīng)用前景。因而，除了要分析代謝途徑上的物質(zhì)流和能量流，代謝工程的概念同樣可以應(yīng)用于將來信號傳感途徑的信息流的分析（目前對于信息流尚未很好地定義）。2023/2/314張星元：發(fā)酵原理（講座）

3代謝工程的兩個組成部分3.1

“分析”部分3.2“綜合”部分2023/2/315張星元：發(fā)酵原理（講座）因為代謝工程借助于DNA重組技術(shù)而作為一種啟用技術(shù)而出現(xiàn)，所以一開始人們就把注意力放在這個領(lǐng)域的綜合方面：新的基因在不同寄主中的表達，內(nèi)酶的擴增，基因的刪除，酶活力修飾，轉(zhuǎn)錄的解調(diào)或酶的解調(diào)等。2023/2/316張星元：發(fā)酵原理（講座）

這樣所謂的代謝工程，在相當(dāng)程度上僅僅是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)表現(xiàn)形式，幾乎沒有工程的內(nèi)容，因此從生物過程的角度來衡量，并不是夠格的代謝工程。

2023/2/317張星元：發(fā)酵原理（講座）

與所有傳統(tǒng)的工程領(lǐng)域一樣，代謝工程也包含“分析”和“綜合”兩個規(guī)定的步驟。

2023/2/318張星元：發(fā)酵原理（講座）

重要的工程內(nèi)容存在于代謝工程的分析方面，例如：3.1

“分析”部分2023/2/319張星元：發(fā)酵原理（講座）①怎樣推算特定代謝流量等生理狀態(tài)參數(shù)？②怎樣用這些信息解釋代謝網(wǎng)絡(luò)的控制結(jié)構(gòu)（體系），進而提出達到某個目標(biāo)的合乎道理的修飾位點？

③怎樣進一步估計測定這些遺傳修飾和酶的修飾的真實的生化效果，以便進行下一輪的途徑修飾，直到達到目的？

④能不能提出一個合理的方法以確定代謝修飾的最有希望的靶位？

⑤？……2023/2/320張星元：發(fā)酵原理（講座）

綜合部分包括以分子生物學(xué)方法進行的綜合實驗：設(shè)計育種方案的制定，新的基因的導(dǎo)入和在寄主細胞中的表達，內(nèi)酶的擴增，基因的刪除，酶活力修飾，轉(zhuǎn)錄的解調(diào)或酶的解調(diào)等。3.2“綜合”部分2023/2/321張星元：發(fā)酵原理（講座）

在綜合方面，代謝工程的另一個不同尋常的特征是代謝途徑的“集成”，而往往不是單個反應(yīng)的導(dǎo)入。這樣，代謝工程研究的是整個代謝網(wǎng)絡(luò)，涉及到途徑分析和熱動力學(xué)可能性，途徑流量及其控制。2023/2/322張星元：發(fā)酵原理（講座）

我們研究的出發(fā)點正在經(jīng)歷從單個酶反應(yīng)向相互影響的生化反應(yīng)體系轉(zhuǎn)變。2023/2/323張星元：發(fā)酵原理（講座）通過對整個反應(yīng)體系而不是一個個孤立的反應(yīng)的考察就有可能獲得關(guān)于代謝和細胞功能的更全面的認(rèn)識，在這個的意義上“代謝網(wǎng)絡(luò)”的觀念是最為重要的。2023/2/324張星元：發(fā)酵原理（講座）

因此，代謝工程使用來自還原論者的大量的信息和研究技術(shù)，來進行設(shè)計和綜合。而關(guān)于整個體系的運轉(zhuǎn)狀態(tài)的觀察（工程數(shù)據(jù)采集），對于進一步的合理的分析來說，又是最好的指導(dǎo)。2023/2/325張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程讓人們把注意力轉(zhuǎn)向代謝網(wǎng)絡(luò)的整個體系而不是其組成部分。這個轉(zhuǎn)向說明基因工程已在總結(jié)經(jīng)驗和教訓(xùn)中走向成熟。2023/2/326張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程把發(fā)酵工程的兩個關(guān)鍵的組成部分菌種和發(fā)酵工藝控制凝聚在一起，這正是發(fā)酵原理的基本立場。在發(fā)酵工業(yè)的歷史上菌種和發(fā)酵工藝控制的分開，促進了發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化，也束縛了高精度發(fā)酵工程的發(fā)展。代謝工程使發(fā)酵工程返樸歸真，代謝工程是強化了生物學(xué)屬性的廣義的發(fā)酵工程。2023/2/327張星元：發(fā)酵原理（講座）

發(fā)酵原理（工業(yè)發(fā)酵的生物學(xué)原理）是代謝控制發(fā)酵通向代謝工程的橋梁，是分子生物學(xué)技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)上取得豐碩成果的向?qū)?，也是我國生物工程、發(fā)酵工程界后生超越前輩、領(lǐng)先世界的“內(nèi)功”。2023/2/328張星元：發(fā)酵原理（講座）

4代謝工程的含義

DNA重組技術(shù)剛進入可行階段不久，就出現(xiàn)了不少可用來說明這種技術(shù)在定向的途徑修飾方面的潛在應(yīng)用的術(shù)語。如分子育種（1981年），體外進化（1988年），微生物工程或代謝途徑工程（1988~1991年），細胞工程（1991年）和代謝工程（1991年），盡管不同的作者提出不完全相同的定義，這些定義均傳達了與代謝工程的總目標(biāo)和手段相似或遞進的含義。

2023/2/329張星元：發(fā)酵原理（講座）

幾十年來我們一直是用物理或化學(xué)誘變來改變微生物的遺傳特性。通過傳統(tǒng)的誘變和篩選，成功開發(fā)了大量的生產(chǎn)抗生素和氨基酸的菌種。在已知代謝途徑的基礎(chǔ)上，采用了一些精心設(shè)計的篩選方法，但是整體上這個方法還僅僅是一種“試差法”。2023/2/330張星元：發(fā)酵原理（講座）

DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)使人類的許多美好理想有可能成為現(xiàn)實。用目標(biāo)明確的遺傳修飾替代傳統(tǒng)的暗箱操作去改變代謝途徑，已取得可喜的成績。發(fā)酵工程和微生物代謝流的分析提供的信息，又可以校正遺傳修飾的精度，從而更進一步逼近預(yù)定目標(biāo)。2023/2/331張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程最初被定義為：

用DNA重組技術(shù)修飾特定的生化反應(yīng)或引進新的生化反應(yīng)，直接改善產(chǎn)物的形成和細胞的性能的學(xué)科。

2023/2/332張星元：發(fā)酵原理（講座）這樣定義的代謝工程的基本特征是工作目標(biāo)的確切性。也就是說，先要找到要進行修飾或要引進的目標(biāo)生化反應(yīng)，一旦找準(zhǔn)了目標(biāo)，就用已建立的分子生物學(xué)技術(shù)去擴增、去抑制或刪除、去傳遞相應(yīng)的基因或酶，或者解除對相應(yīng)的基因或酶調(diào)節(jié)，而廣義的DNA重組只是常規(guī)地應(yīng)用于不同步驟中，以便于達到這些目標(biāo)。2023/2/333張星元：發(fā)酵原理（講座）

也有人這樣給代謝工程下定義：

通過使用DNA重組和分子生物學(xué)技術(shù)，對代謝途徑進行修飾和（或）引進缺失，從而改變細胞的新陳代謝作用和（或）細胞特性的生物工程的分支。這樣的定義盡管強調(diào)了代謝工程目標(biāo)的確切性，但仍不能包容代謝工程的工程分析方面的內(nèi)容，仍不能做到“分析”和“綜合”的有機結(jié)合。

2023/2/334張星元：發(fā)酵原理（講座）

應(yīng)該根據(jù)代謝工程的生物學(xué)和工程學(xué)實質(zhì)來規(guī)范代謝工程的內(nèi)涵，給代謝工程下定義。2023/2/335張星元：發(fā)酵原理（講座）代謝工程的定義：

把量化代謝流及其控制的工程分析方法與根據(jù)分析結(jié)果制定的遺傳修飾方案付之實施的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以反復(fù)分析、校驗和修正的方式進行實際操作，改善微生物的產(chǎn)物形成的能力和微生物的細胞性能，從而滿足人類對生物的特定需求的生物工程的分支。2023/2/336