臨床醫(yī)學碩士研究生答辯ppt

Genistein后處理介導大鼠海馬CA1區(qū)eNOS/Nrf2/HO-1信號通路及其神經(jīng)保護作用研究生：****導師：****教授一、研究的背景及意義1.對缺血性腦中風發(fā)病機制及防治的研究已成為醫(yī)學界關(guān)注的重點。2.缺血大腦迅速獲得血液供應是阻止缺血性神經(jīng)元損傷的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進一步加重缺血組織的損傷--即缺血再灌注損傷。3.

氧化應激和炎癥是缺血再灌注損傷病理生理機制的重要組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產(chǎn)生，并迅速啟動損傷級聯(lián)，加劇了初始損害最終導致神經(jīng)元不可逆的損傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應激損傷是有效降低遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。4.Genistein具有酪氨酸激酶抑制劑活性和抗氧化作用。5、Genistein作為酪氨酸激酶抑制劑可有效減弱短暫全腦缺血造成的神經(jīng)元的延遲性死亡；一個單純的氧誘導的腦缺血小鼠模型顯示Genistein具有抗氧化活性。6.eNOS活性的升高對腦中風具有有益作用。另研究發(fā)現(xiàn)，Genistein能夠誘導eNOS活性并激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)，進而誘導抗氧化酶表達、減少心血管疾病的發(fā)生。那么，Genisteinpostconditioning(GPC，即缺血后給予Genistein)是否能通過eNOS/Nrf2/ARE信號通路降低氧化應激，從而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用？目前尚未見報道。本研究采用四動脈結(jié)扎(4-VO)全腦缺血模型，觀察GPC對缺血性神經(jīng)元的保護作用，并探討其可能的分子機制，為臨床防治缺血性腦中風提供理論依據(jù)。二、材料與方法1.主要實驗儀器和試劑大鼠腦立體定位儀大鼠腦微量注射泵冰凍切片機激光掃描共聚焦顯微鏡酶標儀電泳設(shè)備搖床Morris水迷宮超低溫冰箱等組織裂解液BCA蛋白濃度測定試劑盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相應的二抗NBT/BCIP顯色液NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及對應的熒光二抗TUNEL試劑盒2.實驗分組SPF級成年雄性SD大鼠隨機分組及4-VO模型ShamI/RVeh1(IR+DMSO)GPCVeh2(GPC+NaCl)L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m30m6h1d5d椎動脈電凝并分離頸總動脈缺血尾靜脈注射Genistein1mg/kg側(cè)腦室注射L-NAME1mg/5μl0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d3.技術(shù)路線圖再灌注5d檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡及存活實驗方法及檢測指標再灌注30min,6h,1d,3d觀察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表達免疫熒光染色法蛋白免疫印跡技術(shù)TUNEL染色及NeuN染色再灌注3d觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表達及定位Morris水迷宮再灌注7-9d，檢測大鼠的空間學習和記憶能力4.統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)整理后，應用SigmaStat3.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料數(shù)值以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD)，各實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keulstest)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。三、實驗結(jié)果與討論Genistein后處理是否具有神經(jīng)保護作用呢？圖1NeuN及TUNEL免疫熒光染色觀察再灌注5d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活及凋亡圖A：NeuN(紅色)染色：生存的神經(jīng)元；TUNEL(綠色)染色：凋亡樣神經(jīng)元；圖B：海馬CA1區(qū)1mm

長度內(nèi)NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖；圖C：海馬CA1區(qū)1mm長度內(nèi)

TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖;*P<0.05vs.I/R組，#P<0.05vs.GPC組，n=5;40×,bar=50μmABC小結(jié)1

Genistein后處理對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護作用，eNOS激酶抑制劑L-NAME減弱了該作用，說明eNOS可能參與了此保護作用。Genistein后處理是否誘導eNOS激活（磷酸化）?圖2GPC對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元eNOS、p-eNOS蛋白表達的影響圖A：再灌注不同時間點p-eNOS、eNOS蛋白的表達；Sh：Sham組；R：再灌注；－：I/R組；＋：GPC組；GPC:Genistein后處理；圖B：p-eNOS蛋白表達統(tǒng)計圖：n=4；*p<0.05vs.I/R組AB圖3L-NAME對再灌注3d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元eNOS磷酸化水平的影響圖A：各實驗組再灌注3dp-eNOS蛋白表達；圖B：各實驗組再灌注3dp-eNOS蛋白表達統(tǒng)計圖，n=5，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.Vehicle2組AB小結(jié)2Genistein后處理可誘導全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制劑L-NAME可有效降低GPC誘導的eNOS磷酸化水平。結(jié)果揭示：eNOS磷酸化水平升高參與了Genistein的神經(jīng)保護作用。Genistein后處理是否能有效降低缺血再灌注后神經(jīng)元的氧化應激損傷呢?4-HNE是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，被公認為氧化應激最穩(wěn)定的標記物8-OHdG，是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物圖4全腦缺血再灌注3d，各實驗組大鼠海馬CA1區(qū)4-HNE及8-OHdG免疫熒光染色GPCI/RABGPCI/R圖A：綠色:NeuN；紅色:4-HNE；圖B：紅色:DAPI；綠色:8-OHdG；n=4-5；40×；bar=50μm小結(jié)3

GPC能有效降低氧化應激損傷；eNOS激酶抑制劑L-NAME廢除了此神經(jīng)保護作用。Nrf2/ARE信號是生物體內(nèi)抗氧化應激反應最重要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。那么，GPC是否通過eNOS誘導了此信號通路?圖5A-CGPC促進大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2蛋白表達圖A：再灌注不同時間點核內(nèi)Nrf2蛋白表達；圖B：再灌注不同時間點核內(nèi)Nrf2蛋白表達統(tǒng)計圖，n=4，*p<0.05vs.I/R組；圖C：再灌注3d各實驗組Nrf2蛋白的表達及統(tǒng)計圖；*p<0.001vs.I/R組，#p<0.001vs.Vehicle2組ACB圖5D免疫熒光染色法觀察大鼠再灌注3d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)Nrf2的表達及定位綠色：Nrf2；紅色:NeuN；黃色：二者的共定位；40×；bar=30μm.L-NAME圖6大鼠再灌注3d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HO-1蛋白表達及其與Nrf2的共定位B圖A-B：HO-1蛋白表達及其統(tǒng)計圖；圖C：HO-1與Nrf2蛋白的共定位，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.vehicle2組；綠色：Nrf2；紅色：HO-1；藍色：DAPI；合成圖為三者的共定位；40×；n=4-5；bar=50μm；CL-NAMEI/RShamGPCVehicle2L-NAMEHO-1NeuNA小結(jié)4GPC可顯著增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核中Nrf2蛋白的表達并引起下游靶基因HO-1的表達，而L-NAME阻斷了此作用。此結(jié)果進一步揭示GPC通過eNOS誘導了Nrf2/HO-1抗氧化信號通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。海馬是學習和記憶的重要部位，而海馬CA1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域。那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空間學習記憶能力?圖7GPC對大鼠缺血后空間學習和記憶能力的影響圖A-B：潛伏實驗和探索實驗統(tǒng)計圖；n=5；*p<0.05vs.I/R組；#p<0.05vs.GPC組.圖C-D：潛伏實驗和探索實驗大鼠游泳路程軌跡圖DCAB小結(jié)5

GPC能有效的改善大鼠缺血后的空間學習和記憶能力。四、總結(jié)1.GPC對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護作用。2.GPC可通過誘導eNOS磷酸化水平并上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路，從而降低腦缺血誘導的氧化應激損傷。3.GPC能有效改善大鼠短暫全腦缺血后的認知功能。五、不足與展望1.GPC是否可增加Nrf2的DNA結(jié)合活性有待進一步研究。2.GPC是否也觸發(fā)了其它促生存信號轉(zhuǎn)導通路（如雌激素受體信號），從而起到抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用。其確切的機制還有待多層面、多角度的進一步探究。六、致謝實驗和論文的最終完成是我的