免疫組化結(jié)果分析和判斷教學(xué)課件

免疫組化結(jié)果的分析和判斷（要求：理解，熟記，會(huì)用）第一節(jié)免疫組化結(jié)果的判斷原則

免疫組化結(jié)果的判斷原則概括起來有以下幾點(diǎn)：

⒈必須同時(shí)設(shè)對(duì)照染色。沒有對(duì)照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的。

⒉抗原表達(dá)必須在特定部位。如LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)；EMA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。

⒊陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。由于檢測(cè)方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時(shí)應(yīng)注意。

⒋盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá)，特別是酶免疫標(biāo)記。因?yàn)檫@類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。

⒌對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對(duì)化，應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析。

第二節(jié)對(duì)照染色設(shè)計(jì)

(一）對(duì)照染色的目的

設(shè)對(duì)照的目的是為了排除假陰性和假陽性。假陰性的原因主要有三：①組織處理不當(dāng)，抗原丟失過多或被遮蔽；②抗體失活、效價(jià)過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；③染色步驟遺漏及差錯(cuò)，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強(qiáng)度不當(dāng)?shù)取?/p>

假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：①自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；②抗體試劑不純(特別是一抗）；③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)龋虎蹻c受體的干擾，等等。（二）對(duì)照的種類及其選用目的

對(duì)照染色大致可分為陽性組織對(duì)照、陰性組織及陰性試劑對(duì)照和自身對(duì)照四大類：9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:50PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3⒈陽性組織對(duì)照指用已證實(shí)含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢實(shí)驗(yàn)切片同時(shí)作同樣處理和免疫染色的組織對(duì)照。正確的結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)陽性，目的是為了證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。⒉陰性組織對(duì)照指用已證實(shí)不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)記染色的組織對(duì)照。正確的結(jié)果應(yīng)為陰性，目的是除外假陽性。⒊陰性試劑對(duì)照是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照；替代對(duì)照；吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，等。目的在于除外假陽性和證實(shí)所用免疫組化試劑及其技術(shù)方法的有效性和待檢實(shí)驗(yàn)切片免疫標(biāo)記陽性結(jié)果的可靠性。⑴空白對(duì)照

指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時(shí)還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。⑵取代對(duì)照指以所用方法第一抗體同源動(dòng)物的正常血清，或與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。⑶吸收試驗(yàn)是指用事先經(jīng)過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對(duì)照。結(jié)果應(yīng)是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時(shí)）。⑷抑制試驗(yàn)

是指用標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免疫組化染色試劑對(duì)照，結(jié)果其陽性著色應(yīng)成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對(duì)照多用于直接法。

這類陰性試劑對(duì)照的選用原則是：①空白對(duì)照不能省，其他對(duì)照在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量多做，尤其是應(yīng)用新抗體試劑；②對(duì)照必需與實(shí)驗(yàn)片同步進(jìn)行染色；③對(duì)照的結(jié)果應(yīng)附合要求。⒋自身對(duì)照是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。即與靶抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的顯色，結(jié)果應(yīng)為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對(duì)比。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性和因抗原彌散移位造成的錯(cuò)誤結(jié)果。

第三節(jié)非特異染色

非特異染色是指免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個(gè)環(huán)節(jié)，可來自：①內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；②試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)，F(xiàn)c受體干擾等)；③組織處理不當(dāng)(組織固定不及時(shí)或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。

糾正的方法視原因而異，可在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用有針對(duì)性的糾正對(duì)策，即對(duì)癥下藥(具體糾正方法不展開講了，同學(xué)們可以自己閱讀講義p123-126)。第四節(jié)陽性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷

免疫組化標(biāo)記具有一定形態(tài)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷。特點(diǎn)包括定性、定位和定量三方面。

免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計(jì)量，與抗原含量有關(guān)；陽性細(xì)胞的著色形態(tài)及組織分布特點(diǎn)主要是定位指標(biāo)，與功能有關(guān)。

一、陽性標(biāo)記免疫特征：分"弱(+)、中(++)、強(qiáng)(+++)"三級(jí)。免疫熒光法（FITC為例）則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光；

免疫酶標(biāo)記（HRP-DAB/H2O2）則表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強(qiáng)陽性區(qū)域。二、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例）可分為①胞膜型；②胞核型；③胞質(zhì)(漿)型；④微絨毛型和⑤復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細(xì)胞類型。這與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)合型圖像。三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例）免疫組化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：①局灶型；②彌漫型；③片塊型；④網(wǎng)狀型；⑤腺管型；⑥腔緣型和⑦菊?qǐng)F(tuán)型，等。這主要取決于抗原抗體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的群體分布特點(diǎn)。四、陽性標(biāo)記強(qiáng)度特征依照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）┅1分；中等陽性（++）┅2分；強(qiáng)陽性（+++）┅3分。依照陽性細(xì)胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+，指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%以下）；中等陽性（++,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%—49%)；強(qiáng)陽性（+++，指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。目前多采用積分綜合計(jì)量。計(jì)算公式為：（+）%x1+（++）%x2+（+++）%x3；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0-1.5者為(++),>1.5者為(+++)。至少隨機(jī)觀察5-10個(gè)HPF。第五節(jié)染色失敗的可能原因

免疫組化染色的基本要求有二：①實(shí)驗(yàn)切片的陽性抗原定位準(zhǔn)確，呈色鮮明，背景著色淺或無，二者的比值應(yīng)大于1（陽性/背景）；②對(duì)照染色的結(jié)果應(yīng)附合要求。否則，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是錯(cuò)誤的，或?yàn)榧訇栃曰驗(yàn)榧訇幮浴?/p>

假陽性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陽性，陰性組織對(duì)照或陰性試劑對(duì)照也呈陽性的結(jié)果，謂之假陽性。其原因與內(nèi)源性干擾，試劑不純，交叉反應(yīng)等有關(guān)。

假陰性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陰性，陽性組織對(duì)照及陰性試劑對(duì)照也均呈陰性的結(jié)果，謂之假陰性。其原因與組織處理不當(dāng)，組織細(xì)胞抗原丟失或試劑錯(cuò)誤(如漏加、錯(cuò)加、失效、變質(zhì)等),操作失誤等有關(guān)。對(duì)照結(jié)果判斷：表中1～5結(jié)果無效，6、7結(jié)果可靠（＋）（＋）（＋）（－）（＋）（＋）（－）檢測(cè)標(biāo)本含抗體，結(jié)果可靠（＋）（－）（－）7檢測(cè)標(biāo)本不含抗體結(jié)合可靠（－）（－）（－）6非特異染色（＋）（＋）（－）5陽性對(duì)照不含定位抗原（＋）（－）（－）4陰性對(duì)照內(nèi)含定位抗原(＋)(－)（－）（＋）3非特異性染色（＋）（＋）（＋）2抗體失活，操作有誤（－）（－）（－）1結(jié)果判斷檢測(cè)結(jié)果替代對(duì)照陰性對(duì)照陽性對(duì)照染色失敗原因：

均為陰性 均為弱陽性（除陰性對(duì)照） 背景染色過深 陽性對(duì)照好，待檢標(biāo)本弱陽性 陽性對(duì)照無背景，待檢標(biāo)本背景深判斷原則：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 抗體選擇 抗原定位性 抗原分布不均一性識(shí)別假陰性

抗原丟失或減弱 抗體失活 操作不當(dāng)識(shí)別假陽性

抗原彌散 抗原異位表達(dá) 瘤細(xì)胞吞噬 病變中正常組織殘留 抗體交叉反應(yīng) 內(nèi)源性物質(zhì)著色

邊緣反應(yīng)、刀痕、皺折、壞死或擠壓區(qū)域不作為判斷依據(jù)，應(yīng)用“正反法”原則免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化：

抗原特異性 抗體交叉反應(yīng)和標(biāo)記譜系 方法規(guī)范化 結(jié)果綜合分析和判斷9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***2/3/20234:42:50PM11、人總是珍惜為得到。03-2月-23**Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。***Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。03-2月-2303-2月-23**03February202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月2023**03-2月-2315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月23*03-2月-23*03February202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。**2/3/202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。***03-2月-23謝謝大家9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:50PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/3