高密度細(xì)胞庫(kù)建立與灌注培養(yǎng)

...wd......wd......wd...一種新的細(xì)胞擴(kuò)大方法使用高密度細(xì)胞庫(kù)，一次性生物反響器和灌注技術(shù)byBenjaminWright,MikeBruninghaus,MikeVrabel,JasonWalther,NehaShah,Seul-ABae,TimothyJohnson,JinYin,WeichangZhou,andKonstantinKonstantinov一個(gè)典型的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程從細(xì)胞解凍復(fù)蘇開(kāi)場(chǎng)，隨后通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)展擴(kuò)增，可選用的培養(yǎng)設(shè)備包括搖瓶、細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶、WAVE波浪袋生物反響器和機(jī)械攪拌生物反響器等〔1〕。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)體積和細(xì)胞密度到達(dá)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，細(xì)胞將轉(zhuǎn)入到生物反響器中繼續(xù)生長(zhǎng)并表達(dá)產(chǎn)物。這種方法目前還面臨著一些挑戰(zhàn)。搖瓶和轉(zhuǎn)瓶是細(xì)胞放大培養(yǎng)初期使用的主要設(shè)備，這兩種設(shè)備都需要在超凈工作臺(tái)中手動(dòng)操作，這種情況下容易出現(xiàn)污染，而且易受操作者失誤影響。此外，傳統(tǒng)的細(xì)胞庫(kù)保存細(xì)胞時(shí)，凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞在放大過(guò)程中耗時(shí)較長(zhǎng)。生產(chǎn)用生物反響器體積非常大，需要許多中間型號(hào)的培養(yǎng)設(shè)備來(lái)將種子細(xì)胞按比例放大，這將導(dǎo)致需要更長(zhǎng)的放大培養(yǎng)時(shí)間，并使情況變得更加復(fù)雜。生物反響器接種活細(xì)胞密度通常低于0.5×106cell/mL,接種細(xì)胞后需要培養(yǎng)生長(zhǎng)5-10天。在細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)，由于細(xì)胞密度達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)不能表達(dá)產(chǎn)物或產(chǎn)物含量低，這段時(shí)間不能產(chǎn)生實(shí)用價(jià)值。有研究說(shuō)明，建設(shè)高密度細(xì)胞庫(kù)可以減少細(xì)胞放大的步驟并提高細(xì)胞放大成功率。Taoetal.等人建設(shè)了高密度細(xì)胞庫(kù)，每?jī)龃婀苤谢罴?xì)胞量到達(dá)4.5×108個(gè)，細(xì)胞復(fù)蘇后直接接種到20L的WAVE波浪袋生物反響器中〔2〕。這項(xiàng)研究說(shuō)明，使用高密度細(xì)胞庫(kù)可以減少中間搖瓶放大步驟并且節(jié)約9天的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間。Heidemannetal.等人使用高密度細(xì)胞庫(kù)配合幾種不同大小的一次性生物反響器對(duì)細(xì)胞進(jìn)展放大培養(yǎng)，減少了60–70%的培養(yǎng)時(shí)間〔3〕。一次性生物反響器相比不銹鋼生物反響器具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如靈活性大大增強(qiáng)，節(jié)省安裝、清洗和滅菌時(shí)間，減少資本投資等〔4-6〕.GE公司的一次性WAVE波浪生物反響器常常用于種子細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，該種反響器可以大大減少污染風(fēng)險(xiǎn)〔通常不需要在層流罩下工作〕，而且不需要安裝、清洗和滅菌等操作〔7〕。目前工業(yè)化生產(chǎn)中，細(xì)胞灌注培養(yǎng)越來(lái)越受到人們關(guān)注。一些公司已經(jīng)成功的將細(xì)胞灌注培養(yǎng)用于商業(yè)化生產(chǎn)中〔9〕。使用灌注培養(yǎng)可以在較小體積的生物反響器中獲得高的細(xì)胞密度〔10〕，相比批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)能更快的收獲培養(yǎng)中的不穩(wěn)定產(chǎn)物〔11〕。由于這些和其他特點(diǎn)，灌注培養(yǎng)常常在最終生產(chǎn)產(chǎn)品的生物反響器上使用，而不在細(xì)胞擴(kuò)大過(guò)程中使用。Whitaker(12)andHeidemann(3)簡(jiǎn)單提及過(guò)灌注培養(yǎng)在細(xì)胞擴(kuò)大過(guò)程中的應(yīng)用，但他們沒(méi)有討論灌注培養(yǎng)在改進(jìn)終端細(xì)胞種擴(kuò)大、減小生物反響器大小、減少生物反響器培養(yǎng)步驟和減少細(xì)胞在生產(chǎn)用生物反響器中細(xì)胞生長(zhǎng)階段時(shí)間等方面的潛力。Pohlscheidt(13)使用了一臺(tái)帶有傾斜細(xì)胞沉降裝置的3000L生物反響器進(jìn)展細(xì)胞灌注培養(yǎng)，細(xì)胞密度到達(dá)15.8×106個(gè)/mL,相比流加培養(yǎng)減少了20%的培養(yǎng)時(shí)間。然而，由于細(xì)胞別離器對(duì)流加速率的限制，細(xì)胞長(zhǎng)期在次優(yōu)的條件下生長(zhǎng)，想要進(jìn)一步提高細(xì)胞密度變得相當(dāng)困難〔10〕。在這里，我們描述了一種新的細(xì)胞擴(kuò)大方法，該方法需要使用到高密度細(xì)胞庫(kù)、一次性波浪生物反響器和交替切向流〔ATF〕灌注培養(yǎng)技術(shù)。圖1中比較了一個(gè)用常規(guī)方法將細(xì)胞擴(kuò)大到500L生產(chǎn)用生物反響器〔n〕中的例子。使用高密度細(xì)胞庫(kù)方法減少了中間兩個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反響器中。使用波浪生物反響器〔2L和20L〕代替轉(zhuǎn)瓶〔125ml到10L〕大大減少了需要在超凈臺(tái)中操作的次數(shù)。這種替換使整個(gè)過(guò)程在一個(gè)封閉系統(tǒng)中進(jìn)展，提高了操作成功率。ATF灌注培養(yǎng)技術(shù)在n-1級(jí)生物反響器〔圖中為帶有ATF灌注裝置的50L生物反響器〕的應(yīng)用能使細(xì)胞密度大于50×106個(gè)/ml。這種細(xì)胞擴(kuò)大方式將使得500L生物反響器接種細(xì)胞密度到達(dá)5×106個(gè)/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的接種密度0.5×106個(gè)/ml。更高的接種細(xì)胞密度可以為500L生物反響器減少5天細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間，可以為500L生物反響器生產(chǎn)線節(jié)省50天操作時(shí)間。材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)基：市場(chǎng)可買到確實(shí)定組分培養(yǎng)基(LifeTechnologies)，添加4毫摩爾谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(Genzyme公司專利，能生產(chǎn)一種人類重組蛋白酶)在2L和20L波浪袋生物反響器中擴(kuò)大細(xì)胞:我們解凍一支高密度細(xì)胞凍存管(10×107個(gè)活細(xì)胞/ml,4.5mL/支)直接接種2L波浪袋生物反響器(GEHealthcareLifeSciences)，工作體積為1L。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)3.0×106個(gè)/mL時(shí)，我們將細(xì)胞擴(kuò)大到20L波浪袋生物反響器中培養(yǎng)，工作體積為7.5L。一個(gè)20/50EHTDWave生物反響器系統(tǒng)(GEHealthcareLifeSciences)作為2L和20L生物反響器搖擺平臺(tái)，控制培養(yǎng)溫度37°C,搖晃速度16rpm，搖晃角度7°，20%的O2和5%的CO2混合氣體以0.25slpm的速度進(jìn)入頂部空間。種細(xì)胞n-1反響器灌注培養(yǎng):我們使用了一臺(tái)15L玻璃生物反響器(Broadley-JamesCorporation)，配備了ATF4灌流裝置來(lái)模仿n-1細(xì)胞種擴(kuò)大階段(圖1中的50L生物反響器)。一個(gè)20um的微孔進(jìn)氣管加氧氣，控制溶解氧(DO)在40%；一個(gè)1mm孔徑的進(jìn)氣管加氮?dú)?，控制溶解的co2水平<120mmHg壓力。根據(jù)需要，我們添加了0.5M碳酸鈉以保持Ph>6.85,添加10%消泡劑(LifeTechnologies)控制泡沫水平。我們使用一臺(tái)15L的生物反響器進(jìn)展細(xì)胞培養(yǎng)，工作體積為10L，接種細(xì)胞密度0.5×106個(gè)/ml，批次培養(yǎng)兩天后開(kāi)場(chǎng)灌注培養(yǎng)。在開(kāi)場(chǎng)，使用一個(gè)活細(xì)胞濃度在線分析電極(AberInstruments)和可編程邏輯控制程序(EmersonProcessManagement)控制灌注速率為0.2nL/cell/day。當(dāng)活細(xì)胞濃度到達(dá)20×106個(gè)/ml時(shí)，限制灌注速率為每天4個(gè)工作體積。50ml轉(zhuǎn)管批次換液培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)接種不同細(xì)胞密度：當(dāng)n-1級(jí)種子反響器中細(xì)胞密度到達(dá)25×106、50×106、100×106個(gè)/ml時(shí)分別取樣，接種到50ml轉(zhuǎn)管〔TPPTechnoPlasticProducts〕中，接種密度為0.5×106、2.5×106、5.0×106個(gè)/ml三種不同密度類型，工作體積為10ml，每個(gè)培養(yǎng)管做3份平行樣。由于轉(zhuǎn)管不能做灌注，采取每天換液的方式培養(yǎng)。從第一天開(kāi)場(chǎng)給轉(zhuǎn)管更換培養(yǎng)基，更換方法是將轉(zhuǎn)管從培養(yǎng)箱拿出后用1100rpm離心5min，棄上清，參加新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。這種換液策略能夠保證接種不同濃度細(xì)胞的轉(zhuǎn)管具有一樣的換液速率。轉(zhuǎn)管在高頻脈沖恒溫?fù)u床〔HTInfors〕中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，搖晃頻率160rpm，角度45°，相對(duì)濕度80%，CO2濃度5%。生產(chǎn)用生物反響器：我們采用一臺(tái)15L的生物反響器〔Broadley-JamesCorporation〕來(lái)模擬圖1中的500L生物反響器，工作體積為10L，配備了ATF4灌流裝置(RefineTechnology)和0.2um孔徑的PES材質(zhì)過(guò)濾器。一個(gè)20um的微孔進(jìn)氣管加氧氣，控制DO為40%，一個(gè)1mm孔徑的管加氮?dú)猓?，控制溶解的co2水平<120mmHg壓力，添加了0.5M碳酸鈉以保持Ph>6.85,使用蠕動(dòng)泵添加10%消泡劑(LifeTechnologies)控制泡沫水平。一套生產(chǎn)用生物反響器接種批次培養(yǎng)獲得的種子細(xì)胞，細(xì)胞接種密度較低(5.0×106個(gè)/ml)。培養(yǎng)一天后開(kāi)場(chǎng)灌注培養(yǎng)，灌注速率為0.5個(gè)培養(yǎng)體積/天，然后每天增加0.5個(gè)培養(yǎng)體積，直到灌注速率到達(dá)2個(gè)培養(yǎng)體積/天。另一套生產(chǎn)用生物反響器接種n-1灌注種子罐培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，細(xì)胞接種密度較高〔5.0×106個(gè)/ml〕。由于接種密度較高，接種細(xì)胞的同時(shí)開(kāi)場(chǎng)進(jìn)展灌注培養(yǎng)，灌注速率為2個(gè)培養(yǎng)體積/天。兩套生物反響器安裝活細(xì)胞濃度在線分析電極，使用該電極和蠕動(dòng)泵控制活細(xì)胞濃度在40×106個(gè)/ml，培養(yǎng)運(yùn)行50天。分析方法：我們使用ViCellXR細(xì)胞存活率分析儀(BeckmanCoulter)檢測(cè)活細(xì)胞濃度，使用RAPIDLab血?dú)夥治鰞x(Siemens)離線檢測(cè)pHandpCO2，使用特異光度酶活性分析法定量蛋白質(zhì)含量。結(jié)果和討論在n-1細(xì)胞種生物反響器中使用ATF灌注方法進(jìn)展高密度細(xì)胞培養(yǎng)：圖2展示了包括波浪袋生物反響器和n-1生物反響器在內(nèi)的細(xì)胞種活細(xì)胞密度曲線。2L的波浪袋生物反響器培養(yǎng)8天，20L的波浪袋生物反響器培養(yǎng)5天，n-1生物反響器培養(yǎng)12天，最終細(xì)胞密度到達(dá)110×106個(gè)/ml，細(xì)胞存活率大于98%。在培養(yǎng)9天后，細(xì)胞密度到達(dá)50×106個(gè)/ml，可以滿足接種500L反響器時(shí)接種密度到達(dá)5×106個(gè)/ml〔假設(shè)n-1反響器體積為50L〕。從培養(yǎng)2天后開(kāi)場(chǎng)，n-1生物反響器維持灌注速率為0.2nL/cell/day，補(bǔ)料速度隨著細(xì)胞密度升高而自動(dòng)加快。成功使用這種補(bǔ)料策略需要活細(xì)胞濃度在線分析電極能準(zhǔn)確的測(cè)定出活細(xì)胞的濃度。在這里，我們僅僅使用這種策略持續(xù)到第7天，然后將灌注速率改為4個(gè)培養(yǎng)體積/天。在細(xì)胞生長(zhǎng)期使用這種控制策略可以準(zhǔn)確的控制灌注速率，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。之前有報(bào)道說(shuō)明，0.05–0.10nL/cell/day的灌注速率差異會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品表達(dá)產(chǎn)生影響〔14〕。我們的策略中，灌注速率隨細(xì)胞生長(zhǎng)自動(dòng)調(diào)整，可以防止這種差異造成的影響，相比之下，在批次逐步放大過(guò)程中，操作人員需要手動(dòng)調(diào)節(jié)速率〔15〕。評(píng)估n-1細(xì)胞種生物反響器細(xì)胞傳代密度和終端生產(chǎn)生物反響器細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：我們使用一個(gè)小型的轉(zhuǎn)管模型來(lái)推斷n-1種子反響器中細(xì)胞密度是如何影響終端生產(chǎn)用生物反響器內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的。當(dāng)n-1反響器中細(xì)胞密度到達(dá)25×106、50×106、100×106個(gè)/ml時(shí)分別取樣，每種樣品接種到三個(gè)轉(zhuǎn)管中，接種密度為0.5×106、2.5×106、5.0×106個(gè)/ml三種不同密度類型，每個(gè)培養(yǎng)管做3份平行樣。每天更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基頻率根據(jù)接種細(xì)胞密度進(jìn)展調(diào)整，保證每個(gè)培養(yǎng)轉(zhuǎn)管在一樣細(xì)胞密度下有同樣的灌注速率。圖4比較了不同接種密度條件下細(xì)胞的數(shù)量和活力。由于轉(zhuǎn)管最大灌注速率為1個(gè)培養(yǎng)體積/天，為了和生物反響器相匹配，我們僅僅將細(xì)胞密度培養(yǎng)到20×106個(gè)/ml。我們觀察到不同細(xì)胞密度取樣和三種不同接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，但是在n-1種子反響器中細(xì)胞密度為100×106個(gè)/ml時(shí)取的樣品在接種初期細(xì)胞活力相對(duì)較低。為了研究n-1反響器的細(xì)胞傳代密度和生產(chǎn)反響器的接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)率的影響，我們做了相應(yīng)的比照實(shí)驗(yàn)。一組采用n-1反響器細(xì)胞密度50×106個(gè)/ml時(shí)傳代，接種密度為5×106個(gè)/ml。另一組采用n-1反響器細(xì)胞密度2.5×106個(gè)/ml時(shí)傳代，接種密度為0.5×106個(gè)/ml。圖5對(duì)這兩種情況進(jìn)展了比較。在整個(gè)50天培養(yǎng)過(guò)程中，兩種接種條件的細(xì)胞都保持了90%以上的細(xì)胞活力。圖6說(shuō)明的是在不同接種條件下特定產(chǎn)物和細(xì)胞總量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。很明顯，在接種密度高的情況下，細(xì)胞密度穩(wěn)定在40×106個(gè)/ml〔圖5〕并高濃度表達(dá)產(chǎn)物的時(shí)間提前了4到5天。經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)和操作優(yōu)勢(shì)：我們的細(xì)胞擴(kuò)大方法在經(jīng)濟(jì)和操作兩方面都具有優(yōu)勢(shì)。例如以5×106個(gè)/ml細(xì)胞密度接種500L生物反響器可以減少4-5天細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，相比50天的培養(yǎng)周期提升了10%的生產(chǎn)力。我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在n-1階段反響器上將細(xì)胞密度培養(yǎng)到100×106個(gè)/ml，如果使用10×106個(gè)/ml細(xì)胞密度接種500L生物反響器，可以再減少5-6天細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間。如果終端生產(chǎn)生物反響器使用的時(shí)批次或者流加工藝，這種細(xì)胞擴(kuò)大方法同樣可以用來(lái)提供種子細(xì)胞。如果一個(gè)流加培養(yǎng)的500L生物反響器培養(yǎng)周期為21天，使用5×106個(gè)/ml細(xì)胞接種密度可以縮短25%的培養(yǎng)時(shí)間，這樣每年可以多生產(chǎn)5-6批產(chǎn)品，提升25%-30%的生產(chǎn)效率。通常情況下，批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)比灌注培養(yǎng)需要更大體積的生物反響器，細(xì)胞放大過(guò)程需要多級(jí)不同型號(hào)生物反響器。圖7對(duì)常規(guī)放大過(guò)程和流加反響器放大過(guò)程接種10000L生產(chǎn)反響器進(jìn)展了比較。在n-1階段使用50L生物反響器灌注培養(yǎng)，細(xì)胞密度到達(dá)50-100×106個(gè)/ml時(shí)接種10000L生物反響器，接種密度為0.25-0.5×106個(gè)/ml，這樣可以減少兩個(gè)中間放大步驟。這種方法的好處是可以減少250L的反響器和500L的反響器，節(jié)省使用空間，同時(shí)大量減少前期資本投入。一種簡(jiǎn)化的細(xì)胞擴(kuò)大方法：我們的研究結(jié)果說(shuō)明這種新的細(xì)胞擴(kuò)大方式是完全可行的，這種方法需要使用高密度細(xì)胞庫(kù)、一次性反響器和n-1階段生物反響器灌注技術(shù)。這種新的細(xì)胞放大程序減少了一些細(xì)胞放大步驟，省略了許多清洗、安裝和滅菌過(guò)程，大大簡(jiǎn)化了細(xì)胞擴(kuò)大程序。工業(yè)化生產(chǎn)可以使用同樣的操作策略，用50L的生物反響器替代n-1階段設(shè)備，用500L的生物反響器替代終端生產(chǎn)生物反響器。在n-1階段生物反響器上使用ATF灌注技術(shù)，培養(yǎng)12天后細(xì)胞密度不超過(guò)100×106個(gè)/ml，此時(shí)進(jìn)一步放大培養(yǎng)不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性。我們的研究說(shuō)明，使用5×106個(gè)/ml細(xì)胞密度接種500L生物反響器可以使細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)間減少4-5天，從而使50天的培養(yǎng)周期中生產(chǎn)生物產(chǎn)品時(shí)間提高10%。在n-1階段使用灌注技術(shù)的方法可以可以有多個(gè)變種，例如可以使用500L生物反響器作為n-1階段細(xì)胞種子反響器，接種細(xì)胞密度提高到10×106個(gè)/ml。相比批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)，當(dāng)使用更大的生物反響器生產(chǎn)時(shí)〔比方10000L〕,我們可以在n-1階段使用50L灌注生物反響器作為種子反響器，通過(guò)提高細(xì)胞密度減少傳代擴(kuò)大步驟。References1 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