長期定位施肥對石灰紫色土真菌特性的影響

四川農(nóng)業(yè)大學◎碩士學位論文答辯姓名：李芳指導老師：張小平教授專業(yè)：土壤學長期定位施肥對石灰性紫色土主要內(nèi)容選題背景及依據(jù)1研究目的意義及技術路線2材料與方法3結(jié)果與分析4致謝5第一部分選題背景及依據(jù)

是影響土壤質(zhì)量及其可持續(xù)利用最深刻的農(nóng)業(yè)措施之一，會對土壤結(jié)構(gòu)、生物肥力和生產(chǎn)力產(chǎn)生重要影響。我國一種特有的土壤資源，分布面積廣泛?？煞譃樗嵝宰仙痢⒅行宰仙梁外}質(zhì)紫色土。分解植物殘體，釋放維持植物生長的營養(yǎng)。促進植物生長，防御植物病害等，也可造成植物病害。紫色土施肥真菌前人土壤理化性質(zhì)，作物產(chǎn)量生物學角度？表型分析分子足跡多樣性群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化選題背景及依據(jù)第二部分研究目的意義及技術路線

利用表型分析和“分子足跡”技術研究不同施肥制度對石灰性紫色土相關真菌特性和土壤活性的影響，可以為在該類土壤上建立長效合理施肥制度，保護土壤真菌，維持土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)。本試驗通過采集遂寧長期定位施肥試驗田內(nèi)的土壤，通過傳統(tǒng)的實驗室培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學方法的有機結(jié)合，旨在研究在不同施肥方式和不同作物種類下石灰性紫色土真菌生物量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性，為長期定位施肥下石灰性紫色土中真菌對土壤質(zhì)量方面的影響提供科學依據(jù)。

研究目的、意義創(chuàng)新點第二部分研究目的意義及技術路線技術路線土樣采集樣品處理富集培養(yǎng)長期定位施肥對石灰性紫色土真菌特性的影響群落結(jié)構(gòu)分析分離計數(shù)分類生物量測定群落結(jié)構(gòu)分析侵染率測定孢子分離鑒定理化性質(zhì)分析真菌分析AMF分析

第三部分材料與方法叢枝菌根真菌（AMF）培養(yǎng)鑒定方法

叢枝菌根真菌（AMF）侵染率測定方法

真菌和AMF群落結(jié)構(gòu)PCR-DGGE測定方法

真菌數(shù)量及生物量測定方法

土壤理化性質(zhì)分析研究區(qū)概況和土樣采集第三部分材料與方法12345678無肥NN,PN,P,K農(nóng)肥(M)農(nóng)肥(M),N農(nóng)肥N,P農(nóng)肥,N,P,K整個試驗小區(qū)之間用水泥板隔開，留有排水溝。

名稱：氮、磷、鉀長期定位肥料試驗

面積：總面積：2畝，小區(qū)面積：0.2畝。土壤類型：原生鈣質(zhì)紫色土試驗開始時間：1982年。

研究區(qū)域概況施肥處理輪作方式：水稻-小麥。

采集于四川省遂寧市船山區(qū)的石灰性紫色土壤采樣時間2009.5小麥收割后

2009.10水稻收割后采樣方法梅花形采樣法一部分樣品立即用于VA菌根的富集培樣一部分放于室內(nèi)風干，用于土壤基礎理化性質(zhì)的分析另一部分新鮮土壤研磨過篩后，裝入無菌袋中，置于4℃冰箱保存，以供可培養(yǎng)真菌分離與計數(shù)，生物量分析和群落結(jié)構(gòu)分析土樣采集第三部分材料與方法采用常規(guī)分析方法土壤理化性質(zhì)的測定pH，有機質(zhì)，全氮，堿解氮，全磷，速效磷，速效鉀真菌數(shù)量分析AMF多樣性分析培養(yǎng)基馬丁氏培養(yǎng)基分離與計數(shù)平板稀釋法分類

真菌鑒定手冊真菌生物量分析高效液相色譜測定土壤中麥角甾醇來反映其生物量真菌細胞膜雙層結(jié)構(gòu)的重要組成成分加富培養(yǎng)孢子分離改進的濕篩-蔗糖梯度離心法種的鑒定VA菌根真菌鑒定手冊侵染率測定KOH-透明法第三部分材料與方法試驗方法采用FastDNASPINKitForSoil(Bio-RadCo.)的試劑盒方法微生物總DNA的提取PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析18SrDNA的PCR擴增土壤總DNA提取

真菌18SrDNA的PCR擴增PCR反應程序參考Smit的方法AMF18SrDNA的PCR擴增采用Nested-PCR程序用第三次PCR純化產(chǎn)物進行DGGE，采用變性梯度為20％～50％的8％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后采用銀染法對凝膠進行染色。DGGE指紋圖譜分析借助于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進行條帶判讀、遷移率、強度計算及聚類分析。土壤真菌和AMF群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE方法

第三部分材料與方法數(shù)據(jù)處理Shannon-Wiener指數(shù)(H)

EH=H/Hmax=H/lnSPi為某一條帶的強度與同泳道中所有條帶總強度的比值，S為每一泳道總的條帶數(shù)。

真菌計數(shù)：每克干土中菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土%。種的豐度：SR=AM真菌總種次數(shù)/土壤樣本數(shù)。孢子密度：SD=某采樣點所有土樣中AM真菌孢子級數(shù)/該點土樣數(shù)。頻度計算：F=（某屬或種的出現(xiàn)次數(shù)/土樣數(shù)）×100%。相對多度公式：RA=該采樣點AM真菌某屬或種的孢子數(shù)/該采樣點總孢子數(shù)×100%.AM菌根侵然率=∑（0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+…+100%×根段數(shù)）/觀察總根段數(shù)。第三部分材料與方法結(jié)果與分析第四部分結(jié)果與分析土壤理化性質(zhì)真菌數(shù)量生物量AMF多樣性指數(shù)PCR-DGGE分析土樣名pH有機質(zhì)(g/kg)全量N、P、K（%）有效量N、P、K、Mn、B、Mo、Zn、緩效K（mg/kg）全氮全磷全鉀堿解氮有效磷有效鉀緩效鉀有效錳有效硼有效鉬有效鋅鈣質(zhì)紫色土8.615.90.1090.1352.68966.33.9130.6699.46.90.180.060.74鈣質(zhì)紫色土定位試驗田的養(yǎng)分狀況小麥栽培土壤樣品主要理化性質(zhì)下降增加第四部分結(jié)果與分析·土壤理化性質(zhì)

項

目編

號pH水分（%）全氮（%）水解氮（mg/kg）有效磷（mg/kg）速效鉀（mg/kg）有機質(zhì)（mg/kg）M8.124.5850.1712105.211.36149.52.323NM8.234.8870.1706104.512.18117.12.442NPM8.114.2320.1668108.567.36120.82.703NPKM8.094.2090.1770127.169.27149.72.775CK8.244.1730.138490.8810.93181.62.084N8.164.4830.213288.728.766151.32.328NP8.094.0750.1496101.866.03118.82.604NPK8.084.4870.1798121.651.51140.32.612水稻栽培土土壤樣品主要理化性質(zhì)下降增加PH：7.50-8.24，屬于偏堿性范圍

有效磷的含量較高

第四部分結(jié)果與分析·土壤理化性質(zhì)項

目編號pH水分（%）全氮（%）水解氮（mg/kg）有效磷（mg/kg）速效鉀（mg/kg）有機質(zhì)（mg/kg）M7.504.0430.158684.9511.40164.52.126NM8.133.9930.163799.9412.79132.02.340NPM8.094.9870.1599114.567.61105.62.571NPKM7.984.0570.1781110.872.50191.42.537CK8.203.9690.146977.3211.45153.72.067N8.224.9900.2132103.414.26128.12.266NP8.023.9420.1654102.853.71156.72.524NPK8.023.7530.1591108.358.55175.52.728有機質(zhì)的含量：2.067（CK）-2.775(MNPK)mg/kg

NPK肥處理中真菌數(shù)量明顯增加

農(nóng)家肥配施N肥真菌數(shù)量達到最高長期不同施肥對石灰性紫色土可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響第四部分結(jié)果與分析·真菌數(shù)量圖1不同施肥處理下可培養(yǎng)真菌數(shù)量Fig.1ThenumberofsoilfungusondifferentfertilizertreatmentsCKNNPNPKMMNMNPMNPK真菌數(shù)量：小麥種植土>水稻種植土鑒定出的真菌種類第四部分結(jié)果與分析·真菌種類共鑒定出4屬的真菌，包括青霉屬（Penicillium）木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）和被孢霉屬（Mortierella）。青霉屬曲霉屬被孢霉屬木霉屬作物Crops青霉屬Penicillium木霉屬Trichoderma曲霉屬Aspergillus被孢霉屬Mortierella小麥水稻48.144.740.721.344.414.918.519.1石灰性紫色土中真菌各屬的頻度小麥種植土青霉屬最高被孢霉屬

最低頻度水稻種植土青霉屬最高曲霉屬最低第四部分結(jié)果與分析·真菌·頻度

配置5ug/ml麥角甾醇標樣，采用反相C18柱（4.6×250mm），流動相為甲醇，流速1ml/min，進樣量為10ul，測出麥角甾醇標樣的出峰時間。

按照20，10，5，2.5，1.25，0.625ug/ml的濃度配成麥角甾醇標準溶液，按照上述色譜條件，以麥角甾醇濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，測出他們的線性方程。不同施肥處理對土壤真菌生物量的影響

液相色譜法第四部分結(jié)果與分析·真菌·生物量第四部分結(jié)果與分析·真菌·生物量圖2麥角甾醇標樣色譜圖Fig.2HPLCofergostrolstandard圖3麥角甾醇標準曲線Fig.3standardcurceofergostrol長期不同施肥處理對土壤真菌生物量的影響

第四部分結(jié)果與分析·真菌·生物量真菌生物量種植不同作物也有影響MNP配施，真菌的生物量最高，達到40.835ug/ml。

無機肥配施有機肥提高真菌的生物量CKCKNNPNPKMMNMNPMNPK不同施肥處理對真菌生物量的影響第四部分結(jié)果與分析·真菌·群落結(jié)構(gòu)長期不同施肥處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響小麥種植土水稻種植土真菌18SrDNA的DGGE指紋圖譜分析

農(nóng)家肥加無機肥的處理條帶數(shù)多于單獨施加無機肥的處理

小麥種植土中條帶數(shù)和顏色濃度均高于水稻種植土條帶最少顏色最淺施肥處理TreatmentShannon指數(shù)Shannon'sdiversityindex(H)豐富度Richness均勻度Evenness(EH)小麥水稻小麥水稻小麥水稻CK2.172.07980.9890.994N2.762.051680.9960.986NP2.192.18990.9970.991NPK2.552.051380.9940.987M2.382.4311120.9970.979NM2.552.241370.9980.972NPM2.301.841040.9960.945NPKM2.301.331080.9990.963不同施肥處理下石灰性紫色土真菌群落基因多樣性指數(shù)

小麥種植土>水稻種植土添加磷肥的低于無磷肥的處理農(nóng)家肥+無機肥的處理略低于無機肥的處理第四部分結(jié)果與分析·真菌·群落結(jié)構(gòu)真菌群落多樣性的聚類分析

小麥種植土中真菌的DGGE聚類圖

水稻種植土真菌的DGGE聚類圖

MNPK

NP

NPKMNP

CK

NMN

MNNPKCKNPMNPMNPKMNM相似度高說明其中含有的真菌的種類最接近種植不同作物，施肥能使土壤中真菌的種族發(fā)生變化第四部分結(jié)果與分析·真菌·群落結(jié)構(gòu)小結(jié)表型分析——數(shù)量、生物量分子足跡——群落結(jié)構(gòu)相對于無肥處理而言，長期施肥可以提高土壤可培養(yǎng)真菌生物量和種群豐富度，其中農(nóng)家肥的施用比單獨施用無機肥中的真菌增加的更多；8種施肥處理中，長期氮磷化肥與有機肥配合施用處理(NPM)的土壤真菌生物量和種群最高。以對照組的無肥處理（CK）最低。對于種植不同作物而言，小麥種植土中真菌生物量和種群比水稻種植土中的高。第四部分結(jié)果與分析·真菌·小結(jié)不同施肥處理對石灰性紫色土中叢枝菌根真菌（AMF）的影響第四部分結(jié)果與分析·叢枝菌根真菌·侵染率處理CKNNPNPKMMNMNPMNPK小麥土16.40b17.67a0.00e0.23e4.67d10.60c0.00e0.23e水稻土14.50a9.77b0.00d0.43d2.60c3.30c0.13d0.53d不同施肥處理土壤中AMF的根系侵染率

農(nóng)家肥、磷肥對AMF侵染率的影響較大被AMF侵染的根系被AMF侵染的根系侵染根系的菌絲分離出的AMFAMFx1x2x3x4x5x6x7x8s1s2s3s4s5s6s7s8A.denticulateA.excavateA.tuberculataAr.leptotichaE.schnckiiG.albidumG.bireticulataG.caledoniumG.constrictumG.dimorphicumG.etunicatumG.geosporumG.manihotisG.mosseaeG.multicauleG.tortuosumG.versiforme

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++第四部分結(jié)果與分析·分離出的叢枝菌根真菌

共分離出17種AMF，球囊霉屬(Glomus)12種，占70.5%，無梗囊霉屬（Acaulospora）3種，占17.6%，原囊霉屬（Archaeospora）和內(nèi)養(yǎng)囊霉屬（Entrophospora）各1種，各占5.9%。注：x代表種植小麥后采集的土壤，s代表種植水稻后采集的土壤，1-8代表8種不同的施肥處理，+代表出現(xiàn)了該種，空白表示未出現(xiàn)該種。AMF的形態(tài)特征施肥處理Tretment種的豐度

孢子密度(級.50g土-1)Speciesrichnesssporedensity(Grad.50gsoil-1)小麥土(Wheat)水稻土(Rice)小麥土(Wheat)水稻(Rice)CKNNPNPKMMNMNPMNPK1294927864128754725734721434126854126854227444726作物Crops球囊霉屬Glomus無梗囊霉屬Acaulospora原囊霉屬

Archaeospora

內(nèi)養(yǎng)囊霉屬Entrophospora小麥水稻77.677.515.517.53.52.53.52.5不同施肥處理下石灰性紫色土中AMF種的豐度和孢子密度AMF各屬的頻度

第四部分結(jié)果與分析·AMF·豐度頻度AMF種的豐度、密度：無機肥處理>添加農(nóng)家肥土壤小麥種植土>水稻種植土處理Treatments球囊霉屬Glomus無梗囊霉屬Acaulospora原囊霉屬

Archaeospora

內(nèi)養(yǎng)囊霉屬EntrophosporaCK52.2041.76.0N100000NP64.535.500NPK100000M49.250.800MN59.540.500MNP53.446.600MNPK57.342.700處理球囊霉屬Glomus無梗囊霉屬Acaulospora原囊霉屬

Archaeospora

內(nèi)養(yǎng)囊霉屬EntrophosporaCK60.2027.012.8N69.1030.90NP62.537.500NPK59.540.500M81.118.900MN76.416.007.6MNP53.846.200MNPK72.927.100小麥根圍AMF各屬的相對多度

水稻根圍AMF各屬的相對多度

第四部分結(jié)果與分析·AMF·相對多度長期定位施肥對石灰性紫色土AMF群落結(jié)構(gòu)的影響AMF的18SrDNA的DGGE指紋圖譜分析水稻種植土小麥種植土無機肥配施農(nóng)家肥的處理比無機肥處理的條帶數(shù)多，顏色更深DGGE條帶在箭頭所指處的條帶表現(xiàn)為缺失，說明施磷處理會導致土壤中的AMF某些特異種群的消失31第四部分結(jié)果與分析·AMF·群落結(jié)構(gòu)2施肥處理TreatmentShannon指數(shù)Shannon'sdiversityindex(H)豐富度Richness均勻度Evenness(EH)水稻小麥水稻小麥水稻小麥CK2.382.7213180.9290.941N2.572