GMP質(zhì)量體系29、微生物限度檢查操作規(guī)程29

____________________________________________________________________________________________________第13頁(yè)共13頁(yè)文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A編制人編制日期年月日復(fù)制份數(shù)審核人審核日期年月日頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期年月日生效日期分發(fā)部門(mén)質(zhì)檢科、質(zhì)?？?、質(zhì)量管理部編訂依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版目的：建立一個(gè)微生物限度檢查操作規(guī)程。范圍：物料檢驗(yàn)。責(zé)任：檢驗(yàn)員、QA監(jiān)控員、質(zhì)檢科長(zhǎng)、質(zhì)?？崎L(zhǎng)、質(zhì)量總監(jiān)。內(nèi)容：微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。包括染菌量及控制菌的檢查。供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量。檢查的全過(guò)程，均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告以1g、1ml或10cm2為單位。培養(yǎng)基及其制備方法除另有規(guī)定外，培養(yǎng)基制備的滅菌條件為121℃20分鐘。1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胨10g肉浸液1000ml氯化鈉5g取胨和氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基胨5g玫瑰紅鈉0.0133g葡萄糖10g瓊脂15～20g磷酸二氫鉀1g水1000ml硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過(guò)，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。3酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A胨10g葡萄糖20g水1000ml酵母浸出粉5g瓊脂15～20g除葡萄糖外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過(guò)，加入葡萄糖，分裝，滅菌。4膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）胨20g磷酸氫二鉀（K2HPO4）4.0g水1000ml乳糖5g磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.3g氯化鈉5g牛膽鹽（或去氧膽酸鈉0.5g）2g除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.4±0.2,煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。5曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml20%乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液1.3～1.6ml取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60℃，按無(wú)菌操作加入滅菌的其它3種溶液，搖勻，傾注平皿。6麥康凱瓊脂培養(yǎng)脂（MacC）胨20g氯化鈉5g瓊脂15～20g乳糖10g1%中性紅指示液3ml水1000ml牛膽鹽5g除乳糖、指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌。冷至約60℃，傾注平皿。74-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,MUG)培養(yǎng)基胨10g磷酸二氫鉀0.9g氯化鈣50mg硫酸銨5g磷酸氫二鈉(無(wú)水)6.2g氯化鈉10g硫酸錳0.5mg亞硫酸鈉40mg水1000ml硫酸鋅0.5mg去氧膽酸鈉1g硫酸鎂0.1gMUG75mg除MUG外，各成分溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入MUG，溶解后，每管分裝5ml，115℃滅菌20分鐘。8三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）胨20g葡萄糖1g0.2%酚磺酞指示液12.5ml牛肉浸出粉5g氯化鈉5g瓊脂12～15g乳糖10g硫酸亞鐵0.2g水1000ml蔗糖10g硫代硫酸鈉0.2g文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A除三糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層(2～3cm)短斜面。9四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）胨5g碳酸鈣10g水1000ml牛膽鹽1g硫代硫酸鈉30g取上述成分，混合，微溫使溶解，滅菌。臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml加入碘溶液（取碘6g與碘化鉀5g，溶于20ml水中）0.2ml和0.1%亮綠試液0.1ml，混勻。10沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(SS)胨5g硫代硫酸鈉8.5g牛肉浸出粉5g乳糖10g中性紅指示液2.5ml亮綠試液0.33ml牛膽鹽8.5g瓊脂20g枸椽酸鐵銨1g枸椽酸鈉8.5g水1000ml除乳糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1，濾過(guò)，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。11膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）胨20g去氧膽酸鈉1g中性紅溶液3ml牛肉浸出粉3g硫代硫酸鈉2.3g瓊脂18-20g乳糖10g枸櫞酸鈉1g水1000ml蔗糖10g枸櫞酸鐵銨1g除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余成分，搖勻，冷至約60℃，傾注平皿。12溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基胨10g氯化鈉5g瓊脂15-20g牛肉浸出粉3g溴化十六烷基三甲銨0.3g水1000ml除瓊脂外，取上述成分,混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.5±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。13亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基臨用前，取滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml中加入新配制的1%亞碲酸鈉（鉀）溶液0.2ml，混勻，即得。14卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨6g氯化鈉30g瓊脂23g文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A牛肉浸出粉1.8g10%氯化鈉卵黃液100ml水650ml除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.6±0.1，滅菌，待冷至約60℃，以無(wú)菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋一個(gè)，以無(wú)菌操作取出卵黃，放入10%滅菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。15甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨10g氯化鈉75g瓊脂15-20g牛肉浸出粉1g酚磺酞指示液2.5ml水1000ml甘露醇10g除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過(guò)，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。16蛋白胨水培養(yǎng)基胰蛋白胨10g氯化鈉5g水1000ml取上述成分混合，加熱溶化，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，滅菌。17磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基胨7g葡萄糖5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）3.8g水1000ml取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，滅菌15分鐘。18枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉5g枸櫞酸鈉（無(wú)水）2g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.2g溴麝香草酚藍(lán)指示液20ml磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g瓊脂15-20g磷酸二氫銨(NH4H2PO4)1g水1000ml除溴麝香草酚藍(lán)指示液和瓊脂外，取上述成分,混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為6.9±0.1，加入瓊脂，加熱溶化，加入指示劑，混勻。分裝于小試管，滅菌，置成斜面。注：所用瓊脂應(yīng)不含游離糖，用前用水浸泡沖洗。19糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)液胨10g0.5%酸性品紅指示液10ml糖、醇0.5%（或溴麝香草酚藍(lán)指示液6ml）氯化鈉5g水1000ml取胨和氯化鈉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4，加入指示劑混勻，分裝每瓶100ml，121℃滅菌15分鐘。配制葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，于100ml基礎(chǔ)液加入0.5g葡萄糖，分裝于含杜氏管(Durham)的小文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A試管中，121℃滅菌15分鐘。配制其它糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，將各種糖、醇分別配成10%溶液，與基礎(chǔ)液同時(shí)于121℃滅菌15分鐘。以無(wú)菌操作將5ml糖、醇溶液加入100ml基礎(chǔ)液內(nèi)，分裝于滅菌小試管中。注：糖、醇溶液亦可采用薄膜過(guò)濾法除菌。20脲(尿素)瓊脂培養(yǎng)基胨1g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2g瓊脂20g葡萄糖1g0.2%酚磺酞指示液6ml水1000ml氯化鈉5g20%無(wú)菌脲溶液100ml除脲瓊脂外，取上述成分，混合，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化并分裝于錐形瓶，滅菌。冷至50-55℃，加入無(wú)菌脲溶液，混勻，分裝于滅菌試管中，置成斜面。21氰化鉀培養(yǎng)基胨3g碳酸二氫鉀0.225g氰化鉀試液15ml氯化鈉5g磷酸氫二鈉5.64g水1000ml除氰化鉀試液外，取上述成分，混合，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5±0.1，滅菌。冷卻后，加入氰化鉀試液，分裝于12mm×100mm滅菌試管內(nèi)，每管4ml，立即用滅菌橡皮塞塞緊，置4℃保存。同時(shí)，以不加氰化鉀試液的培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，分裝于滅菌試管中。22賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基胨5g葡萄糖1gL-賴氨酸（DL-賴氨酸）0.5(1)g酵母浸出粉3g1.6%溴甲酚紫指示液1ml水1000ml除賴氨酸外，取上述成分，混合，加熱溶解后，加入L-賴氨酸（DL-賴氨酸），調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為6.8，同時(shí)以不加賴氨酸培養(yǎng)基作為對(duì)照。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管2.5ml并滴加一層液體石蠟，121℃滅菌10分鐘。23綠膿菌素（pyocyanin）測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂）胨20g硫酸鉀10g瓊脂18-20g氯化鎂（無(wú)水）1.4g甘油10ml水1000ml取胨、氯化鎂和硫酸鉀加入水中，微溫使溶解。調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻、分裝于試管，滅菌，置成斜面。24明膠培養(yǎng)基胨5g明膠120g牛肉浸出粉3g水1000ml取上述成分加入水中，浸泡約20分鐘，隨時(shí)攪拌，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，滅菌。25硝酸鹽胨水培養(yǎng)基文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A胨10g亞硝酸鈉0.5g酵母浸出粉3g水1000ml硝酸鉀2g取胨和酵母浸出粉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.3±0.1，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解，混勻，分裝于含杜氏管的小試管，滅菌。試藥牛肉浸出粉Beefextractpowder本品為米色粉末，在水中溶解。牛膽鹽Oxbilesalt本品為淡黃色或黃棕色粉末；味苦而甜，具吸濕性，在水和醇中易溶。玫瑰紅鈉(四氯四碘熒光素鈉)Rosebengal［C20H2Cl4Na2O5=1017.6］本品為棕紅色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，無(wú)熒光；在硫酸中溶解，溶液為棕色。枸櫞酸鐵銨Ammoniumferriccitrate[C12H22FeN3O14=488.16]本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末，易潮解，見(jiàn)光易還原成亞鐵。在水中溶解，在醇和醚中不溶。胰蛋白胨Tryptone本品為米黃色粉末，在水中溶解。液狀石蠟Paraffinliquid本品為無(wú)色油狀液體。在水和醇中不溶，能與醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油類相混溶。DL-賴氨酸DL-Lysine[C6H14N2O2=146.19]本品為白色結(jié)晶；極易潮解。在水中溶解。L-賴氨酸L-Lysine[C6H14N2O2=146.19]本品為白色針狀結(jié)晶，在空氣中易吸收二氧化碳。在水中易溶，在醇中微溶，在醚中不溶。酸性品紅Fuchsinacid[C20H17N3Na2O9S3=585.54]本品為綠色有金屬光澤的顆?；蛏罴t色粉末。在水中溶解，在醇中不溶。磷酸二氫銨AmmoniumdihydrogenphosphateNH4H2PO4=115.03]本品為無(wú)色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。試液二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液取二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鮮少量配制，于冷處避光保存，如試液變成紅褐色，不可使用。無(wú)菌對(duì)氨基苯甲酸試液取對(duì)氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的帶塞試管中，121℃滅菌20分鐘。玫瑰紅鈉試液取玫瑰紅鈉試液0.1g，加水使溶解成75ml。亞碲酸鈉（鉀）試液取亞碲酸鈉（鉀）0.1g，加新鮮煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A無(wú)菌枸櫞酸鈉-氯化鈉試液取枸櫞酸鈉0.5g，加0.9%氯化鈉溶液10ml，121℃滅菌20分鐘。草酸銨試液取草酸銨1g，加水溶解使成100ml。亮綠試液取亮綠0.1g，加水100ml使溶解。氫氧化鉀試液取氫氧化鉀40g，加水使溶解成100ml。鹽酸試液取鹽酸8.4ml，加水稀釋至100ml。а-萘酚乙醇試液取а-萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇溶解使成100ml。氰化鉀試液取氰化鉀0.5g，加水溶解使成100ml。氯化三苯四氮唑試液取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。靛基質(zhì)試液取對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，或取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。稀釋劑0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃滅菌20分鐘。無(wú)菌磷酸緩沖液（PH7.2）取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121℃滅菌20分鐘。指示液中性紅批示液取中性紅1.0g，研細(xì)，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.8-8.0（紅→黃）甲基紅指示液取甲基紅0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。亞甲藍(lán)指示液取亞甲藍(lán)0.5g，加水溶解使成100ml。酚磺酞指示液取亞甲藍(lán)0.5g，加1mol/L氫氧化鈉溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.8～8.4(黃→紅)。溴甲酚紫指示液取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇溶解使成100ml。變色范圍pH5.2-6.8（黃→紫）。溴麝香草酚藍(lán)指示液取溴麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.0-7.6（黃→藍(lán)）酸性品紅指示液（Andrade指示）取酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加入1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第2滴，直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時(shí)，濾過(guò)，即得。變色范圍pH6.0-7.4（黃→紅）供試品的檢驗(yàn)量每批供試品檢驗(yàn)量一般為10g或10ml?；瘜W(xué)藥膜劑為100cm2，貴重的或微量包裝的供試品檢文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A驗(yàn)量可以酌減，但口服藥品不得少于3g，外用藥品不得少于5g。供試品均須取自2個(gè)以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑除須取自2個(gè)以上包裝單位外，應(yīng)取自4丸（片）以上樣品。供試液的制備按供試品的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方法制成供試液。1液體供試品取供試品10ml，加入稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。油劑可加適量聚山梨酯80；氣霧劑以適宜方法使拋射劑導(dǎo)出后，加入適量稀釋劑，混勻，吸取相當(dāng)于10g或10ml供試品，再稀釋成100ml作為供試液；合劑（系指含王漿或蜂蜜者，下同）與滴眼劑可用供試品作為供試液。2固體、半固體或粘稠液供試品稱取供試品10g，置0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜方法，混勻后，作為供試液。在制備過(guò)程中，必要時(shí)可加適量吐溫-80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過(guò)45℃。（1）非水溶性供試品取供試品5g(5ml)，加入含溶化的無(wú)菌司盤(pán)805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45℃左右的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液約80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1∶20）。（2）不溶于水的膜劑供試品取規(guī)定量，剪碎，加稀釋劑100ml（必要時(shí)可增加稀釋劑），浸泡，振搖，作為供試液。（3）腸溶膠囊（片）供試品稱取供試品10g，置含無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)100ml的錐形瓶?jī)?nèi)。于45℃水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。3含抑菌成分供試品供試品如干擾控制菌檢驗(yàn)，按以下方法處理后，依法檢查。（1）稀釋法將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。（2）離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。（3）薄膜過(guò)濾法取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45μm±0.02μm微孔濾膜的過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50-100ml，取出濾膜備檢。（4）中和法凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。對(duì)照用菌液控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對(duì)照試驗(yàn)。對(duì)照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）44102]、沙門(mén)氏菌[CMCC（B）50094]、銅綠假單胞[CMCC（B）10104]及金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]。取相應(yīng)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A-20小時(shí)后，稀釋至1∶106。對(duì)照菌的加入量為50-100個(gè)。檢查法1細(xì)菌、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)（1）平皿菌落計(jì)數(shù)法取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成1∶102、1∶103等適宜的稀釋度。分別取連續(xù)三級(jí)10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每個(gè)稀釋級(jí)應(yīng)作2-3個(gè)平皿。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，前者同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌、酵母菌落數(shù)，后者同時(shí)點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。合劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測(cè)定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計(jì)數(shù)。液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。菌數(shù)測(cè)定陰性對(duì)照試驗(yàn)取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml，置4個(gè)無(wú)菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)、檢查，不得長(zhǎng)菌。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，分別在24及48小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以48小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌、酵母培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，分別在48小時(shí)及72小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)。點(diǎn)計(jì)后，計(jì)算各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋級(jí)，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級(jí)作為報(bào)告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如有1個(gè)稀釋級(jí)在30-300（30-100）之間時(shí)，將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)在30-300（30-100）之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值。當(dāng)比值≤2時(shí)，以兩稀釋級(jí)的均值報(bào)告，當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有3個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在30-300之間時(shí)，以后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如當(dāng)1∶10（或1∶100）稀釋級(jí)平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1∶10）稀釋級(jí)時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定，按測(cè)定結(jié)果報(bào)告菌數(shù)。（2）培養(yǎng)基稀釋法取供試液（原液或1∶100供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）。每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml注入的5個(gè)平板的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如各稀釋級(jí)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告數(shù)為小于10個(gè)。2控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A后接種，經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)等項(xiàng)檢查。（1）大腸桿菌(Escherichiacoli)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌50-100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18-24小時(shí)（必要可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，取上述3份培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)與24小時(shí)時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀察、陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性，供試液MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性、無(wú)熒光，MUG陰性。然后加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)液澄明，并證明無(wú)菌生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18～24小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（Ⅰ）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V－P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按表1規(guī)定判定判斷結(jié)果。靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，沿壁管加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。甲基紅試驗(yàn)（M）取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P試驗(yàn)）取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入а-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，在4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(C)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)48～72小時(shí)，培養(yǎng)基斜面有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變時(shí)為陰性。（2）沙門(mén)菌(Salmonellaapecies)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18-24小時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取其余2份培養(yǎng)物各1ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10ml中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18-24小時(shí)或延至40-48小時(shí)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽(yáng)性菌落時(shí)，供試品的平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表2所列特征時(shí)，可判為未檢出沙門(mén)菌。如供試品平板生長(zhǎng)的菌落特征有與表2所列的菌落形態(tài)特征相等或疑似者，均應(yīng)挑選2-3個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，陽(yáng)性對(duì)文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A照的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽(yáng)性，而供試品疑似菌斜面未見(jiàn)紅色。底層未見(jiàn)黃色，可判為未檢出沙門(mén)氏菌。否則，應(yīng)繼續(xù)做以下試驗(yàn)。表2沙門(mén)氏菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色靛基質(zhì)試驗(yàn)照大腸桿菌項(xiàng)下方法操作并判斷結(jié)果。脲酶試驗(yàn)取疑似菌斜面培養(yǎng)物接種于脲瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，斜面變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，不變色為陰性。氰化鉀試驗(yàn)取培養(yǎng)20-24小時(shí)的疑似菌株?duì)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，分別用白金耳沾取1環(huán)，接種至對(duì)照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基，立即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24-48小時(shí)，對(duì)照管應(yīng)有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)管有菌生長(zhǎng)者為陽(yáng)性，無(wú)菌生長(zhǎng)為陰性。賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)取疑似菌斜面培養(yǎng)物分別接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基。培養(yǎng)24～48小時(shí)，對(duì)照管應(yīng)為黃色，試驗(yàn)管呈紫色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。動(dòng)力檢查取疑似菌斜面培養(yǎng)物穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基管中，培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)菌沿穿刺外周擴(kuò)散生長(zhǎng)，為動(dòng)力陽(yáng)性，否則為陰性。陰性培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2-3天后，再判斷。血清凝集試驗(yàn)在潔凈載玻片一端，以白金耳沾取沙門(mén)氏菌屬A~F“0”多價(jià)血清2-3環(huán)，再取斜面上部的培養(yǎng)物少許，與血清混合，將玻片前后側(cè)動(dòng)，如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，應(yīng)以0.9%氯化鈉溶液與同株培養(yǎng)物作對(duì)照試驗(yàn)，無(wú)凝集現(xiàn)象時(shí)判為血清凝集陽(yáng)性。時(shí)有反應(yīng)遲緩，需將玻片與濕棉球置平皿內(nèi)，約過(guò)20分鐘，再觀察。仍未出現(xiàn)凝集時(shí)，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量0.9%氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30分鐘，待冷，再作凝集試驗(yàn)。如出現(xiàn)凝集，應(yīng)判為陽(yáng)性，否則為陰性。上述各項(xiàng)試驗(yàn)反應(yīng)，一般應(yīng)為硫化氫陽(yáng)性（或陰性），靛基質(zhì)陰性，脲酶陰性，氰化鉀陰性，賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，動(dòng)力陽(yáng)性，A~F“0”多價(jià)血清凝集試驗(yàn)陽(yáng)性。各鑒定結(jié)果按表3判定。表3沙門(mén)氏菌檢查結(jié)果判定序號(hào)血清凝集試驗(yàn)（A~F“O”血清）生化試驗(yàn)結(jié)果凝集反應(yīng)100℃30分鐘凝集反應(yīng)0.9%氯化鈉溶液對(duì)照1陽(yáng)性陰性符合檢出沙門(mén)2陰性陽(yáng)性陰性符合檢出沙門(mén)3陰性陰性不符合未檢出沙門(mén)上述各項(xiàng)試驗(yàn)任何一項(xiàng)不符合或有可疑反應(yīng)的培養(yǎng)物，均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后作出結(jié)論。（3）銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑文件名稱微生物限度檢查操作規(guī)程文件編號(hào)JB-TZ-029-A作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18-24小時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，其余2份培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18-24小時(shí)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽(yáng)性菌落時(shí)，供試品的平板無(wú)菌落或無(wú)疑似菌落生長(zhǎng)，可判未檢出銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無(wú)定形、周邊擴(kuò)散，表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如生長(zhǎng)菌落具有上述特征或疑似者，應(yīng)挑選2-3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時(shí)，取培養(yǎng)物革蘭氏染色，并做氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，再滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)呈粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。如證實(shí)為非革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均可判為未驗(yàn)出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。綠膿菌素（Pyocyanin）試驗(yàn)取上述瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)后，在試管內(nèi)加氯仿3-5ml，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將氯仿移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸溶液1ml，振搖后，靜置片刻，如在鹽酸溶液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為綠膿菌素陽(yáng)性。試驗(yàn)同時(shí)應(yīng)有陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性時(shí)，并為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素陽(yáng)性，可判定檢出銅綠假單胞菌。綠膿菌素陰性的培養(yǎng)物，應(yīng)繼續(xù)做以下試驗(yàn)。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，如在培養(yǎng)基的杜氏管中有氣體產(chǎn)生，即