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細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選第三章細(xì)胞工程電子課件細(xì)胞克隆的概念與意義植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞克隆技術(shù)種子細(xì)胞篩選主要內(nèi)容3.1細(xì)胞克隆的概念與意義細(xì)胞系細(xì)胞克隆細(xì)胞株有限細(xì)胞系(FiniteCellLine)無(wú)限細(xì)胞系(InfiniteCellLine)一個(gè)克隆的細(xì)胞群體是從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖而來(lái)。分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法成為細(xì)胞的克隆化(cloning)。

從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),形成均一的細(xì)胞群,這群細(xì)胞具有一定的生物學(xué)特性和遺傳標(biāo)記,并在繼代培養(yǎng)中仍能保持其特性和標(biāo)記,這群細(xì)胞就稱為細(xì)胞株(cellstrain)。3.2.1愈傷組織誘導(dǎo)誘導(dǎo)獲得的愈傷組織可以用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán),也可以將愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,加入經(jīng)過(guò)殺菌處理的玻璃珠,進(jìn)行振蕩培養(yǎng),使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞,然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾,除去大細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)?,得到一定體積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。3.2.2平板培養(yǎng)所謂平板培養(yǎng)(platingculture)是指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來(lái)衡量。植板率是能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。3.2.3看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)(nurseculture)技術(shù)首先是有Muir等(1954)設(shè)計(jì)的,其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織,再在愈傷組織上放一小片濾紙,待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)以后,將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長(zhǎng)。

3.2.5其他改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)Horsch等(1980)將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法,該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后,先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上,然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層,再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上,然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中。3.3.1原代培養(yǎng)primaryculture取材培養(yǎng)組織解離機(jī)械分離

取材解離一般是借助酶和鰲合劑處理組織,使其成為分散的細(xì)胞。常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶,鰲合劑主要有EDTA-Na和檸檬酸鈉。動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程不同取材方法,原代細(xì)胞培養(yǎng)方式亦不相同.一般來(lái)講,分離獲得的材料多采用組織塊培養(yǎng),而通過(guò)解離獲得的細(xì)胞材料多采用單層細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)方法

將解離獲得的細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液配制成需要的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)水平放置,37℃下靜止培養(yǎng)每隔1-2天換培養(yǎng)液一次培養(yǎng)一定時(shí)間后,細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底即形成一單細(xì)胞層。單層細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)

更換培養(yǎng)基容易便于觀察不同條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)后期容易使用灌注技術(shù)改善營(yíng)養(yǎng)條件細(xì)胞貼附于基底質(zhì)上,更容易表達(dá)產(chǎn)物單層細(xì)胞培養(yǎng)可適用于許多動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)。適用細(xì)胞具有非貼壁特性的細(xì)胞,如血細(xì)胞、腹水細(xì)胞等,或者通過(guò)機(jī)械攪拌和振蕩能夠較好地維持懸浮狀態(tài)的細(xì)胞。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)在相應(yīng)的培養(yǎng)容器內(nèi)接種一定密度的細(xì)胞懸液。接種密度與細(xì)胞倍增時(shí)間有關(guān),倍增時(shí)間在24-48h的細(xì)胞類型接種密度以105/ml細(xì)胞為宜,倍增時(shí)間在12-18h的細(xì)胞類型接種密度以2×104/ml為宜。單個(gè)培養(yǎng)瓶的接種體積以厚度不超過(guò)2cm為好?;痉椒ㄅc植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)相似3.3.2繼代培養(yǎng)subculture單層細(xì)胞培養(yǎng)貼壁細(xì)胞再培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)從原代培養(yǎng)物中解離細(xì)胞:震蕩法在培養(yǎng)瓶中加入平衡鹽溶液,輕輕震動(dòng)培養(yǎng)瓶,可以使貼壁疏松的細(xì)胞進(jìn)入到溶液內(nèi),然后收集洗滌用于培養(yǎng)。蛋白酶消化用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋白酶消化液,37℃處理5-15min.,然后洗滌用于培養(yǎng)。EDTA溶液洗滌用PBS配制1mmoll-1dEDTA,棄去原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入EDTA洗滌細(xì)胞,然后再用0.25%的胰蛋白酶消化,次法用于貼壁性極強(qiáng)的細(xì)胞獲取。機(jī)械剝離用細(xì)胞刮、細(xì)胞鏟或其它工具直接剝離原代培養(yǎng)物。

切取擬培養(yǎng)的動(dòng)物器官或大組織塊

洗去血污

剔除多余成分

切成約1mm3大小的組織塊將所有組織剪碎

用于組織培養(yǎng)蛋白酶溶液消化

機(jī)械方法吹打組織塊

離心、培養(yǎng)液懸浮

計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度

用于分離細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)步驟例1

乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)

準(zhǔn)備工作

A.培養(yǎng)用品消毒后,安放在超凈工作臺(tái)內(nèi),紫外線消毒,做好洗手等準(zhǔn)備工作。B.點(diǎn)燃酒精燈,用品按布局放置,安裝吸管等。乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)a.采用頸椎脫臼法,將一只新生乳鼠處死

b.將小鼠放入盛有酒精的燒杯中數(shù)秒

c.置超凈工作臺(tái)內(nèi)d.打開(kāi)消毒器械包用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開(kāi)腹腔,充分暴露腹腔

e.用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔背壁脊柱f.取下雙側(cè)腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中g(shù).用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中,清洗腎臟3次,盡量去掉血污.

h.將腎組織用解剖剪剪成幾塊,再用PBS漂洗,去凈血液.1.將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的組織塊。

2.加入5-8倍體積的0.25%胰蛋白酶,蓋好放入37℃水浴中消化20-30分鐘,注意應(yīng)每隔5分鐘振搖一次。

3.當(dāng)組織塊變得疏松,顏色略白時(shí),取出置于超凈工作臺(tái)內(nèi).

胰蛋白酶消化4.用吸管反復(fù)吹打組織塊,使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。5.加入1-2ml培養(yǎng)液終止消化,凈置片刻,讓未消化完的組織塊自然下沉,將上部的組織懸液移入無(wú)菌離心管中。

1.800-1000rpm離心8-10min,取上清加入適量培養(yǎng)液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝;

2.在細(xì)胞瓶(板)上標(biāo)明細(xì)胞名稱,代數(shù),日期;

3.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后置37℃孵箱中培養(yǎng)。離心及計(jì)數(shù)

培養(yǎng)細(xì)胞每天觀察,檢查:A.污染與否?B.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞觀察如見(jiàn)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁,為污染;如培養(yǎng)液為桔紅色,表明細(xì)胞狀況良好。在無(wú)污染時(shí),24h內(nèi)有細(xì)胞貼壁,圓形懸浮狀的細(xì)胞延展成短梭狀。

培養(yǎng)3-4天,細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,可見(jiàn)細(xì)胞島形成。細(xì)胞透明,顆粒少,界線清。

由于細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,代謝產(chǎn)物堆積,CO2增多,培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色,但液體澄清,此時(shí)應(yīng)換液。例二魚類細(xì)胞培養(yǎng)

魚類原代細(xì)胞的培養(yǎng)

A斷尾(或剪腮)放血

B用0.01%高錳酸鉀溶液或70%的乙醇浸泡消毒30分鐘。

C70%酒精棉球擦洗解剖部位

D剖開(kāi)腹腔,取出組織,清除粘膜和血液,剪碎,維持液(Hanks液)或緩沖液(PBS)洗。

E用0.25%胰酶消化(20℃,30’或4℃,過(guò)夜)F離心(1000rpm,10’),棄去消化液G用培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù),分裝培養(yǎng)(應(yīng)在2x104個(gè)細(xì)胞/ml以上)。

A長(zhǎng)成單層的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,加胰酶-EDTA,消化后棄去消化液

B加培養(yǎng)基,吹打分散

C分裝培養(yǎng)

傳代細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)的魚類傳代細(xì)胞及顯微觀察結(jié)晶紫染色熒光染料染色活體細(xì)胞3.3.3單細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆化的技術(shù)大致可歸納為三類。稀釋鋪板

用足夠體積的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液,使鋪板后呈單個(gè)細(xì)胞分布。

基質(zhì)附著

將稀釋的細(xì)胞懸液接種到適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上,使單個(gè)細(xì)胞在基質(zhì)上固著、繁殖生長(zhǎng),形成細(xì)胞群落,然后再取單個(gè)細(xì)胞群落進(jìn)行再培養(yǎng)。瓊脂克隆

有些細(xì)胞如病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞,可以懸浮狀態(tài)克隆化,因此可以采用植物細(xì)胞克隆的方式,用瓊脂或瓊脂糖包埋。

3.4種子細(xì)胞篩選種子細(xì)胞的概念及意義選擇壓篩選細(xì)胞誘變3.4.1種子細(xì)胞的概念及意義適用于工業(yè)化生產(chǎn)的種子細(xì)胞,必須滿足以下幾個(gè)基本條件:分散性好;均一性好;生長(zhǎng)迅速;細(xì)胞中次生產(chǎn)物含量高;細(xì)胞生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。植物細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次培養(yǎng)以后,往往會(huì)發(fā)生變異,需要從中選育出優(yōu)良的植物細(xì)胞,使其特性得以保持或改良。植物細(xì)胞選良和改良方法篩選誘變小細(xì)胞團(tuán)篩選法選擇壓力篩選法3.4.2選擇壓篩選選擇壓力篩選法是通過(guò)添加某些對(duì)不同的細(xì)胞有不同作用效果的物質(zhì),淘汰部分敏感細(xì)胞,而選擇得到所需的細(xì)胞的選育方法。一般可以分為正選擇和負(fù)選擇兩種。正選擇就是把受選擇的細(xì)胞群體置于一定的選擇壓力下,部分細(xì)胞在選擇壓力的作用下受到淘汰,而有一些耐受抗選擇壓力的細(xì)胞可以生長(zhǎng),從而選擇得到所需的細(xì)胞。正選擇適用于對(duì)抗性突變體的選擇。如以NaCl為選擇劑選擇耐鹽突變體,以除草劑為選擇劑選擇抗除草劑突變體等。正選擇可一步完成,也可分多步完成。一步選擇法有利于篩選單基因突變的細(xì)胞,而對(duì)于遺傳背景不詳且可能是多基因的突變或是細(xì)胞質(zhì)基因突變,采用多步法為好。負(fù)選擇法也叫富集選擇法。在植物細(xì)胞篩選中,常用致死富集法。在負(fù)選擇實(shí)驗(yàn)中,選擇的對(duì)象是在一定選擇壓的作用下不能生長(zhǎng)的那些細(xì)胞,而能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞受到淘汰。負(fù)選擇適用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的選擇。影響細(xì)胞篩選效果的因素親本材料對(duì)篩選效果的影響培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力的施加方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響親本材料對(duì)篩選效果的影響親本材料的選用是否得當(dāng),對(duì)于細(xì)胞篩選的成敗有重要影響,首先應(yīng)該選用優(yōu)良的、僅存在個(gè)別缺點(diǎn)需要改進(jìn)的基因型。還必須注意染色體的倍數(shù)性水平和培養(yǎng)細(xì)胞再生植株的能力。培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響用來(lái)進(jìn)行篩選的細(xì)胞,基培養(yǎng)方式主要可分為四種:愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞固體培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響某些抗代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中只有很短的半衰期。如果有關(guān)的細(xì)胞系生長(zhǎng)很慢,那么抗代謝產(chǎn)物可能在敏感細(xì)胞死亡前降解。因此,敏感的變異體可能在不允許其生長(zhǎng)的條件下存活下來(lái)。生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞也容易發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化,這些變化可能使植株再生困難或不可能再生,尤其是當(dāng)在培養(yǎng)體中累積了非整倍體時(shí)更是如此。選擇壓力施加方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力可一次性施加,也可逐步施加。在有些離體選擇實(shí)驗(yàn)中,選擇壓力的施加方式對(duì)最終的選擇效果可能沒(méi)有什么影響。但在另一些情況下,選擇壓力的施加方式直接影響到選擇的成敗。3.4.3細(xì)胞誘變誘變是指通過(guò)各種誘變劑的作用,使細(xì)胞發(fā)生變異的過(guò)程。是獲得優(yōu)良植物細(xì)胞的有效方法之一。常用的誘變劑有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩種。物理誘變劑:包括X射線、γ射線、中子、α粒子、β粒子、紫外線等。紫外線的能量較低,不能引起被照射物質(zhì)離子化,因而叫做非電離誘變因子,其余物理誘變劑均稱為電離誘變因子。物理誘變劑處理方法:外照射;內(nèi)照射。物理誘變劑外照射,即射線由被照射物質(zhì)的外部透入內(nèi)部誘發(fā)突變。又分為急照射和慢照射。內(nèi)照射,即放射源引入到植物組織或細(xì)胞內(nèi)使其放出射線誘發(fā)突變。常用的方法有浸泡法、注射法和飼入法?;瘜W(xué)誘變劑:根據(jù)對(duì)DNA的作用特點(diǎn),主要分三類,包括堿基類似物、烷化劑、疊氮化合物。此外一些抗菌素也可作為誘變劑。在DNA復(fù)制時(shí),誘發(fā)配對(duì)錯(cuò)誤。如5-溴尿嘧啶。誘發(fā)染色體斷裂。如馬來(lái)酰阱、重氮比氨酸、絲裂霉素C、鏈霉素C等。改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu):甲基磺酸乙酯、疊氮化鈉、亞硝基胍等?;瘜W(xué)誘變劑誘變的基本過(guò)程單細(xì)胞制備預(yù)培養(yǎng)誘發(fā)突變篩選突變株材料的選擇預(yù)處理細(xì)胞材料的制備制備細(xì)胞懸浮液(一)制備單細(xì)胞用于突變體篩選的最理想的材料是單細(xì)胞或原生質(zhì)體,也可用莖尖、腋芽等。目前用得最多的材料是愈傷組織。材料的選擇采用誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變處理。根據(jù)植物種類需對(duì)誘變劑的含量、時(shí)間進(jìn)行篩選,選用最適含量、最適處理時(shí)間才能收到良好的效果。預(yù)處理分離植物器官、誘導(dǎo)形成愈傷組織、液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng),獲得小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物。或從器官或細(xì)胞培養(yǎng)物游離出單個(gè)原生質(zhì)體。細(xì)胞材料的制備經(jīng)預(yù)處理的材料用

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