動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)與生理特性1.貼壁細(xì)胞的生長特征成纖維細(xì)胞人胃腺癌細(xì)胞2.懸浮細(xì)胞的生長特征白細(xì)胞細(xì)胞：K562腹水瘤細(xì)胞：Ehrlich腹水瘤細(xì)胞EAC3.兼性貼壁細(xì)胞CHO－K1CHO-K1動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成與代謝大分子：蛋白質(zhì)核酸糖脂質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)細(xì)胞的分裂周期長：12～18h細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象；正常二倍體細(xì)胞的生長壽命有限；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境敏感；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象：在玻璃、塑料等基質(zhì)上生長，與電荷、鈣鎂離子、貼附因子（collagen，F(xiàn)ibronectin）有關(guān)。無血清培養(yǎng)基：少！血清、塑料瓶/玻璃瓶，生長密度80％左右為佳。及時(shí)傳代！貼附于基質(zhì)正常二倍體細(xì)胞的壽命有限原代培養(yǎng)：離體培養(yǎng)開始的時(shí)間稱“原代培養(yǎng)”；經(jīng)若干代之后細(xì)胞趨于死亡。成纖維細(xì)胞～50代，加入表皮生長因子～150代。轉(zhuǎn)化成異常體后～無限細(xì)胞系，成為“永生化”細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感細(xì)胞膜對(duì)理化因素：滲透壓，pH，離子濃度，剪切力，微量元素等敏感。一切導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性的因素都影響動(dòng)物細(xì)胞的存活。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高原核細(xì)胞：碳源：葡萄糖，麥芽糖，淀粉，氮源：蛋白胨，玉米漿，酵母粉；無機(jī)鹽：PO43-,Na,K+,Fe2+。動(dòng)物細(xì)胞：營養(yǎng)要求高！12種必需氨基酸，8種以上維生素，多種無機(jī)鹽，微量元素，碳源：葡萄糖，多種細(xì)胞因子，貼壁因子，血清。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同既在游離核糖體（細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白）上合成，更多的在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（分泌蛋白，整合蛋白，N-linkedglycoprotein）上進(jìn)行。多數(shù)為糖蛋白，高爾基體（O-linkedglycoprotein）。蛋白質(zhì)的糖基化與細(xì)胞功能密切相關(guān)：細(xì)胞識(shí)別，胞內(nèi)消化，外排分泌物。因此，有些生物藥品不能用原核細(xì)胞表達(dá)：EPO動(dòng)物細(xì)胞來源的生物藥物比重越來越大！第二節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求：正常組織的原代細(xì)胞：雞胚、兔腎細(xì)胞等多次傳代的二倍體細(xì)胞：WI-38,2BS，Namalwa細(xì)胞：干擾素Vero細(xì)胞：狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎癥疫苗雜交瘤細(xì)胞：OKT-3mAb逐步取消了非二倍體細(xì)胞的限制DNA殘留量的檢測！二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系融合細(xì)胞系重組工程細(xì)胞系2.二倍體細(xì)胞原代細(xì)胞的馴化產(chǎn)物，仍具正常細(xì)胞的特點(diǎn)：2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限增殖（50代以內(nèi)），無致瘤性。代表性細(xì)胞株：WI－38，MRC-5，2BS；1.原代細(xì)胞最無爭議的細(xì)胞，但費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，成本高，如：雞胚細(xì)胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等；3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系正常細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)化，人為轉(zhuǎn)化（SV40，甲基膽蒽）SV40，即猿猴空泡病毒40（Simianvacuolatingvirus40），是一種多瘤病毒，也是一種DNA病毒，有造成腫瘤發(fā)生的潛在能力。代表細(xì)胞株：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero4.融合細(xì)胞系兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞融合而成。——受精。動(dòng)物－動(dòng)物細(xì)胞，動(dòng)物－植物細(xì)胞；誘導(dǎo)物：（1）仙臺(tái)病毒：副流感病毒I型。方法：4oC聚集，37oC反應(yīng)，細(xì)胞穿通，細(xì)胞融合。已經(jīng)很少使用。（2）聚乙二醇PEG:分子量1000，濃度50％，Ph8.0~8.2,融合率近100％。單抗生產(chǎn)中使用。（3）電融合：電場0.5～1.5V，脈沖1～50μs。5.基因工程技術(shù)構(gòu)建重組工程細(xì)胞

（1）真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建I、病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒II、非病毒載體：質(zhì)粒（2)基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選融合法：脂質(zhì)體化學(xué)法：磷酸鈣沉淀物理法：電轉(zhuǎn)、基因槍病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)要求環(huán)境適應(yīng)力最差，培養(yǎng)時(shí)間長，營養(yǎng)要求高培養(yǎng)特點(diǎn)：（1）碳源為葡萄糖（2）氮源為氨基酸（3）添加小牛血清和動(dòng)物胚胎浸出液二、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件

1.溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳溫度：37±0.5℃昆蟲細(xì)胞最佳溫度：27℃2.pH細(xì)胞培養(yǎng)最適pH：7.2-7.4低于6.8或高于pH7.6→細(xì)胞退變或死亡加入緩沖系統(tǒng)：保持培養(yǎng)環(huán)境的pH穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)空氣，CO2等進(jìn)行PH調(diào)節(jié)酚紅做指示劑3.氧5%CO2的混合氣體4.防止污染：十分重要培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富小牛血清的支原體污染解決：嚴(yán)格滅菌抗生素：青霉素，鏈霉素，卡那霉素等三、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基1.平衡鹽溶液(balancesalinesolution,BSS)生理平衡鹽溶液，與生理的PH，滲透壓等一致。用于洗滌細(xì)胞常用的有Hanks液，Earle液，HEPES溶液等2.合成細(xì)胞培養(yǎng)基(sythetic)1950年，Morgen第一個(gè)合成培養(yǎng)基：199培養(yǎng)基已經(jīng)商品化的基本合成培養(yǎng)基有199、MEM、RPIM1640、DMEM等優(yōu)點(diǎn)：成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)基本組分基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：氨基酸；維生素；碳水化合物；無機(jī)鹽氨基酸至少含有上述13種氨基酸——EagleMEM培養(yǎng)基最多含21種氨基酸——199培養(yǎng)基12種必需氨基酸:纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)谷氨酰胺(glutamine)：缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%維生素

脂溶性維生素：(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素：包括生物素、葉酸、煙酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、吡哆醛、偏多酸鈣、核黃素(B2)、硫胺素(B1)B12、Vc、膽堿、肌醇和對(duì)氨基苯甲酸。3.天然培養(yǎng)基(naturemedium)動(dòng)物體液或組織提取成分做培養(yǎng)液血清最為常用：牛血清、馬血清、兔血清胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎牛；胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。新生牛血清：取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清：取自出生10－30天的小牛維持液生長液目前重點(diǎn)開發(fā)的無血清培養(yǎng)基是在基本合成培養(yǎng)基上加入起血清作用的各種激素和多肽生長因子如轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素，氫化可的松等動(dòng)物培養(yǎng)基采用膜過濾法滅菌四、動(dòng)物細(xì)胞的基本技術(shù)

（一）細(xì)胞的原代培養(yǎng)（1）剪碎：無菌的解剖刀和剪子把組織切成小片；（2）胰蛋白酶或膠原酶進(jìn)行消化酶解；（3）分散的細(xì)胞清洗純化后，計(jì)數(shù)和接種，37℃培養(yǎng)。原代培養(yǎng)材料來自于胚胎及成體的組織和器官胚胎組織生命力強(qiáng)，細(xì)胞間粘連弱，易于消化分解，易于培養(yǎng)和繁殖成體組織相反腫瘤細(xì)胞繁殖力強(qiáng)，可在體外長期培養(yǎng)繁殖，并可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法：組織切成小塊，培養(yǎng)。在組織塊周圍長出新的細(xì)胞單層。單層細(xì)胞培養(yǎng)法：組織中的細(xì)胞用酶消化成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)（二）細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代(subculture)：從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞操作過程（貼壁細(xì)胞）：1.棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基2.清洗：使用PBS平衡鹽溶液清洗細(xì)胞。3.消化：加入消化液(trypsin)到長著細(xì)胞的一面。孵育在5-15分鐘，仔細(xì)監(jiān)測細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。4.吹打：當(dāng)細(xì)胞變圓、離開培養(yǎng)皿底部時(shí)，加入培養(yǎng)基，通過移液管在細(xì)胞表面反復(fù)吹打分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞（三）細(xì)胞的克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)(clonalculture)：即單細(xì)胞分離培養(yǎng)，由單細(xì)胞培養(yǎng)成純細(xì)胞系一般用飼養(yǎng)細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)五、細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)在人工條件下在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。20世紀(jì)60-70年代，就已創(chuàng)立了可用于大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。是目前生物高科技藥物大規(guī)模生產(chǎn)的核心技術(shù)（一）動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法大規(guī)模培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法:懸浮培養(yǎng)：CHO細(xì)胞(中華倉鼠卵巢)、BHK-21細(xì)胞(倉鼠腎)，雜交瘤細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞等進(jìn)行懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)：人二倍體細(xì)胞、傳代細(xì)胞Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎)等利用載體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)(貼壁-懸浮培養(yǎng))1.懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過程，是細(xì)菌發(fā)酵基礎(chǔ)上改進(jìn)的主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等,也適用于兼性貼壁細(xì)胞氣升式，攪拌式反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白和單抗２.微載體培養(yǎng)60-250um的顆粒，創(chuàng)造大面積供細(xì)胞貼附生長載體體積小，比重輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)各種疫苗和細(xì)胞產(chǎn)品商業(yè)化微載體商品名基質(zhì)帶電基和形狀直徑大小比表面積密度透明性交換當(dāng)量meq/g/um/(cm3.g-1)(g.ml-1)Cytodex1葡聚糖DEAE1.5球狀131~21060001.03+Superbeads葡聚糖DEAE2.0球狀136~2055000~6000ND+Biocarrier聚丙烯酰胺二甲胺丙基1.4球狀120~18050001.04+Cytodex2葡聚糖三甲基-2-羥氨基丙基球狀114~19855001.04+Cytodex3葡聚糖60ug膠原/cm2球狀133~21545001.04+Ventragel交聯(lián)明膠明膠球狀150~250NDND+Celibeads交聯(lián)明膠明膠球狀115~2353300~43001.03~1.04+Biosilon聚苯乙烯負(fù)電荷球狀160~3002251.05±±ytosperes聚苯乙烯負(fù)電荷球狀160~3002501.04±DE-53纖維素DEAE2.0柱狀40~50NDND-３.多空載體培養(yǎng)法近年發(fā)展的大規(guī)模高密度的培養(yǎng)方法多空載體是一種支撐材料，內(nèi)部有網(wǎng)狀小孔，細(xì)胞可以在里面生長即可用于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)，又可用于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞生長于內(nèi)部，可免受攪拌等機(jī)械損傷常用：陶瓷，明膠，纖維素及衍生物，聚苯乙烯等材料４.微囊培養(yǎng)從酶的固定化技術(shù)發(fā)展而來，把細(xì)胞包在微囊里懸浮培養(yǎng)細(xì)胞由于包裹而受到保護(hù)，避免了剪切力的損害可獲得較高的細(xì)胞密度，一般在107-108個(gè)細(xì)胞/ml以上在控制了微囊的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)，有利于下游產(chǎn)物的純化可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)5.中空纖維培養(yǎng)法模擬體內(nèi)的三維培養(yǎng)狀態(tài)，細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬人工毛細(xì)血管供給營養(yǎng)，使細(xì)胞高密度生長材料有硅膠，聚砜，聚丙烯等，為半透膜培養(yǎng)筒內(nèi)由數(shù)千根中空纖維所組成，封存在特制的圓筒里。圓筒內(nèi)形成2個(gè)空間：每根纖維的管內(nèi)為“內(nèi)室”，灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長，管與管之間的間隙為“外室”。接種的細(xì)胞貼附“外室”管壁上，并吸取從“內(nèi)室”滲透出來的養(yǎng)分生長繁殖。培養(yǎng)液中的血清也輸入到"外室"，由于血清和細(xì)胞分泌產(chǎn)物如單抗的分子質(zhì)量大而無法穿透到"內(nèi)室"去，只能留在"外室"并且不斷被濃縮。當(dāng)需要收集這些產(chǎn)物時(shí)，只要把管與管之間的“外室”總出口打開，產(chǎn)物就能流出來。細(xì)胞生長繁殖過程中的代謝廢物，因?yàn)槎紝傩》肿游镔|(zhì)，可以從管壁滲進(jìn)“內(nèi)室”，最后從“內(nèi)室”總出口排出，不會(huì)對(duì)“外室”細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。一般細(xì)胞在接種1～3周后，就可以完全充滿管壁的空隙。細(xì)胞厚度最終可達(dá)10層之多。細(xì)胞停止增殖后，仍可以維持其高水平代謝和分泌功能，長達(dá)幾個(gè)星期甚至幾個(gè)月。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式分批操作(batch)補(bǔ)料-分批操作(fed-batch)：普遍應(yīng)用于細(xì)菌生產(chǎn)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中較少用。半連續(xù)式操作(semi-continuous)連續(xù)式操作(continuous)：除個(gè)別情況下用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)外，一般用灌流培養(yǎng)來代替。灌流式操作(perfusion)（二）動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：小于20L的反應(yīng)器，培養(yǎng)工藝研究中試規(guī)模：20-100L的反應(yīng)器，提供一定量的產(chǎn)品，共純化、臨床前的各種檢測和臨床觀察，工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)等的需要生產(chǎn)規(guī)模：大于100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品40⒈攪拌式生物反應(yīng)器最經(jīng)典、最早用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器通氣好，攪拌剪切力小，有利于長時(shí)間，高密度培養(yǎng)主要用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊和巨載體培養(yǎng)以及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)最早于1984年由英國科學(xué)家Spier發(fā)明。該裝置的主要特點(diǎn)是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時(shí)氣泡直接損傷細(xì)胞。同時(shí)在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中。NBS則在該研究成果的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn)，并于1987年前后將其作為商品推向國際市場籠式通氣攪拌器的改進(jìn)--NBS裝置作為對(duì)最初設(shè)計(jì)的籠式通氣攪拌器的改進(jìn)，NBS裝置中分別包括籠式的通氣腔和消泡腔。氣液交換在由200目不銹鋼絲網(wǎng)制成的通氣腔內(nèi)實(shí)現(xiàn)；而在鼓泡通氣過程中所產(chǎn)生的泡沫經(jīng)管道進(jìn)入液面上部的由200目不銹鋼絲網(wǎng)制成的籠式消泡腔內(nèi)，泡沫經(jīng)鋼絲網(wǎng)破碎分成氣、液兩部分，達(dá)到深層通氣而不產(chǎn)生泡沫的目的。⒉氣升式生物反應(yīng)器沒有攪拌，氣體通過噴管進(jìn)入剪切力更小主要用于懸浮細(xì)胞的分批式培養(yǎng)，近年開發(fā)用于貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)，并進(jìn)行半連續(xù)、連續(xù)和灌流式培養(yǎng)氣升式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器在植物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛,在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中也取得了很大的成功。和攪拌式生物反應(yīng)器相比，氣升式反應(yīng)器中產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)?。煌瑫r(shí)反應(yīng)器內(nèi)無機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；反應(yīng)器通過直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；反應(yīng)器內(nèi)液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)成分能均勻分布于培養(yǎng)基中。⒊中空纖維式生物反應(yīng)器由數(shù)百千根中空纖維束組成既可培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞,又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞密度高達(dá)109/mL數(shù)量級(jí)如果能控制系統(tǒng)不受污染，則能長期運(yùn)轉(zhuǎn)，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。⒋透析袋或膜式生物反應(yīng)器培養(yǎng)分為兩室或三室，培養(yǎng)基與細(xì)胞用濾膜分開既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)也可培養(yǎng)懸浮細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：可使細(xì)胞達(dá)到很高密度；可隨意組合進(jìn)行操作，達(dá)到保留和濃縮產(chǎn)品或及時(shí)分離提純產(chǎn)品的目的⒌固定床或流化床式生物反應(yīng)器反應(yīng)器內(nèi)裝不銹鋼、玻璃珠、玻璃環(huán)、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等載體Verax公司推出的CF-IMMO培養(yǎng)系統(tǒng)（右圖）專用于比重較大的多孔微球的培養(yǎng)國內(nèi)外動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器現(xiàn)狀國外占主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，為提高細(xì)胞的產(chǎn)率，可采用流加或灌注培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)等相關(guān)技術(shù)Genentech公司使用CHO細(xì)胞以12,000L攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)槽生產(chǎn)t-PA重組蛋白以及治療癌癥的生物藥物。Gibco公司建立的流加懸浮培養(yǎng)CHO表達(dá)βGal系統(tǒng)，采用化學(xué)修飾的無蛋白CHO細(xì)胞培養(yǎng)基并增加TCA循環(huán)，生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度最高可達(dá)107/ml。四軍大采用5LCelliGen反應(yīng)器連續(xù)灌注培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)第9天細(xì)胞密度達(dá)到8×106/ml以上目前國內(nèi)未見有萬升級(jí)的生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)的報(bào)道同時(shí)我國有關(guān)商品化大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器產(chǎn)品還處于空白，有待于進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有生物反應(yīng)器，設(shè)計(jì)或設(shè)計(jì)新型的生物反應(yīng)器。目前，百泰藥業(yè)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)線，是目前中國規(guī)模最大、設(shè)施最完備、技術(shù)最先進(jìn)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)國內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀上個(gè)世紀(jì)80年代，培養(yǎng)細(xì)胞密度最大達(dá)到2×106/ml，生產(chǎn)期7天，特異產(chǎn)物量為50mg/L。2004年，細(xì)胞密度最大可達(dá)到10×106/ml，有效表達(dá)時(shí)間達(dá)到3周，表達(dá)量接近5g/L，是1980的100倍?，F(xiàn)在世界上最大的細(xì)胞發(fā)酵罐達(dá)到2萬升。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)體系還需要解決的其他問題包括無血清培養(yǎng)基、延遲細(xì)胞凋亡和糖基化改進(jìn)等。生產(chǎn)能力不足已經(jīng)成為細(xì)胞表達(dá)的重組藥物發(fā)展的瓶頸。以Enbrel為例，在1998年上市6個(gè)月內(nèi)僅美國銷售就超過對(duì)全球整年需求的預(yù)計(jì)，生產(chǎn)規(guī)模缺口很大。又如，HIV蛋白微球（microbicides）在局部使用可以防止HIV傳播，但至今未進(jìn)入臨床研究，原因也是生產(chǎn)量不夠。還有很多藥物不僅發(fā)展中國家用不上，即便是發(fā)達(dá)國家也難以使用，估計(jì)有80%的血友病患者無藥可用，主要是生產(chǎn)能力不足。生產(chǎn)能力不足也導(dǎo)致其價(jià)格不菲。我國動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的目標(biāo)(1)建立動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)。該平臺(tái)是基因工程藥物、單克隆抗體及疫苗等產(chǎn)品的關(guān)鍵，由以下幾個(gè)要素構(gòu)成：1)高效的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；2)性能優(yōu)越的、個(gè)性化的細(xì)胞培養(yǎng)基，包括低血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基；3)先進(jìn)的生物反應(yīng)器設(shè)備；(2)減少污染風(fēng)險(xiǎn)、提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性；(3)實(shí)行“動(dòng)物藥廠”計(jì)劃，盡快實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化；(4)發(fā)展下游工程，主要是轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)品的分離純化，在提高產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量同時(shí)，降低成本。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合受精作用動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺(tái)病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：仙臺(tái)病毒、聚乙二醇

誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺(tái)病毒必須滅活。

思考討論：為什么細(xì)胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會(huì)感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。第五節(jié)動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中。使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。1.克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核