斑蘭葉 組培快繁技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB61海南省地46方標(biāo)準(zhǔn)Technicalcodeofpracticefortissuecultureandrapidpropagationofpandan(征求意見稿)(本草案完成時間：2022年10月)在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。海南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB46/TXXXX—XXXX前言 III引言 IV1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14組培工廠要求 25接種前準(zhǔn)備 2試劑 2消毒滅菌 26外植體采集與滅菌 3采集圃選擇 3外植體采集 3外植體滅菌 37培養(yǎng) 3培養(yǎng)接種 4愈傷組織 4叢生芽 4繼代增殖 4叢生芽循環(huán)再生 4生根壯苗 4試管苗煉苗 48容器苗培育 4苗圃地的條件與設(shè)施 5育苗時期 5育苗容器 5育苗基質(zhì) 5移栽基質(zhì)消毒 5基質(zhì)裝填 5移栽 5育苗管理 59出圃 6容器苗煉苗 6出圃標(biāo)準(zhǔn) 610育苗檔案 6附錄A(資料性)斑蘭葉(香露兜)組培快繁培養(yǎng)基配方 7附錄B(資料性)斑蘭葉組培快繁技術(shù)檔案記錄表 8DB46/TXXXX—XXXX參考文獻..............................................................................10IDB46/TXXXX—XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由海南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所、海南興科熱帶作物工程技術(shù)有限公司、海南熱作高科技研究院有限公司。本文件主要起草人：吉訓(xùn)志、張昂、魚歡、秦曉威、宗迎、賀書珍、初眾、郝朝運、唐冰、鄧文明、廖子榮、茍亞峰、閆林。DB46/TXXXX—XXXX引言本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及7.2、7.3、8.1、8.2、8.4與《一種斑蘭葉種苗的高通量繁育技術(shù)》(ZL202010100076.7)相關(guān)專利的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利權(quán)人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)承諾，愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進行談判。該專利權(quán)人的聲明已在本文件的發(fā)布機構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利權(quán)人：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。地址：海南省萬寧市興隆熱帶植物園。請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。1DB46/TXXXX—XXXX斑蘭葉組培快繁技術(shù)規(guī)程警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本文件規(guī)定了斑蘭葉(PandanusamaryllifoliusRoxb.)組培快繁的組培工廠要求、接種前準(zhǔn)備、外植體采集與處理、培養(yǎng)、容器苗培育、出圃、育苗檔案等技術(shù)要求。本文件適用于斑蘭葉組培苗繁育。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T357—2007香蕉組培苗NY/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程DB46/TAAA斑蘭葉組培苗DB46/T578斑蘭葉(香露兜)種苗繁育技術(shù)規(guī)程DB46/T579林下間作斑蘭葉(香露兜)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。外植體explant從自然生長的斑蘭葉植株上獲取的用于建立植物組培快繁體系的起始材料。培養(yǎng)材料culturematerials包含外植體、愈傷組織及叢生芽等需要進行接種培養(yǎng)的材料。斑蘭葉試管苗pandanintest-tubeplantlet利用斑蘭葉老莖上的側(cè)芽作為外植體，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)容器中生長且已達到移栽標(biāo)準(zhǔn)的根、莖、葉俱全的完整無菌斑蘭葉小植株。2DB46/TXXXX—XXXX[來源：NY/T357—2007，3.2，有修改]斑蘭葉容器苗pandaninvesselplantlet斑蘭葉試管苗分級裝入有育苗基質(zhì)的育苗容器中可出圃供大田定植的斑蘭葉種苗。[來源：NY/T357—2007，3.3，有修改]4組培工廠要求按照NY/T2306的規(guī)定執(zhí)行。5接種前準(zhǔn)備試劑5.1.1培養(yǎng)基配制試劑培養(yǎng)基配制所需試劑見附錄A，其中大量元素、微量元素、鐵鹽及碳源為分析純(AR)試劑，有機元素、激素、植物凝膠為生物試劑(BR)。5.1.2酸堿度調(diào)節(jié)試劑酸堿度調(diào)整所需氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸為分析純試劑。5.1.3消毒試劑使用去離子水或蒸餾水稀釋配制分析純無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%。使用去離子水或蒸餾水稀釋配制分析純氯化汞至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。注：《危險化學(xué)品安全管理條例》給出了危險化學(xué)品的安全管理方法。消毒滅菌5.2.1培養(yǎng)基、器皿、水的滅菌培養(yǎng)基配制完后，分裝至組培瓶中。121℃高壓滅菌，培養(yǎng)基20min，器皿、水滅菌30min，取出冷卻備用。滅菌操作人員應(yīng)持有特種設(shè)備作業(yè)人員證。5.2.2接種器材滅菌使用電熱滅菌器進行滅菌。槍狀鑷與解剖刀先用75%酒精擦拭，待電熱滅菌器溫度升至250℃~300℃，再將槍狀鑷與解剖刀插入電熱滅菌器中進行滅菌，第一次滅菌3min~4min，每次接種后滅菌5.2.3超凈工作臺滅菌超凈工作臺(或潔凈無菌接種室)滅菌30min后關(guān)掉紫外燈，通風(fēng)15min~20min，用75%酒精擦洗超凈工作臺臺面。5.2.4接種人員準(zhǔn)備3DB46/TXXXX—XXXX接種人員應(yīng)在更衣室更換工作服、工作鞋、戴帽子和口罩后進入接種室(或經(jīng)過風(fēng)淋室后進入接種室)，操作前雙手應(yīng)用75%酒精消毒。操作中如手部離開工作臺，應(yīng)再次用75%酒精消毒。6技術(shù)流程斑蘭葉組培快繁技術(shù)流程包括3個階段，如圖1所示。圖1斑蘭葉(香露兜)組培快繁技術(shù)流程7外植體采集與滅菌采集圃選擇選擇經(jīng)濟性狀良好、植株健壯、無病蟲害的種植園，去除變異株后作為外植體采集圃。外植體采集選擇經(jīng)濟性狀良好、植株健壯、無病蟲害的優(yōu)良母株老莖上2.0cm~3.0cm的幼嫩側(cè)芽。采芽時用小刀將側(cè)芽從芽基部切下，裝入無菌袋，帶回實驗室備用。外植體滅菌7.3.1采集的側(cè)芽裝入100mL洗滌瓶，加入3~4滴70%百菌清乳狀溶液浸泡10min，用自來水沖洗干凈，轉(zhuǎn)到超凈工作臺中。7.3.2側(cè)芽用無菌解剖刀和槍狀鑷子在接種盤上剝?nèi)ネ鈬娜~鞘，用75%酒精浸泡消毒30s，倒出酒精，用無菌蒸餾水沖洗2次。7.3.3側(cè)芽用0.1%氯化汞溶液消毒8min，并不斷搖動，消毒結(jié)束將升汞溶液倒入回收瓶，用無菌蒸餾水沖洗4~5次，用無菌濾紙吸干水分。8培養(yǎng)4DB46/TXXXX—XXXX接種方法8.1.1接種時一手拿組培瓶，一手輕輕取下蓋子，用鑷子將培養(yǎng)材料送入瓶中，輕輕一壓與培養(yǎng)基緊密接觸，并使培養(yǎng)材料在瓶內(nèi)均勻分布。8.1.2接種完畢立即蓋上瓶蓋并做好標(biāo)記，注明材料名稱、接種日期、培養(yǎng)基類型、接種人等事項。8.1.3整個培養(yǎng)期間定期觀察材料生長情況，并作好記載，如發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時將污染瓶移出培養(yǎng)室，待高溫滅菌后清洗或丟棄。愈傷組織外植體按8.1接種到培養(yǎng)基A(見附錄A)，溫度22℃~25℃，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)60d~90d，獲得愈傷組叢生芽愈傷組織按8.1接種到培養(yǎng)基B(見附錄A)，溫度26℃~28℃，光照強度1000lx~2000lx，光照12h，黑暗12h，誘導(dǎo)40d~60d，獲得叢生芽。繼代增殖8.4.1選取母瓶全面檢查污染和誘導(dǎo)情況，及時剔除被污染的組培瓶。選擇叢生芽狀態(tài)良好的組培瓶作為母瓶。8.4.2取叢生芽打開母瓶蓋，瓶口不應(yīng)斜向外，取出叢生芽放于無菌接種盤上。8.4.3切芽接種用解剖刀將叢生芽切割成單株小芽或小芽團塊，按8.1接種到培養(yǎng)基C(見附錄A)中，宜4株(團)~5株(團)/瓶。溫度26℃~28℃，光照強度1000lx~2000lx，光照12h，黑暗12h，30d繼代一次。叢生芽循環(huán)再生將帶有愈傷組織的芽團再次按8.2、8.3和8.4操作。生根壯苗8.6.1苗高≥6.0cm的芽苗，取出放置于無菌的接種盤上，去除莖部處多余愈傷組織，分成單株接種到裝有培養(yǎng)基D(見附錄A)的組培袋中，宜接種10株/袋，封口。光照強度1500lx~2500lx，光照12h，黑暗12h，30d后檢查幼苗基部新根生長情況。8.6.2苗高＜6.0cm的芽苗，按8.1接種到培養(yǎng)基C(見附錄A)中，宜4株~5株/瓶，培養(yǎng)條件按試管苗煉苗將生根后的試管苗，組培袋頂部剪開3.0cm~4.0cm，煉苗3d~5d，煉苗溫度宜26℃~28℃，光照強度宜1000lx~1500lx，保持環(huán)境潔凈。9容器苗培育5DB46/TXXXX—XXXX苗圃地的條件與設(shè)施按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。育苗時期按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。育苗容器按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。育苗基質(zhì)按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。移栽基質(zhì)消毒按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。基質(zhì)裝填容器裝滿基質(zhì)，整齊擺放在苗床上，對苗床邊上的育苗容器進行培土。移栽取出試管苗并洗凈其根部培養(yǎng)基，用1g吲哚丁酸(IBA)粉劑1000倍液浸泡5min~8min。澆濕育苗基質(zhì)后在基質(zhì)中挖2.0cm~3.0cm×0.5cm~1.0cm(深度×寬度)左右大小的苗坑，再將試管苗放進苗坑內(nèi)，葉片及莖部全部露出，回填基質(zhì)壓實。淋足定根水，并用50%多菌靈可濕性粉劑500倍液噴淋消。育苗管理9.8.1水肥管理勤查看基質(zhì)濕度，保持基質(zhì)濕潤。當(dāng)種苗葉片長度≥5.0cm時可噴施葉面肥。葉面肥推薦用量為3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))速溶復(fù)合肥(15-15-15)配制的液態(tài)肥，噴施量以種苗葉片濕潤為宜。30d~60d施肥19.8.2溫度管理通過覆膜、水簾與冷熱風(fēng)機等方式調(diào)節(jié)溫度，溫度宜保持在20℃~35℃。9.8.3光照管理移栽后用遮光度60%~80%的遮陽網(wǎng)遮蓋，避免陽光直射。9.8.4查苗、補苗育苗10d后進行查苗、補苗。9.8.5除草人工及時拔除育苗容器內(nèi)及苗床的雜草。9.8.6病蟲害防治6DB46/TXXXX—XXXX按DB46/T579的規(guī)定執(zhí)行。10出圃容器苗煉苗按DB46/T578的規(guī)定執(zhí)行。出圃標(biāo)準(zhǔn)按DB46/TAAA的規(guī)定執(zhí)行。11育苗檔案參照附錄B的規(guī)定執(zhí)行。組培苗級別按DB46/TAAA的規(guī)定執(zhí)行。7DB46/TXXXX—XXXX附錄A(資料性)斑蘭葉組培快繁培養(yǎng)基配方斑蘭葉組培快繁培養(yǎng)基配方見表A.1。表A.1斑蘭葉組培快繁培養(yǎng)基配方單位：mg/L母液成分試劑培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基A培養(yǎng)基B培養(yǎng)基C培養(yǎng)基D大量元素硝酸鉀(KNO)190019001900950硝酸銨(NHNO)165016501650825硫酸鎂(MgSO?7HO)350~450350~450350~450175~225磷酸二氫鉀(KHPO)150~200150~200150~20070~100氯化鈣(CaCl?2HO)400~500400~500400~500200~250微量元素硫酸錳(MnSO?4HO)20~2420~2420~2420~24硫酸鋅(ZnSO?7HO)8~108~108~108~10硼酸(HBO)6~106~106~106~10碘化鉀(KI)0.830.830.830.83鉬酸鈉(NaMoO?2HO)0.250.250.250.25硫酸銅(CuSO?5HO)0.0250.0250.0250.025氯化鈷(CoCl?6HO)0.0250.0250.0250.025鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉(Na-EDTA)35~4035~4035~4035~40硫酸亞鐵(FeSO?7HO)27~3027~3027~3027~30有機元素甘氨酸2.02.02.02.0維生素B10.10.10.10.1維生素B60.50.50.50.5煙酸0.50.50.50.5肌