器官模擬物的三維培養(yǎng)技術(shù)解析,細(xì)胞生物學(xué)論文

器官模擬物的三維培養(yǎng)技術(shù)解析,細(xì)胞生物學(xué)論文【提要】類器官是成熟器官來(lái)源的三維上皮構(gòu)造，包含干細(xì)胞或祖細(xì)胞，能夠獨(dú)立擴(kuò)增并且分化為器官特異性上皮。利用三維方式方法培養(yǎng)類器官技術(shù)在組織再生、研究機(jī)體生理病理學(xué)、構(gòu)建疾病模型及藥物挑選等方面均有廣闊的前景應(yīng)用。本文將就三維條件下類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景作一扼要綜述?！颈疚年P(guān)鍵詞語(yǔ)】類器官；三維培養(yǎng)；再生醫(yī)學(xué)；綜述。類器官是指在構(gòu)造和功能上都類似來(lái)源器官或組織的模擬物，其為成熟器官來(lái)源的三維上皮構(gòu)造，包含干細(xì)胞或祖細(xì)胞，能夠獨(dú)立擴(kuò)增并且分化為器官特異性上皮。Lancaster等[1]以為類器官是源于多能干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞且具有胚層特異性的類器官體，其包含目的器官中至少一種細(xì)胞類型，能夠自組裝為器官樣構(gòu)造并具有其生理構(gòu)造和功能特征。通過(guò)3D培養(yǎng)技術(shù)在體外利用干細(xì)胞或類器官模擬人類器官組織的生理發(fā)育經(jīng)過(guò)和誘導(dǎo)致病，并應(yīng)用于生物醫(yī)藥和再生醫(yī)學(xué)，已成為當(dāng)前組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新熱門。本文就類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景做一綜述。1類器官技術(shù)簡(jiǎn)介1.1類器官構(gòu)成的基礎(chǔ)自組裝是類器官構(gòu)成的關(guān)鍵，其是指在無(wú)外力干涉的條件下，干細(xì)胞或多細(xì)胞依靠各組分間的互相作用自我分化為多種構(gòu)造的經(jīng)過(guò)，例如在唾液腺上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)中可見(jiàn)自發(fā)構(gòu)成的分支樣或者芽狀構(gòu)造[2].這一經(jīng)過(guò)的自發(fā)構(gòu)成依靠于生理性的內(nèi)源機(jī)制，并由細(xì)胞與基質(zhì)間以及細(xì)胞與細(xì)胞間的多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路共同介入。但這一內(nèi)源機(jī)制并非固定不變，時(shí)間、空間的變化均可增加其復(fù)雜性和多樣性。在類器官構(gòu)成經(jīng)過(guò)中，關(guān)于自組裝的相關(guān)調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題，仍需要進(jìn)一步深切進(jìn)入研究。1.2生物工程輔助技術(shù)類器官類器官自組裝的實(shí)現(xiàn)很大程度上依靠于三維細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立。根據(jù)能否為細(xì)胞提供支架材料，三維培養(yǎng)體系大體可分為基于支架的培養(yǎng)體系和無(wú)支架的培養(yǎng)體系，而支架又分為天然構(gòu)成和人工合成支架。研究者們發(fā)現(xiàn)，生物支架是組織再生的關(guān)鍵因素，多種組織細(xì)胞能夠在生物材料上生長(zhǎng)、分化并最終構(gòu)成人工組織或器官[3].生物支架對(duì)組織再生的這一作用與支架的組成成分、空間構(gòu)造、機(jī)械及化學(xué)特性、釋放生物化學(xué)信號(hào)及分子信號(hào)等性質(zhì)密不可分。而組織特異性細(xì)胞外基質(zhì)〔extracellularmatrix,ECM〕在上述作用方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。有學(xué)者通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞獲得胰腺祖細(xì)胞系，將后者與不同發(fā)育時(shí)期的胰腺間充質(zhì)〔間質(zhì)組織、間葉組織〕共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與器官類型匹配的間充質(zhì)能夠使祖細(xì)胞擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上，并且在擴(kuò)增、自我更新的同時(shí)保持不分化狀態(tài)，但同時(shí)仍保存其分化能力，因而，該學(xué)者以為ECM能夠傳遞階段特異性和組織特異性的再生信號(hào)[4],但詳細(xì)機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。器官存在的微環(huán)境還通過(guò)隨時(shí)間和空間而變化的生物化學(xué)信號(hào)影響器官再生，所以需要在這方面進(jìn)一步發(fā)展生物工程輔助技術(shù)[5].當(dāng)前，有學(xué)者在仿生的聚乙二醇水凝膠上合成了一種特殊蛋白質(zhì)，而且其蛋白梯度能夠人工控制，因此實(shí)現(xiàn)分子信號(hào)和化學(xué)信號(hào)在時(shí)間和空間上更為精到準(zhǔn)確的釋放；但這種蛋白梯度是靜態(tài)的，且只局限于凝膠外表的二維體系[5].2020年，加拿大多倫多大學(xué)的研究員報(bào)道了一種新型數(shù)字化微流體平臺(tái)，該平臺(tái)可在水凝膠材料中培養(yǎng)細(xì)胞，然后用電場(chǎng)操縱細(xì)胞，使得每個(gè)凝膠均可單獨(dú)訪問(wèn)，動(dòng)態(tài)流體交換愈加溫和，成本明顯減少，并且可實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的三維調(diào)控；除此之外，該研究員提出或許能夠收集患者的小組織樣本并將其分布到數(shù)字微流體裝置的3D凝膠中，進(jìn)行挑選藥物以確定個(gè)性醫(yī)療方案，而這將是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療理念的重要工具[6]2類器官的應(yīng)用2.1腸類器官HansClever課題組證實(shí)單一的Lgr5+干細(xì)胞能夠在體外持續(xù)增殖并自組裝構(gòu)成隱窩-絨毛樣的小腸上皮構(gòu)造[7].進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，單個(gè)成人Lgr5+干細(xì)胞也能在體外成功擴(kuò)增成結(jié)腸類器官，將這種功能性的結(jié)腸上皮移植到硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中能夠修復(fù)其受損的結(jié)腸上皮[8].這提示利用單一成人結(jié)腸干細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)腸干細(xì)胞治療是可行的[8].有學(xué)者還應(yīng)用人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞〔inducedpluripotentstemcells,iPSCs〕直接定向分化為小腸組織的方式方法明確了Wnt3a蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4是后腸特定分化所必需的物質(zhì)，而且，這種iPSCs體外構(gòu)建的人體腸道組織中存在的小腸干細(xì)胞，也具有小腸特有的吸收和分泌功能[9].這有助于將來(lái)人腸道疾病藥物的設(shè)計(jì)研究，可大大提高了藥物利用率。當(dāng)前，已有學(xué)者構(gòu)建了小鼠小腸3D類器官來(lái)進(jìn)行P-糖蛋白抑制劑的挑選，為P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了強(qiáng)有力的工具[10].2.2肝類器官2020年，Takebe等[11]將人多能干細(xì)胞來(lái)源的肝細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞混合后在基質(zhì)膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞自組裝成3D化肝芽，將該肝芽移植到丙氧鳥(niǎo)苷誘導(dǎo)肝臟衰亡的TKNOG小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)這種肝芽能夠連接小鼠腸系膜血管，小鼠也出現(xiàn)了人類特有的藥物代謝經(jīng)過(guò)。這為肝臟器官發(fā)生的研究提供了有益嘗試。大型哺乳動(dòng)物的類器官再造工程也許能加速人類器官移植治療和疾病致病機(jī)制研究的進(jìn)展。2021年，Nantasanti等[12]利用狗的肝臟干細(xì)胞構(gòu)建了可分化為功能性肝細(xì)胞的肝類器官模型，能用于銅潴留癥的治療。貓被以為是非常適用于研究人類代謝性疾病的模型，所以利用貓的膽道組織構(gòu)建肝類器官，可能是原發(fā)性肝膽疾病研究及藥物挑選的有益工具，但至今也未見(jiàn)利用貓建立長(zhǎng)期保持基因穩(wěn)定的肝臟干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系的報(bào)道[13].2.3胰腺類器官有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激活素A和Wnt3a的表示出水平或使用一些小分子化合物進(jìn)行干涉時(shí)，能夠控制內(nèi)胚層細(xì)胞向特定的方向分化，最終構(gòu)成胰腺[14].當(dāng)前，構(gòu)建胰島類器官的主要方式方法包括利用各種干祖細(xì)胞產(chǎn)生胰島樣細(xì)胞群和利用各種來(lái)源的胰腺細(xì)胞懸液或胰腺組織塊自組裝成擬胰島體[15].2018年，Saito等[16]將人iPSCs和胚胎小鼠胰島細(xì)胞體外共培養(yǎng)，最后構(gòu)成能夠產(chǎn)生胰島素的不成熟細(xì)胞群，該細(xì)胞群由胰島細(xì)胞包繞的細(xì)胞構(gòu)成，這種構(gòu)造和成年鼠胰島類似，將其移植到鏈脲菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平得到極大改善。而進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究還需要關(guān)注怎樣躲避免疫反響、促進(jìn)再血管化、促進(jìn)類器官分化發(fā)育等問(wèn)題，在這方面，Sabek等[17]提出制備納米腺體來(lái)促進(jìn)胰島發(fā)揮作用，這種納米腺體是運(yùn)用3D打印技術(shù)制作可吸收聚合物膠囊包裹胰島樣細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的，這可能是將來(lái)胰島類器官應(yīng)用的一種思路。2.4腦類器官近來(lái)，譜系重編程技術(shù)為獲取特異性種子細(xì)胞提供了新的途徑。Lancaster等[18]通過(guò)參加不同生長(zhǎng)因子的方式方法將人類胚胎干細(xì)胞〔embryonicstemcell,ESC〕和iPSC在神經(jīng)培養(yǎng)基3D培養(yǎng)出了與9~10周胚胎大腦類似的類大腦,此類迷你大腦具備人類大腦發(fā)育初期的一些主要區(qū)域，也出現(xiàn)了背側(cè)皮層、腹側(cè)前腦等可分辨體認(rèn)的特征，但由于缺乏一些特定的特征，如小腦、海馬狀突起等，這些區(qū)域無(wú)法應(yīng)用于干細(xì)胞模型。之后，該研究者利用小顱畸形患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)成了患者特異性iPSC細(xì)胞系，并應(yīng)用后者構(gòu)建了小顱畸形腦類器官模型，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常ESC和該iPSCs在類