園藝植物基因的分離與克隆

關于園藝植物基因的分離與克隆第一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)文庫篩選法一、園藝植物基因組文庫的構建二、園藝植物cDNA文庫的構建三、目的基因的篩選

第二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、園藝植物基因組文庫的構建

⑴基因文庫的定義一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。

⑵基因文庫的類型基因組文庫：來自園藝植物基因組全部DNA片段組成的基因文庫，反映基因組的全部遺傳信息。cDNA文庫：將某一特定組織表達的mRNA反轉錄成cDNA組成的基因文庫，每個克隆只含1種mRNA信息，足夠數(shù)目克隆則包含細胞全部mRNA信息。cDNA便于克隆和大量擴增，不像基因組DNA含有內含子很難表達。第四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、園藝植物基因組文庫的構建構建的植物基因組文庫需滿足的條件文庫能夠覆蓋整個基因組。插入的DNA片斷比較大。文庫易于保存且較穩(wěn)定。基因組文庫構建流程示意圖第五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、園藝植物基因組文庫的構建1.載體的制備1.1完整的基因組文庫所需要篩選的重組子數(shù)目N＝ln(1-P)/ln(1-f)

。N，重組子的數(shù)量；P，所要求的概率；f，某一插入片段與相應生物基因組大小的比值。要以0.99的概率獲得番茄基因組（9.5×108bp）20kb的插入片段，所需要篩選的重組子數(shù)目為：N＝ln(1-0.99)/ln[1-(2×104/9.5×108)]=2.2×105

第六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日1.2載體的選擇：

a）質粒載體可承載15kbDNA左右片段(有效的范圍為<10kb)b）載體可承載25kbDNA左右片段(有效的范圍為15kb)c）Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段(有效的范圍為<40kb)

第七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日1.3載體制備要求：純度高、去磷酸效果好。去磷酸化是為了提高載體和目標片斷的連接效率。純度如果不高則會在重組克隆中含有大量的細菌基因組DNA，影響文庫的質量。第八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、園藝植物基因組文庫的構建要求：一般提取的DNA相對分子量至少應該是文庫最終平均插入片斷長度的3-5倍。如插入片斷達到100kb以上，則要求提取的基因組DNA分子量要達到500kb以上。實踐證明：提取的基因組DNA分子量越大，得到的重組克隆的插入片斷越大。2.大片段基因組DNA的制備第九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA的不完全酶切2.1根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內切酶

a)四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256b)六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/40962.2分離目的酶切片段大小的確定

a)克隆單個基因：<10kbb)克隆基因族：>20kb2.3DNA不完全酶切條件的確定

a)確定限制酶用量，改變酶切時間

b)固定酶切時間，改變限制酶的用量第十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日DNA的不完全酶切相同時間不同量第十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3.大片段DNA與克隆載體連接3.1酶切片段的分離與純化１）低熔點瓊脂糖回收目的片段２）試劑盒回收目的片段10kb第十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3.2酶切片段與克隆載體連接連接體系中的四種連接方式：載體自連、載體和基因組DNA片斷的連接、基因組DNA片斷的自連和基因組片斷之間的連接。只有基因組DNA和載體之間的連接才是所需要的。如何提高它們之間的連接效率是連接反應的關鍵。可以通過調整載體與基因組DNA的比例來達到較好的效果。一般比例為1:5~1:15.第十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日

基因組DNA片段3’凹端的不完全補平的策略-GATC--CTAG--GATC--CTAG-Sau3AI-GAGATC--CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG--GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG--GAGCTCTC-互補GEM-11基因組DNAVector第十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日4.載體的遺傳轉化電轉化是轉化大腸桿菌使用最普通的一種手段。插入片段越大，轉化效率越低。

5.克隆的挑取、驗證從文庫中隨機挑選一定量的克隆，搖菌，提取質粒DNA，酶切后，脈沖電泳檢查插入片段的大小，并根據(jù)數(shù)目計算空載率。細胞器DNA的污染會降低文庫的實際容載量，一般用線粒體和葉綠體的探針對文庫進行檢測。第十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日6.文庫的擴增、分裝及保存

1)影印濾膜保存法第十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉入含適當?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70oC儲存（加終濃度為25%的甘油）。缺點：因文庫菌落生長的不均勻性而導致文庫中某些特定的序列過多或過少。第十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3)保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大第十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日

真核生物基因組DNA十分龐大，其復雜程度是mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，都只有15%左右的基因得以表達，產生約15000種不同的mRNA分子?？梢姡蒻RNA出發(fā)的cDNA克隆，其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。二、園藝植物cDNA文庫的構建

第十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、園藝植物cDNA文庫的構建

（一）普通cDNA文庫的構建純化mRNA樣品的制備選擇特定發(fā)育階段的特定組織為分離mRNA的材料。mRNA的純化:利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴與oligo(dT)互補雜交，使mRNA固定在固相介質上，再將mRNA洗脫下來，制備出純化的mRNA樣品。mRNA樣品完整性的檢測：根據(jù)28S和18SrRNA電泳條帶的亮度判斷RNA的完整性，從而間接地判斷mRNA的完整性。如果28SrRNA條帶的亮度是18S的兩倍，RNA樣品完整；如果兩條帶的亮度反過來，說明RNA樣品部分降解；如果無清晰的條帶，說明RNA樣品已經嚴重降解。

第二十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第二十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日cDNA第一鏈的合成

關鍵是獲得大量完整的cDNA拷貝。影響因素：模板mRNA的質量、反轉錄酶、引物。反轉錄酶：禽源(AMV)和鼠源反轉錄酶(M-MuLV)。

AMV：除具有DNA聚合酶活性外，還有很強的RNaseH酶活性。M-MuLV：RNaseH活性比AMV低，但反轉錄效率比AMV低。Superscript反轉錄酶：除去了MMLV的RNaseH活性，更能保證cDNA第一鏈的全長和高產。引物常用oligo(dT)和隨機六聚體核苷酸。第二十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日mRNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉錄酶dNTPs第二十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3.1自身引導法合成cDNA第二鏈的技術流程3.雙鏈cDNA的合成

第二十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3.2置換合成法利用RNaseH將雜交雙鏈中的mRNA降解，形成多段仍與cDNA第一鏈保持雜交的RNA片段。利用這些RNA片段作為引物，引導合成第二鏈cDNA。隨著合成產物的延伸，除5’末端的RNA引物外，所有作為引物的RNA片段均被新合成的互補鏈所置換。通過DNA連接酶作用，將各段互補鏈連接成完整DNA鏈。除去殘存的5’末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3’端突出的單鏈cDNA，得到一個雙鏈形式的cDNA片段。該方法直接利用第一鏈反應產物，避免了中間處理和純化過程造成的cDNA損失，是目前合成cDNA第二鏈的常用方法。第二十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日置換合成法合成cDNA第二鏈的技術流程第二十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3.3同聚物引導法

在第一鏈的3′端用末端轉移酶加上一段同聚體dG。以oligo(dC)為引物合成第二鏈。該法最大的缺點是獲得的cDNA5’端上游有一段dG:dC殘基，可能會抑制表達過程中DNA的轉錄。但該法在最佳條件下可高效克隆mRNA的5’端序列。第二十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs第二十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日雙鏈cDNA的克隆

cDNA的修飾為了提高雙鏈cDNA片段與載體的連接效率，需要對cDNA進行修飾，即給平端的雙鏈cDNA片段添加銜接頭。所謂銜接頭是人工合成的含有限制酶酶切位點的短雙鏈DNA片段，或者一端為限制酶粘性末端的雙鏈DNA片段。用前一種銜接頭連接后，為了避免限制酶對cDNA片段內部可能出現(xiàn)的酶切位點的切割，在添加銜接頭之前，文庫cDNA需經甲基化酶處理。添加后一類型的銜接頭時，不必對文庫cDNA進行修飾。第二十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日合成接頭和銜接頭cDNA合成接頭(含酶切位點)酶切NotI,SalI與載體連接Optional:methylation

接頭中含稀有位點，如NotI,SalI(100kb一次)先甲基化dscDNA，再連接接頭第三十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日雙鏈cDNA的克隆

cDNA的克隆

將制備的cDNA成功克隆到載體中去的關鍵問題是cDNA和載體的比例。必須尋找一個適當?shù)谋壤员苊鈫蝹€重組體中含有多個串聯(lián)cDNA分子或產生過高的非重組背景。為提高連接反應效率，可在連接混合物中加適量PEG8000。建成的cDNA文庫一般應進行效價測定并擴增，以利多次篩選并長期保存。第三十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日cDNA文庫構建流程示意圖第三十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日5.普通cDNA文庫存在的主要不足

低豐度表達序列在文庫中出現(xiàn)的幾率很低，要想得到低豐度表達基因，至少要篩選106個克隆。構建普通cDNA文庫所需的mRNA量比較大，達到數(shù)微克。篩選普通cDNA文庫的工作復雜，需要很長時間，限制了基因克隆的速度。第三十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、園藝植物cDNA文庫的構建

（二）新型cDNA文庫的構建PCR介導的cDNA文庫

原理：以cDNA第一鏈為模板，設計一組引物，通過PCR擴增獲得多拷貝雙鏈cDNA。優(yōu)點：增加低豐度mRNA的克隆機會；利用僅有的幾個細胞或微量的mRNA建立較大的cDNA文庫。缺點：PCR合成的片段一般較短，大片段的全長擴增困難；擴增過程中錯誤摻入率甚高；由于PCR對短片段的擴增效率高于長片段，故mRNA的原始豐度難以在文庫中體現(xiàn)。應用：適合于克隆來源困難的組織或細胞的基因。第三十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）新型cDNA文庫的構建標準化cDNA文庫

定義：某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且含量相等的cDNA文庫。優(yōu)點：增加了克隆豐度極低的mRNA的機會。能發(fā)現(xiàn)普通cDNA探針所不能發(fā)現(xiàn)的稀有轉錄區(qū)。能估計大多數(shù)基因的表達水平，并發(fā)現(xiàn)組織特異性基因。第三十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）新型cDNA文庫的構建染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫

用某一染色體或基因組區(qū)DNA與合成的cDNA池或已構建的cDNA文庫雜交，將捕獲的cDNA進行PCR擴增，便可構建染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫。其中的cDNA或定位于該染色體上或與之有同源性。染色體顯微切割技術的發(fā)展使得構建的文庫更狹窄，更具特異性。第三十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）新型cDNA文庫的構建消減cDNA文庫又稱差示文庫，常用于克隆不同組織或同一組織在不同的生理狀態(tài)下表達有差異的基因。在一定條件下用過量不含目的基因的驅動方(driver)與含有目的基因的試驗方(tester)進行雜交，選擇性地去除相同基因雜交形成的復合物，將含有目的基因的未雜交部分收集后構建相應的文庫。由于消減cDNA文庫的富集作用，使所需篩選的克隆數(shù)減少幾十到上百倍。第三十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第三十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日三、目的基因的篩選

根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選

根據(jù)基因序列設計引物，以基因組DNA或mRNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增。如果得到的只是基因部分序列，可以將其克隆至載體，作為探針篩選cDNA文庫和基因組文庫獲得全長基因。用探針直接篩選庫，若能得到其它植物已分離的相關基因，則可以直接用作探針篩選cDNA文庫和基因組文庫，獲得研究植物的目的基因。第三十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日根據(jù)目的基因的表達特性篩選如果已知基因表達產物（蛋白質）的氨基酸序列，就可以反推出原來基因的核苷酸序列。從N端對10多個連續(xù)的氨基酸進行序列測定，選擇連續(xù)6個以上簡并程度最低的氨基酸，按各種可能的序列結構合成寡核苷酸探針庫，從cDNA文庫和基因組文庫中篩選全長的基因。缺點：在實驗中得到純度高、數(shù)量足夠的目的基因表達產物（蛋白質）是很困難的，蛋白質測序也花費較高，難度較大。第四十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日PCR法篩選基因文庫

將基因文庫分裝96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)一段時間后，分別從同一行或同一列孔中吸取少量培養(yǎng)物合并。以此混合物為模板進行PCR擴增，根據(jù)凝膠電泳的結果判定相應行或列混合孔中是否含有陽性克隆。對含有陽性克隆的行或列孔中的培養(yǎng)物再次分裝，經培養(yǎng)后進行第二輪PCR擴增。如此反復操作，直至獲得陽性克隆。第四十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)圖位克隆技術一、分離基因的程序

二、優(yōu)缺點第四十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、分離基因的程序

（一）圖位克隆技術的定義及原理定義：根據(jù)目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法。原理：首先找到一個與目標基因相連的DNA分子標記，然后通過染色體步移技術克隆分離出目標基因。當基因與標記之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均插入片段大小時，就可直接篩選到含有目標基因的克隆，這種方法稱為染色體登陸(chromosomelanding)。第四十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）分離基因的程序目的基因的初步定位利用分子遺傳圖譜確定與目的基因連鎖的分子標記。目的基因區(qū)域的物理作圖將分子標記之間的遺傳距離（cM）轉化為物理距離（堿基數(shù)），構成該基因區(qū)域的物理圖譜。構建并篩選含有大插入片段的基因組文庫用與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選大片段基因組文庫，獲陽性克隆。第四十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）分離基因的程序構建目的基因區(qū)域跨疊克隆群以陽性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫，獲得含有目標基因兩側分子標記的大片段跨疊群。目的基因的精細定位和染色體登陸以目標基因兩側的分子標記為探針，通過染色體登陸獲得含目標基因的陽性克隆。外顯子的分離和鑒定利用篩選cDNA文庫、外顯子捕捉等技術獲得候選基因，通過功能互補實驗確定目標基因。第四十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第四十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第四十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、優(yōu)缺點

主要應用于基因組較小、分子標記連鎖圖密度較高和轉化系統(tǒng)比較穩(wěn)定成熟的植物。對于基因組較大、重復序列較多的園藝植物，圖位克隆法要步移大量的DNA片段，投資大，效率低；而且DNA大片段插入文庫含有許多嵌套克隆或克隆后的重排現(xiàn)象等原因，使得染色體步移十分困難。對于這些植物，可以通過構建高密度的分子遺傳圖譜和尋找物理距離目的基因很近的分子標記，使得染色體步移的距離大大縮小。第四十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)轉座子標簽法一、轉座子的分類二、分離基因的程序三、優(yōu)缺點四、T-DNA標簽法

第四十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、轉座子的分類

（一）轉座子的定義與功能定義染色體上一段可以移動的DNA序列，可以從一個基因座位轉移到另一個基因座位。功能當轉座子插入到某個功能基因內部或鄰近位點時，就會使插入位置的基因失活并誘導產生突變型；而當轉座子切離時，又使目的基因恢復活性。第五十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日（二）轉座子的分類DNA轉座子通過DNA復制和直接切離兩種方式獲得可轉移片段，重新插入基因組DNA中。反轉錄轉座子

由RNA介導的轉座子，即作為DNA的轉座子首先被轉錄為RNA，再借助反轉錄酶反轉錄合成DNA，插入到新的染色體位點來實現(xiàn)轉座過程的。第五十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、分離基因的程序

采取農桿菌介導等適當?shù)霓D化方法把轉座子導入目標植物，設法將轉座子插入到目標基因內部或鄰近位點，引起表型突變。通過表型篩選獲得純合突變株。構建純合突變株的核基因組文庫。以轉座子片段作為探針，從該基因組文庫中篩選含轉座子片段的克隆。以該克隆作為探針，篩選另一正常植株的核基因組文庫，獲得完整的正常目的基因。第五十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日轉座子標簽法克隆基因示意圖第五十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日三、優(yōu)缺點優(yōu)點：利用轉座子標簽法可在不了解基因產物的生化性質和表達模式的情況下分離植物基因。局限性該技術的前提條件是要篩選出轉座子插入的突變體。在實際操作中，由于轉座頻率往往很低，因此需要篩選的突變體群體較大。對于那些須在特定環(huán)境或特定發(fā)育階段才有突變表型的基因，往往由于看不到明顯的突變表型而被忽略。由于基因的功能補償?shù)葯C制的作用，即使有些基因產生了插入突變，也可能看不到突變表型，因而不能運用該方法。第五十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日四、T-DNA標簽法原理：T-DNA能夠從農桿菌中轉移并穩(wěn)定地整合到植物宿主的基因組中，從而使整合位置上的基因失活或產生突變，通過T-DNA上的標記基因(如GUS等基因)就可檢測突變位置，得到與T-DNA相連的DNA片段，以此制備探針篩選野生型基因文庫，就可得到與突變相應的完整基因。缺點由于T-DNA的可移動性，不易獲得較穩(wěn)定的突變遺傳系。由于高等植物基因組中大量的重復序列存在，也降低了獲得目標突變體的效率，實驗周期較長。第五十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)基因差異表達技術

一、mRNA差異顯示技術二、抑制性消減雜交技術三、代表性差異分析法四、基因表達系列分析五、cDNA-AFLP技術

第五十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、mRNA差異顯示技術

原理根據(jù)大多數(shù)真核細胞mRNA的3’端具有Poly(A)結構，利用含Oligo(dT)的寡聚核苷酸作為引物，將總mRNA反轉錄為cDNA，然后通過PCR技術和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異cDNA片段，從而篩選出目的基因。第五十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基本步驟從不同植物或組織中提取總mRNA。用Oligo(dT)12MN為引物(其中，M＝G/C/A，N＝G/C/T/A)，在反轉錄酶的作用下，將mRNA反轉錄成cDNA。用與反轉錄相同的錨定引物和由10個堿基組成的隨機引物對生成的cDNA進行PCR擴增。PCR擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在相鄰泳道上分析，找到差異表達的cDNA條帶?；厥詹町惐磉_的條帶，將其作為探針進行Northern雜交或篩選cDNA文庫，獲得差異表達的基因全長。第五十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日mRNA差異顯示技術示意圖第五十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日5’------------------------------------------------AAAAAAAAAAAAmRNANNTTTTTTTTTTTTanchorprimer1ststrandcDNANNTTTTTTTTTTTTNNNNNNN10-13bparbitraryprimerPCR(36-38°C)anchor+arbitraryprimersseparationonpolyacrylamidegelABDifferentialDisplay第六十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第六十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日DifferentialHybridizationcDNAlibrarylowdensity(~1,000/150mm)ReplicaplaqueliftingmRNA(sampleA)mRNA(sampleB)labeledprobelabeledprobehybridization第六十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點優(yōu)點在基因序列未知的情況下，直接用來鑒定和克隆差異表達基因，具有簡便、快速、RNA用量少、效率高等優(yōu)點。主要用于比較兩種以上特定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的mRNA樣品間基因表達的差異。缺點假陽性特別高，可達70%，增加了后續(xù)工作的難度。由于PCR的敏感性，mRNA差異顯示技術重復性較差。擴增片段較小(110～500bp)，不能代表差異表達的基因。只能擴增靠近Poly（A）mRNA3’端不大于600bp的區(qū)域。對高拷貝mRNA有較強的傾向性，不能用于低拷貝的mRNA。第六十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、抑制性消減雜交技術

原理以抑制PCR為基礎的cDNA消減雜交。所謂抑制PCR是利用非目標基因片段兩端的長方向重復序列在退火時產生類似發(fā)卡的互補結構，無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。第六十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基本步驟提取含有目的基因的待測組織(tester)和不含目的基因的對照組織（driver)的mRNA，并反轉錄為cDNA。用限制性內切酶將兩種不同的cDNA切割為小片段。將testercDNA分為兩份，分別連接不同的接頭。用過量的drivercDNA分別與這兩種testercDNA進行第一次消減雜交，會產生：單鏈tester、雙鏈tester/tester、雙鏈tester/driver、單鏈driver及雙鏈driver/driver。第六十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基本步驟混合兩份雜交樣品，并加入新的變性drivercDNA進行第二次消減雜交，從而形成一種新的雜交組分，即分別含有不同接頭的雙鏈cDNA分子（tester-adaptor1/tester-adaptor2）。補平變性后分子的粘性末端。以接頭1和接頭2序列為引物對其進行第一輪PCR。用與接頭內側序列互補的另一對引物進行第二輪PCR，富集差異表達的目的基因片段。用第二輪PCR產物構建相應的差減cDNA文庫，克隆差異表達基因。第六十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日抑制性消減雜交技術示意圖第六十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點優(yōu)點假陽性率大大降低，陽性檢出率為50%以上。目的序列富集程度較高，且豐度相對一致，確保了低豐度表達的cDNA有被檢測的可能，極大地提高了檢測效率；靈敏度很高，重復性強。一次SSH實驗中可同時富集上百個差別表達的基因，遠遠勝過DDRT-PCR。缺點需要較多的mRNA，因而某些特殊樣本不容易獲得。更多地依賴于PCR技術，不能同時對多個材料進行比較。材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測。第六十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日三、代表性差異分析法

原理以差減雜交為基礎，從基因組水平篩選和克隆基因的方法。充分利用了PCR反應中雙引物以指數(shù)形式擴增雙鏈模板，而單引物僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，并通過降低cDNA群體復雜性和多次更換cDNA兩端接頭等方法，特異地擴增目的基因片斷。第六十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日基本步驟

分別提取試驗組T和驅動組D的RNA并反轉錄成cDNA，然后加上接頭，以接頭特異性引物進行PCR擴增。擴增產物經限制性酶切除去接頭后，給T組酶切產物連上新的接頭，使之區(qū)別于D組的cDNA。用過量的D組酶切產物與經“修飾”過的T組cDNA混合，經變性、退火復性后形成T-D、T-T和D-D雜交分子。利用T組新接頭的特異接頭引物進行PCR擴增，T-T同源雜交分子將得到有效擴增。重復2～3次差減雜交步驟，盡可能去除共有序列，對差異表達基因片段進行更有效的富集。克隆差異表達基因。第七十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點

優(yōu)點免去了物理方法分離單、雙鏈的繁瑣操作，通過接頭“修飾”設計，借助PCR技術即能使目的片段得到有效擴增，減少假陽性。差減雜交在擴增后的cDNA群體之間進行，不再受供試的mRNA量的限制，拓寬了差減雜交的應用范圍。一次實驗可分離得到多個在T組和D組間差異表達基因的cDNA克隆，并能發(fā)現(xiàn)與表型相關的異常基因，檢測基因的上調和下調表達。第七十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點

缺點目的基因間豐度的差異在數(shù)輪差減雜交后的群體中保留了下來，在后續(xù)的篩選中，高豐度的差異基因容易得到，低豐度的差異基因不易檢出，而低豐度的表達產物往往代表相對重要的基因。分離出來的差異基因也可能與其表型無關，增加了后續(xù)鑒定的工作量。對樣品T組和D組的純度要求很高，如果兩組材料間差別較大，則用此方法將達不到鑒定差別表達基因的目的。第七十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日四、基因表達系列分析基因表達系列分析（SAGE）是通過快速和詳細分析成千上萬個EST（expresssequencedtags）來尋找出表達豐富度不同的SAGE標簽序列。在此方法中，通過限制性酶切可以產生非常短的cDNA（10-14bp）標簽，并通過PCR擴增和連接，隨后對連接體進行測序。SAGE大大簡化和加快了3’端表達序列標簽的收集和測序。同DD一樣，SAGE是一個“開放”的系統(tǒng)，可以發(fā)現(xiàn)新的未知的序列。在進行標本的比較之前，SAGE在cDNA的產生和處理上需要較多個步驟。第七十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第七十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日biotin第七十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日五、cDNA-AFLP技術

原理與基本步驟

提取植物總RNA后，先將樣本mRNA反轉錄成cDNA。同時利用2個分別識別6堿基和4堿基序列的限制性內切核酸酶進行酶切。酶切片段分別與接頭連接，然后利用與接頭互補的引物進行預擴增。再在引物3′末端加2～3個選擇性堿基進行選擇性擴增，最后在測序膠上展示，可獲得100～1000bp間的重復性好、清晰的條帶。通過比較不同來源的mRNA的擴增產物，就可以獲得差異表達的基因的片段。第七十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日EcoRIMseI（限制性內切酶）EcoRI接頭MseI接頭EcoRI引物+AMseI引物+C（預擴增）EcoRI引物+AACMseI引物+CAA（選擇擴增）（連接）（電泳檢測）第七十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點

優(yōu)點在理論上cDNA-AFLP可產生的條帶的種類是無限的，它可以對生物體全部mRNA樣品進行篩選。在cDNA酶切片段兩端加上統(tǒng)一引物作為PCR擴增的模板，提高了PCR反應的嚴謹性，具有重復性高，假陽性率低的特點，因此，其可靠性大大地提高，重復性可達95%以上。此外，由于cDNA-AFLP絕大部分擴增的是mRNA的編碼區(qū)序列，它可以獲得比DDRT-PCR更加豐富的信息。擴增條帶的強度能準確反映基因間表達量的差別。缺點整個操作過程繁瑣，假陽性率有時也較高。第七十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)同源序列法

一、基于同源序列的侯選基因法二、cDNA末端快速擴增技術

第七十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、基于同源序列的侯選基因法

基本策略

根據(jù)已知基因的保守區(qū)設計引物，以待分離此基因的植物基因組DNA或cDNA為模板直接進行PCR擴增，對擴增產物測序并與已知基因進行序列比較，從而確定該基因是否為待分離基因。用已知序列的基因制備探針，篩選待分離基因的植物核DNA或cDNA文庫。再對陽性克隆進行測序，并與已知基因序列進行同源性比較，最后經轉化鑒定是否為待分離的基因。第八十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日氨基酸序列比較設計簡并引物PCR擴增文庫篩選/RACE第八十一頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日需要注意的問題

由于密碼子的簡并性和不同的同源序列間同源程度的差異，簡并引物的特異性要設計得當。由于同源序列并不專屬于某一基因家族，因而擴增產物不一定是某一基因家族成員?；蚣易宄蓡T往往成簇存在，克隆的基因片段是否為目的基因尚需進一步轉化鑒定。第八十二頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日二、cDNA末端快速擴增技術

基本步驟

從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中，比較分析待克隆基因的保守序列區(qū)段。以此保守序列設計特異或簡并引物，從待測植物組織的cDNA中進行PCR擴增，獲得待分離基因的cDNA片段。通過RACE技術獲得cDNA的5’和3’端，并與已知基因序列進行同源性比較。轉化鑒定是否為待分離的基因。第八十三頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3’RACE利用絕大部分mRNA的3’末端具有poly(A)，以Oligo（dT）和一個接頭組成的接頭引物(adaptorprimer，AP)反轉錄mRNA，得到加接頭的第一鏈cDNA。根據(jù)已獲得的待分離基因cDNA片段設計兩條特異引物GSP1(genespecificprimer1，GSP1)和GSP2(genespecificprimer2，GSP2)，分別與已知的接頭引物進行巢式PCR擴增，從而獲得該基因的3’端。第八十四頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日3’RACE技術示意圖第八十五頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日5’RACE經典方法用待分離基因的反向特異引物GSP反轉錄總RNA為第一鏈cDNA，在未知的cDNA的5’端加上一個接頭。再用GSP和接頭引物經PCR擴增出待分離基因的5’端。

環(huán)化5’RACE設計目的基因5’磷酸化的反向特異引物GSP0，并在其遠端（靠近5’端）設計兩條反向特異引物GSP1和GSP2，在其近端（靠近3’端）設計兩條正向特異引物GSP3和GSP4。用GSP0反轉錄總RNA為第一鏈cDNA，然后通過T4RNA連接酶環(huán)化cDNA，并以此環(huán)化cDNA為模板用GSP1和GSP4與GSP2和GSP3進行兩輪巢式PCR擴增，從而獲得待分離基因的5’端。第八十六頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日5’環(huán)化RACE技術示意圖第八十七頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日獲得基因全長的途徑

一種方法是對3’RACE和5’RACE的產物序列的重疊區(qū)域分析，經過拼接獲得全長cDNA。另外一種方法是通過分析RACE產物的3’和5’端序列，重新設計合成相應引物，PCR擴增出全長cDNA。

第八十八頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)缺點

優(yōu)點操作速度快，節(jié)省時間，可在短期內獲得全長的cDNA。只需極少量的起始反應物質，具有快速、簡便、經濟、實用性強等許多優(yōu)點。尤其環(huán)化5′RACE無須去帽或加錨等煩瑣步驟，且全部使用特異引物，因而幾乎不存在產生非特異產物的可能。缺點利用RACE技術來獲得全長基因經常會發(fā)生錯誤的擴增和克隆結果，尤其是對于豐度較低、長度較長的基因。經常出現(xiàn)由于引物的不匹配而導致的非特異性擴增，有時需要進行幾輪巢式擴增來達到獲得特異性擴增的目的，然而多輪擴增又容易提高PCR反應的錯誤發(fā)生率。第八十九頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)基因芯片技術

一、基因芯片的類型二、基本程序三、優(yōu)缺點第九十頁，共一百零二頁，編輯于2023年，星期日一、基因芯片的原理（一）基因芯片的原理

將許多特定的寡核苷酸