胚胎移植技術及其研究進展概述

胚胎移植技術及其研究進展概述摘要：本文針對近年來的哺乳動物胚胎移植技術的研究熱點，分別從胚胎移植的技術方法、胚胎移植技術的應用、胚胎移植技術的發(fā)展現(xiàn)狀等方面進行了分析，并且對胚胎移植技術在轉(zhuǎn)基因中的應用進行了總結。對胚胎移植技術的應用前景、存在問題和危害進行了簡略的概括。關鍵詞：供體；受體；胚胎移植技術；繁殖；前景ResearchandoverviewofEmbryotransfertechnologyAbstract:Inrecentyears,themammalianembryotransfertechnologyisfocusingonthetechnicalmethods,thewayweuseit,itsdevelopmentstatusandotheraspects.Andembryotransfertechnologyfortheapplicationoftransgenicaresummarized.Keywords:Donor;receptor;embryotransfertechnology;reproduction;prospects胚胎移植是將良種雌性動物配種后的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體，所以也稱作借腹懷胎。其中，提供胚胎的個體為“供體”（doner），接受胚胎的個體為“受體”(recipient)。胚胎移植實際上是產(chǎn)生胚胎的供體和孕育胚胎的受體分工合作共同繁育后代的過程。引言胚胎移植被認為是繼家畜人工授精技術之后家畜繁殖領域的第二次革命。人工授精技術極大地提高了優(yōu)秀種公畜的利用率，胚胎移植技術則極大地增加了優(yōu)秀母畜的后代數(shù)，挖掘了母畜的遺傳和繁殖潛力。在畜牧業(yè)生產(chǎn)與科研中，胚胎移植技術主要用于以下幾個方面：（１）增加進口純種畜和優(yōu)秀個體的后代數(shù)。用于純繁擴群，增加種畜的數(shù)量。（２）縮短家畜的改良周期，加速品種改良。純種牛的胚胎移植給黃牛，可將15－20年的改良周期變?yōu)橐荒?，大幅度地提高了家畜的遺傳品質(zhì)和生產(chǎn)性能。（３）用于單胎動物的育種，可縮短選擇種牛的年限。如牛的MOET育種方案比后裔測定育種方法遺傳進展快。（４）移植產(chǎn)雙胎，提高生產(chǎn)效率。對肉用家畜尤其有價值。同時移植雙胚或雙半胚或在配種后第7天前后移植一枚胚胎，可獲得30%以上的雙犢率。（５）代替種畜的引進。（６）保存品種資源。保存于具有優(yōu)良遺傳特性的家畜胚胎庫、基因庫，保護瀕臨滅絕的家畜和動物品種。（７）用于一些疾病的診斷和治療。（８）發(fā)展家畜生物技術的研究手段。這項技術是胚胎分割、嵌合、核移植、體外受精和轉(zhuǎn)基因動物等家畜生物技術不可缺少的技術革新手段，也可用于生物學和醫(yī)學的研究。特別值得一提的是，通過胚胎移植產(chǎn)下的后代可從本地母牛獲得免疫，疾病抵抗力增強，胚胎傳染疾病的危險性減小。目前胚胎移植技術被越來越多地用于牛的引種和牛群的品種改良。2.胚胎移植的程序包括供體和受體動物的準備﹑超數(shù)排卵、供體母牛的配種、胚胎的收集、胚胎的檢查、胚胎的保存和胚胎的移植等技術程序?，F(xiàn)將其主要的幾個技術環(huán)節(jié)介紹如下：2.1供體和受體的選擇2.1.1供體的選擇供體的選擇是胚胎移植技術最為重要的環(huán)節(jié).胚胎移植計劃首先是對供體資源進行調(diào)查，依據(jù)調(diào)查資料，運用各種科學方法做出綜合評定，選出符合要求的個體作供體。要求供體生產(chǎn)、繁殖、抗病性能好和使用年限長，具有較高的遺傳力，且遺傳性穩(wěn)定、譜系清楚，有重要的育種價值。經(jīng)過血統(tǒng)、生產(chǎn)性能和體型審查，選擇經(jīng)濟性能優(yōu)越、生殖機能正常、對超數(shù)排卵有良好反應的健康母體。以年齡在3-10周歲以內(nèi)、經(jīng)產(chǎn)2-5胎、產(chǎn)后60天以上的母牛作為供體為宜。預作為供體的母牛，最好有一次完整的生產(chǎn)記錄(產(chǎn)犢、產(chǎn)奶)，以衡量其種用價值。以上標準是一般性原則,可根據(jù)實際情況靈活運用。2.1.2受體的選擇雖不要求具有優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，但應該具有良好的繁殖性能和健康體態(tài)，無疾患,體型中等以上。供體與受體的發(fā)情時間應該相同，前后差異不超過1d。必要時對供、受體進行同期發(fā)情處理。2.1.3同期發(fā)情發(fā)情鑒定不僅費時費工，還易發(fā)生人為誤差，而且大多數(shù)情況下.需要一定數(shù)量與供體母牛同步發(fā)情或與胚齡同步的受體母牛，只靠選擇自然發(fā)情同步的供體與受體可行，但難以滿足規(guī)模化生產(chǎn)和縮短時間的要求，因此，多采用激素處理調(diào)節(jié)法。如用15一甲基PGF2a、前列腺素類似物、新型畜用前列腺素一抓前列烯醇(系英國1.C.1,公司首創(chuàng)新型畜用前列腺素類似物)等外源性激素對牛只進行處理，可調(diào)整一群母牛的發(fā)情，達到使其發(fā)情和排卵的時間同期化的目的。例如:用氛前列烯醇(0.2mg/2m1/支)進行同期發(fā)情處理一般是二次注射法(肌注)，經(jīng)產(chǎn)牛0.3-0.4mg/次，育成牛0.2-0.3mg/次?？稍谌我庖惶爝M行第一次注射，再于隨后的第11天作第二次注射。奶牛胚胎移植及相關技術應用研究之后的24-96h觀察發(fā)情。供體牛發(fā)情在8-12h之內(nèi)作第一次輸精，20-24h之內(nèi)第二次輸精。每次輸精有效精子數(shù)不少于30X106精子數(shù)，精子活力不低于0.3。受體牛則在發(fā)情日后的第6-8天進行胚胎移植。2.2超數(shù)排卵在母畜發(fā)情周期的適當時間，注射促性腺激素，使卵巢中有較多的卵胞發(fā)育和排卵，這種方法稱為超數(shù)排卵。在進行胚胎移植時要對供體母牛作超數(shù)排卵處理，以便一次取得多枚胚胎。一般認為超排量最好是10個左右，太少會降低胚胎移植的意義，同時胚胎的收集也有困難，超排過多會降低卵子的受精率和收集率。也就是說外源生殖激素作用下對供體母畜生殖系統(tǒng)所產(chǎn)生的一系列復雜生理過程，它將打破卵巢上只有一個卵泡成熟排卵的定勢，解除單胎動物獨卵泡(優(yōu)勢卵泡)發(fā)育對同一波其它卵泡發(fā)育的抑制作用，促使同波的卵泡群中大部分卵泡能夠發(fā)育成熟、排卵、受精。超數(shù)排卵是動物胚胎移植產(chǎn)業(yè)化中的關鍵技術，但供體動物超排過程中的變異性限制了胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化推廣進程(Hasler等，1992)，動物超數(shù)排卵的目的是最大限度地獲得受精卵和可用胚胎(Foote等.，1986)。然而，在實際生產(chǎn)中牛的超排反應和胚胎質(zhì)量差異性很大.卵巢反應的差異性受許多因素的影響，如促性腺激素的種類(Elsden等，1978)、批號(Murphy等，1984)、處理的時間(Lindsell等.，1986)、劑量(Pawlyshyn等，1986)、牛的年齡(Hasler等，1981)、季節(jié)(Massey等,1984)、不同品種(Saumande等,1978)、超排處理時卵巢的生理狀態(tài)(Moor等,1984)、營養(yǎng)狀況(Hendricks等,1986).繁殖史(Hasler等，1983)和重復超排次數(shù)(Donaldson等,1983)等。在自然狀態(tài)下，動物卵巢上約有99%以上的有腔卵泡發(fā)生閉鎖而退化，只有不到1%的有腔卵泡能夠發(fā)育成熟而排卵。超數(shù)排卵的過程就是應用超過體內(nèi)正常水平的外源性促卵泡激素，使將要閉鎖的有腔卵泡發(fā)育成熟而排卵。實驗證明，在動物有腔卵泡閉鎖之前，注射外源的FSH或PMSG激素，能使大量卵泡不閉鎖而發(fā)育成熟;在排卵之前注射LH或hCG補充內(nèi)源性LH的不足，可以保證大量成熟卵母細胞同時排卵，于是便形成了超數(shù)排卵。注射FSH并不能增加卵巢一個發(fā)情周期產(chǎn)生的卵子數(shù)最，但可以挽救正在成熟或萎縮的卵子，使其成熟、排卵。超聲波掃描及其它研究的結果顯示，大多數(shù)哺乳動物的卵泡發(fā)育是以“卵泡波”(follicularwave)的形式進行的，其實質(zhì)就是指動物每個發(fā)情周期都會有一批或幾批卵泡從原始卵泡發(fā)育到成熟卵泡的波浪狀的一系列連續(xù)發(fā)育過程。哺乳動物在胚胎發(fā)育時期，由內(nèi)胚層遷移至生殖io的原始生殖細胞(PGCs)經(jīng)過多次有絲分裂增殖形成大量初級卵母細胞，被卵泡細胞包圍后就構成原始蘿p泡庫(poolofprimordialfollicles)。原始卵泡庫存在于哺乳動物生殖機能衰退前的很長一段時間里。在多數(shù)動物的每個發(fā)情周期中，原始卵泡庫中均會有部分初級卵母細胞恢復減數(shù)分裂，卵泡開始生長，成為成熟卵母細胞的來源。圖1胚胎移植程序示意圖[23]超排處理一般方法為在預計發(fā)情到來之前4天，即發(fā)情周期的第16天注射促卵泡素或孕馬血清促性腺激素，在出現(xiàn)發(fā)情的當天注射絨毛膜激素。目前各國對供體動物作超數(shù)排卵處理方法是供體母畜發(fā)情周期的中期肌注孕馬血激素以誘導母畜有多數(shù)卵泡發(fā)育，兩天后肌肉注射PGF2a?；蚱漕愃莆镆韵S體，約2-3天后發(fā)情。各國超排處理方法見下(表2)表2各國超排處理一覽表[12]超數(shù)排卵的效果受動物的遺傳特性﹑體況﹑營養(yǎng)﹑年齡﹑發(fā)育周期的階段﹑產(chǎn)后時期的長短﹑卵巢功能﹑季節(jié)以及激素制品的質(zhì)量和用量等諸多因素的影響。為了使排出的卵子有較多的受精機會，一般在發(fā)情后輸精2-3次，每次間隔8-12小時。所以不同的品種，特別是不同個體反應的差異較大，效果很不穩(wěn)定，迄今仍是胚胎移植中有待研究改進的一個重要問題。2.3供體母畜的配種選擇適當?shù)臅r間，使用優(yōu)良雄性動物的精液對供體動物進行輸精。為了得到較多的發(fā)育正常的胚胎，使用密度大、活率高的精液輸精，并且將輸精次數(shù)增加到2-3次，間隔8-10h。2.4胚胎的收集最早用手術法，即剖腹進行子宮沖卵，那樣對供體牛有一定的傷害，且恢復期較長，現(xiàn)在基本不采用了。目前普遍采用兩通路或三通路沖卵管通過直腸把握進行，即高沖卵的非手術法。所需主要器材和藥品有:沖卵管(經(jīng)產(chǎn)牛用20#,育成牛用18#),子宮頸擴張棒.三通管，硅膠管，100ml,20ml注射器，集卵童筒或漏斗，毛剪，移植槍等;酒精，碘酒，新潔爾滅，生理鹽水，2%利多卡因，青、鏈排素以及杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)，可自配或購GIBCO公司(美國)等的PBS粉劑直接用超純水配制〕，小牛血清或牛血清白蛋白等，授精后第7或第8天用全封閉自動沖卵裝置(如:FHK,日本，富士平工業(yè)公司)或簡易的沖卵管進行非手術采卵。其操作要點主要包括:器械的消毒、沖卵液的準備，供體牛的保定，用2%利多卡因5-10ml/頭實行尾椎硬膜外腔麻醉，沖卵管的插入和充氣(約8-15m1)，沖卵液的灌入(20-50m1/次，每個子宮。胚胎收集的時間：一般在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進行收集和移植。2.5胚胎的評定（如圖2）移植的胚胎必須經(jīng)過鑒定，證明是發(fā)育正常者。在全部操作過程中，胚胎不應受到任何不良因素（物理的、化學的、微生物的）影響。開展胚胎移植必須有充足的胚胎來源，具備優(yōu)良品種基因的胚胎必須有保證。將回收液室溫下(18-220C)靜置15-20分鐘后輕輕抽去上清液，在顯微鏡下對底部的沉積液逐一檢查，查尋到胚胎后將其檢出用配制好的保存液進行洗滌，再仔細觀察，鑒定胚胎，根據(jù)胚胎形態(tài)及發(fā)育階段將胚胎分為A(優(yōu)秀)、B(良好〕、C(一般)級{按需要挑選出優(yōu)質(zhì)胚胎進行鮮胚移植或冷凍備用.也可將回收的沖卵液經(jīng)孔徑為0.75微米的胚胎過濾器濾過后，將少量殘液置于20-40倍實體顯微鏡下檢出胚胎，在NiKon倒置鏡下按形態(tài)學分類法評定胚胎品質(zhì)。其實，胚胎的鑒定方法很多，如:形態(tài)學鑒定、臺盼藍染色鑒別、培養(yǎng)鑒別、熒光基質(zhì)代謝、死亡細胞的熒光測定以及代謝物質(zhì)檢測等，但最簡便實用的還是形態(tài)學鑒定。2.6胚胎的保存和培養(yǎng)胚胎冷凍還另外需要:胚胎冷凍儀1臺，0.25ml細管若干，細管塞若千，0.22u。針頭式細菌濾器若干，035二培養(yǎng)皿4-5個以及裝管器胚胎置于特制的保存液(PBS液加血清)中可在室溫下短時間保存。但應考慮到保存時間和胚胎發(fā)育，老化等問題。胚胎的冷凍保存方法有慢速冷凍、快速冷凍、一步冷凍法和玻璃化法。其冷凍保護劑用甘油、乙二醇或二甲基亞礬(DMSO)，有的認為甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷凍。但有的采用DMSO效果較好。在生產(chǎn)條件下，現(xiàn)主要用于牛冷凍胚胎的是三步平衡和一步細管法:(1)10%甘油作冷凍保護劑將胚胎用保存液(M-PBS+20%FCS或0.4%牛血清白蛋白)洗10次后移入的冷凍液(10%甘油+保存液)中，再裝入0.25ml塑料細管15-20min，隨后置于程控冷凍儀的灑精浴槽內(nèi)(如:ET一1型，F(xiàn)HK，富士平工業(yè)公司)(-4.9℃)平衡5min后在-3一-7℃時植冰(seeding)(7-10sec)，繼續(xù)平衡5min,然后以0.3-0.6℃/min的速率降溫至一30℃，平衡5min，取出胚胎細管，直接投入液氮中保存。解凍時，從罐中取出細管空氣浴(18-25℃)。后浸入32℃水浴中l(wèi)0sec(見冰晶消失為止)，然后將細管擦干，剪去細管塞，推出胚胎到解凍液(1M蔗糖+保存液)中4min，用保存液洗滌5-6次后，鏡檢，裝管，把細管裝入移植槍，移植給受體(胚胎解凍后30-45min內(nèi)移入)。(2)用1.5mol/L乙二醇作冷凍保護劑將胚胎用保存液洗10次后一步移入的冷凍液(1.5mol/L乙二醇十保存液)中，再裝入0.25ml塑料細管15-20min，隨后置于程控冷凍儀(-6.5℃)平衡2min后在-3--7℃時植冰(seeding)(7-10sec)，繼續(xù)平衡5min，然后以一0.6℃/min的速率降溫至一35℃，平衡5min,取出胚胎細管，直接投入液氮中保存。解凍時，從罐中取出細管在空氣中停留5-10sec后，浸入35℃水浴中10sec(見冰晶消失為止)，然后將細管擦干，用70%酒精棉球擦拭細管，晾干，剪去細管塞，把細管裝入移植槍，移植給受體(胚胎解凍后5-8min內(nèi)移入)。如果胚胎能在體外較長期的保存，并使它保持于取卵時狀態(tài)，對胚胎移植的實際應用有很大的意義。這樣就可以免去移植時要求的同期發(fā)情處理。可以不受時間、地點和選定受體母牛的限制，隨時隨地可以進行胚胎移植。胚胎保存的研究近年來發(fā)展很快，并已取得了一定的進展。胚胎冷凍前必須使其脫水，進行冷凍保護劑二甲基亞礬（DM-SO）的滲透處理。在室溫下（20℃），預先配制含有DMSO濃度為0.25mol、0.5mol、1.0mol、1.5mol的加0.4%牛血清白蛋白的PBS溶液（磷酸緩沖液）。將胚胎依次浸入上述不同DMSO濃度的溶液中進行滲透處理，在每個濃度溶液中分別停留5-10min。最后用吸管將含胚胎的0.3ml的長頸安瓶中，并將口封好。以上操作均在解剖鏡下進行，然后將安瓿置于14℃的水浴中。胚胎的解凍比冷凍速度快，-196℃--50℃（干冰酒精溶液中），-50℃-14℃每分鐘升溫4℃。解凍后，通常在室溫下將安瓿打開，脫去冷凍保護劑DMSO。方法是將胚胎依次移入含DMSO濃度為1.25mol、1.0mol、0.75mol、0.5mol的磷酸緩沖液中，在每種濃度溶液中各停留5-10min，0.5mol溶液中可停留30min，最后移入不含DMSO的磷酸緩沖溶液中停留10min。再用磷酸緩沖液沖洗二次，取出后檢查即可用于移植，也可以培養(yǎng)1小時（在37℃培養(yǎng)液中），將其中死的胚胎去掉，效果更好。胚胎冷凍以液氮為冷源。在可控制溫度的液氮冷凍箱內(nèi)進行。冷凍速率以英國為例：14℃至-7℃每分鐘下降1℃，于-7℃時用在液氮中浸過的金屬鑷子夾一下有胚胎的安瓿，使之誘導結晶，胚胎迅速被玻璃化凍結，而不致產(chǎn)生有害的冰結晶。-7℃--36℃每次分鐘下降0.3，-36℃--60℃每分鐘下降0.1℃到-60℃時直接投入液氮中保存。從以上情況看，冷凍保存胚胎雖然凍后成活率和受胎率還很低，還需要在培養(yǎng)液、防凍保護劑、降溫和升溫速率等問題進行深入的研究。但是這確是胚胎保存技術的重大突破。2.7胚胎分割在立體顯微鏡下用一根固定在顯微操作儀上的微玻璃針或刀片(也可徒手操作)對未作或已作軟化透明帶處理的胚胎進行由上向下的切割，將胚胎連同胚胎透明帶分割成均等的兩半。也可用固定吸管固定住胚胎，用微玻璃針先將透明帶切個小口，再將微吸管自切口處伸入，吸住半數(shù)卵裂球，慢慢取出，這樣是獲得二分胚，若要繼續(xù)再分割，就可得到四或八分胚。胚胎分割技術主要用途為:增加胚胎源提高胚胎的總?cè)焉锫?生產(chǎn)同卵雙生后代;提供有效的遺傳育種試驗材料;便于胚胎性別鑒定;增加和保存珍貴及瀕危動物種等。目前該技術已進入應用階段，切割后的鮮胚半胚移植成功率接近50%。2.8胚胎性別鑒定及控制幾十年來，人們一直在尋找和分離決定性別的基因，認為在Y染色體上可能存在著指導辜丸分化的基因TDF(翠丸決定因子)。隨著研究的深入，人們逐漸有了Y染色體、H-Y抗原、ZFY(鋅指蛋白)、SRY(Y染色體性別決定區(qū))的概念。因而，胚胎性別鑒定的方法也是針對這些因素的區(qū)分來進行的。目前已研發(fā)了許多種。主要有如下幾種:2.8.1細胞生物學方法(染色體核形分析)主要是利用X,Y染色體在形態(tài)上的差異，通過判定胚胎細胞性染色體是X還是Y來鑒定胚胎的性別。該方法缺點或存在的困難是分析性染色體需要用分裂中期的細胞，而從桑甚期和囊胚期的胚胎里取出較多的分裂球刁‘能獲得處于分裂中期的細胞，這要降低胚胎性別鑒定后移植妊娠率。2.8.2免疫學方法在8細胞期至早期胚泡期，哺乳動物的雄性胚胎表達一種雌性胚胎所沒有的細胞表面因子，即H-Y抗原，利用H-Y抗原和抗體免疫反應的原理可以進行胚胎的性別鑒定。2.8.2.1胚胎的細胞毒性分析在補體(如豚鼠血清)存在的情況下，H-Y抗體可以與HY+胚胎(雄性胚胎)結合，并使其中的一個或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈現(xiàn)不規(guī)則的體積和形狀，阻滯胚胎發(fā)育，受影響的胚胎即為雄性胚胎，將經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)育正常的雌性胚胎進行移植就可使母畜只生雌性后代。但這種方法是以破壞雄性胚胎為代價，而且其準確率不高，經(jīng)這種方法鑒定的H-Y+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有85%為雌性，這種方法很少被使用。2.8.2.2間接免疫熒光分析法以H-Y抗體為一抗，用FTTC標記的Y球蛋白(如山羊抗鼠Y球蛋白)作為二抗，將上述兩種抗體依次與胚胎共同培養(yǎng)，雄性胚胎上的H-Y抗原先與一抗結合，一抗再與二抗結合，然后通過洗滌將未結合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC標記，故在熒光顯微鏡下顯熒光，雄性胚胎顯熒光，不顯熒光者為雌性胚胎。這是一種非損害性胚胎性別鑒定法，鑒定過的胚胎都可以存活。但準確率不高，牛83%.綿羊為83%,豬為81%.奶11:胚胎移植及相關技術應用研究2.8.2.3囊胚形成抑制法利用H-Y抗體能夠可逆性抑制囊胚形成的原理，將H-Y抗血清與?？芭吖餐囵B(yǎng)一段時間后雄性胚胎由于具有H-Y抗原被H-Y抗體所抑制，不能形成囊胚，而無H-Y抗原的雌性胚胎則不受影響繼續(xù)發(fā)育成囊胚，因此可以將雌、雄胚胎分開。然后可洗去H-Y抗體，雄性胚胎繼續(xù)發(fā)育。這種方法鑒定的胚胎存活率與正常無異，其正確率為80%左右。但只能檢測桑根期前的胚胎。如果胚胎己發(fā)育至囊胚，則無法鑒定.2.8.2.4測定卵裂球X一染色休連鎖基因劑且鑒別胚胎性別從胚胎中取出一個卵裂球，采用雙重微量測定法，測定其與X一連鎖的次黃AS吟磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)和與常染色體連鎖的腺嗓吟磷酸核搪基轉(zhuǎn)移酶(APRT)的活性。由于在8一細胞階段，雌性胚胎中的兩條X染色體均有活性，因此可根據(jù)HPRT活性在基因劑量上的兩倍差異，得到HPRT與APRT比率的雙態(tài)分布圖，因而鑒別出雄性和雌性胚胎，該方法比較繁瑣，所需時間長。2.8.3分子生物學方法2.8.3.1y一染色體特異性DNA探針利用Y一染色體特異的DNA探針與Y一染色體的DNA進行特異性結合，以鑒定胚胎性別的一種方法。早在1988年，Eilis等就將牛的Y一染色體DNA重復序列探針用于牛胚胎的性別鑒定。其檢測的方法有兩種:一種是原位雜交;另一種是用探針與DNA提取物相結合。這種方法的準確率超過95%。但是這些特定序列通常具有種間特異性，所以對每種動物都必需研制不同的探針.另外，原位雜交有時還需使用放射性物質(zhì).這種方法沒有被推廣。2.8.3.2聚合酶鏈式反應(PCR)Hert等(1990)首先成功建立了家畜胚胎性別鑒定的PCR法。PCR法因其特異性強、靈敏度高、快速、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點，在家畜早期胚胎的性別鑒定中占有越來越重要的位置，其實質(zhì)就是Y-染色體特異性片段或Y-染色體上的性別決定基因的檢測技術.即通過合成SRY基因或其他Y-染色體上特異性片段的部分序列作為引物，在一定條件下進行PCR擴增反應，能擴增出目標片段的胚胎即為雄性胚胎，否則即為雌性胚胎。由于PCR極為靈敏，所以只要從胚胎中取出幾個細胞就可以進行性別鑒定，這對性別鑒定后胚胎移植的妊娠率沒有影響。Utsumi等1992年研究結果證明，用PCR技術檢測Y染色體上的SRY片段準確率達到100%，與性染色體檢查法對照證明結果是一致的.龔榮慈等實驗表明:只要8Pg的DNA即可檢出ZFY。以ZFX序列而判定胚奶牛胚胎移植及相關技術應用研究胎的雌雄。在國內(nèi)，曾溢滔等(1991)就通過對牛SRY基因的直接測序，設計引物用PCR擴增SRY基因來檢測奶牛胚胎的性別，楊建明等(1995)、歐陽紅塵(1995)等則通過擴增牛Y染色體特異DNA序列來鑒定牛早期胚胎性別，而龔榮慈等設計了特異于牛ZFY基因的引物對奶?；蚪MDAN進行NestPCR來進行性別鑒定。黃淑幀等通過擴增SRY基因?qū)D(zhuǎn)基因試管牛和試管羊胚胎進行了性別鑒定，得到的轉(zhuǎn)基因牛和轉(zhuǎn)基因羊的性別和鑒定結果完全一致。用PCR鑒定家畜胚胎的性別其主要程序為:①胚胎的獲取:冷凍胚胎、剛從供體牛回收的鮮胚或體外受精培養(yǎng)的胚胎都可以用來鑒定性別;②引物的設計:根據(jù)Y染色體上的性別決定基因或特異性片段設計引物，同時設計一對公母共有基因引物作為內(nèi)對照，避免假陽性的發(fā)生;③用顯微操作或徒手從胚胎中取出幾個細胞熱處理后進行PCR擴增;④電泳檢測。能同時擴增出Y-染色體上相應片段和公母共有基因片段的胚胎即為雄性胚胎，而只能擴增出共有基因片段的胚胎即為雌性胚胎。據(jù)中國農(nóng)科院畜牧所羅應榮等報道，應用PCR試劑盒鑒定性別準確率為97.796[24]PCR鑒定胚胎性別的研究成功，使胚胎的性別鑒定進入了一個嶄新的發(fā)展階段，但是只有進一步研究簡易快速的胚胎切割取樣技術取樣胚胎的冷凍保存技術，能達到推廣應用階段、胚胎性別鑒定的PCR試劑盒以及取樣胚胎保存技術，才能達到推廣應用階段。2.9胚胎移植2.9.1手術法移植（如圖3）是按外科剖腹術的要求進行術前準備。手術部位于右脅部或腹下乳房至臍部之間的白線切開。伸進食指找到輸卵管和子宮角，引出在切口外。如果在輸精后3-4天期間收集，受精卵絕大多數(shù)還未移到子宮角，可采用輸卵管沖卵的方法。用注射器吸取沖洗液連接穿刺針頭吸取沖洗液連接注射針頭，在子宮角前端刺入，再送入輸卵管峽部，注入沖洗液。如果在輸精5天后收集，還必須作子宮角取卵?？稍谧訉m角中段插入橡膠雙套管，從外管送入空氣，使橡皮管頂端的氣球膨大緊貼子宮內(nèi)壁，橡皮管的另一端連接集卵器，然后從子宮角前端插入針頭，注入沖洗液3-4次，盡量把沖洗液全部收回在試管或平皿中。2.9.2非手書法移植（如圖4）非手術法是在輸精后5-7天進行。可采用二路或三路導管的沖卵器。二路式?jīng)_卵器由帶氣囊的導管與單路管組成。導管中一路為注入和回收沖洗液用。導管用直腸把握法從子宮頸導入子宮角。通過氣囊導管打入空氣，使氣囊膨脹以固定導管在子宮角內(nèi)的位置和防止沖洗液倒流。沖洗液經(jīng)單路管注入子宮角，每次15-50毫升，然后將沖洗液收集在漏斗形容器內(nèi)。沖洗5-6次。為更多地回收沖洗液，可在直腸內(nèi)輕輕按摩子宮角。一般來說，用非手術法移植不如手術成功率高，因為容易損傷子宮角引起炎癥，使胚胎不能順利附植。非手術法成功率為25％-45％，而手術法可達60％-65％。3胚胎的體外生產(chǎn)胚胎的體外生產(chǎn)除超數(shù)排卵和胚胎采集技術外，胚胎體內(nèi)生產(chǎn)中的其它技術都可配合使用，目前，牛胚胎的實驗室培養(yǎng)技術主要有兩種方法。一種是共同培養(yǎng)系統(tǒng)，另一種是人工合成輸卵管液MR)培養(yǎng)系統(tǒng)。相對而言，共同培養(yǎng)系統(tǒng)操作復雜、奶牛胚胎移植及相關技術應用研究費時、費力。因為該系統(tǒng)首先必須在培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)輸卵管上皮細胞、顆粒細胞等，然后將受精卵和貼壁培養(yǎng)的上皮細胞一起培養(yǎng)，直至生產(chǎn)出可用胚胎。而SOFO培養(yǎng)系統(tǒng)的操作比較簡單，且經(jīng)過近年來的研究和完善，培養(yǎng)效果己達到甚至超過共同培養(yǎng)系統(tǒng)。實驗室生產(chǎn)胚胎的技術是一項復雜的系統(tǒng)工程，全部過程包括：卵母細胞的采集、卵母細胞的成熟培養(yǎng)，精子的獲能處理、精卵的受精培養(yǎng)和胚胎的發(fā)育培養(yǎng)。要想獲得理想的實驗室胚胎生產(chǎn)效果，必須提高每一步的效率，使整個過程達到最完善的組合。主要的程序有:3.1卵母細胞的準備現(xiàn)卵母細胞的采集方法主要有兩種:活體采卵和采集屠宰卵巢卵母細胞。采集時真空泵的負壓、采卵針的直徑大小、甚至針尖斜面的長度等等因素均可影響采集卵母細胞的質(zhì)量。目前研究表明，牛卵巢采卵時采用負壓40--50汞柱、針頭為18號針的采卵效果比較理想，此外卵泡的直徑大小也影響體外胚胎的生產(chǎn)效果，太大或太小的卵泡均不宜采集。卵泡的直徑一般為2-7mm比較適宜。從屠宰場或奶牛場收集到良種奶牛卵巢用保溫瓶在29.5-30.5℃的生理鹽水中浸沒運回實驗室。操作前用肥皂清洗雙手，再用手清洗卵巢，盡量將卵巢上的血液洗凈。用真空泵或注射器吸取卵巢上直徑2-6mm的有腔卵泡，將卵泡液連同卵母細胞復合體(cocs)放入事先添加吸卵液的試管中(試管放置在30-35℃的恒溫孔中)。3.2卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)(IVM)3.2.1IVM培養(yǎng)小滴的制備在吸取卵母細胞前至少2h制備1VM小滴。IVM小滴的制備必須在超凈工作臺操作。用微量移液器吸取40ulIVM培養(yǎng)液，滴于直徑60mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿制備10小滴IVM。小滴制備完畢后，覆蓋上礦物油。在培養(yǎng)皿蓋上標記培養(yǎng)液名稱、制備日期和操作者姓名，放入CO2,培養(yǎng)箱中平衡至少2h.平衡條件為39℃,5%的C02的空氣。3.2.2卵母細胞的洗滌和成熟培養(yǎng)卵母細胞的成熟培養(yǎng)一般采用TCM-199為基礎液，添加血清、促性腺激素(FSH/LH)、雌激素(E2170)等〔例如:1096FCS+IOIU/mIFMSG+IOIU加IHCG+TCM-199奶小胚胎移植及相關技術應用研究(含Earle鹽液)〕，模擬卵泡環(huán)境，加速卵母細胞的成熟發(fā)育。另外一些研究發(fā)現(xiàn)，在基礎液中加入發(fā)情牛的血清后，不需在加添加激素，卵母細胞的成熟培養(yǎng)效果較好。不同的實驗，其卵母細胞成熟培養(yǎng)時的IVM小滴大小也不同。有些實驗采用多孔微板，甚至小試管作為培養(yǎng)器材，培養(yǎng)液體積為0.6-1.Oml;而有些實驗采用在普通的培養(yǎng)皿上制作10-100ul的微小滴，進行各種體外培養(yǎng)。培養(yǎng)滴中的卵母細胞數(shù)量也各不相同，一般為10-15枚。最近有研究人員用l0ulIVM微滴建立起了培養(yǎng)單個卵母細胞的方法。培養(yǎng)條件為39℃,5%C02,.成熟培養(yǎng)時間，牛為24h.所有操作必須在顯微鏡恒溫臺上(38℃)和恒溫箱中(38℃)進行，并保持室溫在25℃左右，在大培養(yǎng)皿中加入吸卵液后，用2ml的巴氏玻璃管從試管底部吸取卵母細胞，置入培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下查找卵母細胞，將可用卵母細胞移置加有H199+10%FCS的35m培養(yǎng)皿中。將卵母細胞再在B199+10%FCS的培養(yǎng)皿中洗滌一次，立即將卵母細胞轉(zhuǎn)移至IVM培養(yǎng)小滴中(10個卵母細胞/小滴)進行成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為39℃,5%的CO2的空氣。培養(yǎng)時間為24h。3.3卵母細胞的體外受精(IVF)3.3.1IVF培養(yǎng)小滴的制備用微量移杯吸管取30ullVF的培養(yǎng)液，在60mm培養(yǎng)皿中制備10個IVF小滴，覆蓋上礦物油，在39℃,5%C02的培養(yǎng)箱中平衡至少2h。3.3.2精子的獲取處理動物體外授精使用的精子為鮮精或凍精。在體外受精過程中，精子必須經(jīng)過處理。精子的預處理是離心洗滌，以除去褚子表面的去能因子等物質(zhì)。目前精子的預處理方法有漂浮法(SWIN-UP)和PERCOLL密度梯度離心法兩種。獲能液和受精液是以BO液為基礎液。BO液成分為l0×貯存液:每looml含6.545gNaCl,0.29978gKCI,0.1145gNaH2PO4·H20,0.1057gMgCl·6H20,0.3308gCaCl·2H20,葡萄糖2.5181g,青霉素500lu,鏈霉素125mg.工作液(臨用前配制):NaHCO337mmol，丙酮酸鈉1.25mmol,l0×貯存液l0ml洗精液:BO工作液50ml，咖啡因l0mmol受精液:BO工作液l00m1,肝素2mg,BSA2g。以上各液均應過濾后4℃保存?zhèn)溆?。將精子?jīng)洗精液洗滌后，稀釋、計數(shù)制成密度為4-8X104/ml的精子懸液。再將卵母細胞移入50ul受精滴中進行受精。PERCOLL密度梯度離心法的具體操作如下:事先在超凈的工作臺制備90%和45%的PERCOLL液，備用。在15毫升離心管中加入2毫升45%的PERCOLL液，制備成二層PERCOLL梯度液。將一只解凍液(冷凍活力一般需在0.5以上)沿試管壁漫漫奶牛胚胎移校及相關技術應用研究加入離心管中，在700g下(2200轉(zhuǎn)/min)離心至少20mino離心后，馬上用巴氏吸管吸取PERCOLL上清液，棄掉。然后，再沿管壁漫漫加入HSOF液1m1,輕輕搖晃離心管，使其混合后，再200g下(1200轉(zhuǎn)/min)再離心15min。棄掉上清液，加入200ullVF培養(yǎng)液。取10ul精子制備液，將其加入190ul蒸餾水中，混合均勻，取該精子液在血球記數(shù)板上測定精子密度。根據(jù)精子密度確定需要補充的IVF液，以便使精子的最終受精密度達到4-8X104/ml(計算公式可參考有關精子密度測定法)。3.3.3精子和卯母細胞體外受精的培養(yǎng)將成熟卵母細胞從IVM小滴中取出，在HSOF液中洗滌一次。然后用lOulIVF液，將卵母細胞移至IVF小滴中。在加入l0ul處理后的精子液體，使精子的受精密度達到4-8X104個/ml。最后放入培養(yǎng)箱中，在39℃,5%CO2,的空氣條件下培養(yǎng)24-26h。3.4受精卵的發(fā)育培養(yǎng)(IVC)3.4.1IVC小i商的制備用微量移液器在超凈工作臺上吸取20ulESOF(用與早期胚胎培養(yǎng)的人工合成輸卵管培養(yǎng)液)，在35mm培養(yǎng)皿上制備IVC小滴。通常每個培養(yǎng)皿制備5滴IVC小滴，中間一滴為40ulIVC，用于洗滌胚胎。IVC小滴制備后，攫蓋礦物油，置于充滿5%CO2,7%02，88%氮氣的密閉罐中平衡至少2h，平衡溫度為39℃。3.4.2受精卵的發(fā)育培養(yǎng)受精卵培養(yǎng)24-26h后，將受精卵移入HSOF中，用微量移管反復吹吸受精卵，除去受精卵周圍的顆粒細胞。然后將受精卵移置IVC洗滌小滴中，在轉(zhuǎn)入IVC培養(yǎng)小滴中，每小滴受精卵數(shù)為10-15枚。然后將培養(yǎng)皿放入充滿濺COY,淺僅、88%氮氣的密閉罐中，在溫度為39攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在胚胎培養(yǎng)的第5天(受精當天為Od)，必須將胚胎移置LSOF(晚期培養(yǎng)液)中繼續(xù)培養(yǎng)2-3d<LSOF培養(yǎng)小滴的制備同上。在第5天轉(zhuǎn)移胚胎時，將未卵裂的卵母細胞留在中央的LSOF洗滌小滴中，并可記數(shù)卵裂情況。4供體和受體的術后觀察不論用何種方法移植胚胎，供體和受體的發(fā)情期應相同或前后相差不超過24小時，否則，將會影響成功率。所以在胚胎體外保存方法沒有得到較好的解決之前，必須對供體和受體同時進行同期發(fā)情處理，使兩者性腺和生殖道處于相同的生理狀態(tài)，以提高移植成活率。對供體和受體于術后要注意觀察是否發(fā)情。供體發(fā)情時即可正常配種，或經(jīng)過40-80天再重復作為供體。受體母畜如未發(fā)情，在適當時間進行妊娠檢查。若確已妊娠，應加強飼養(yǎng)管理。誘產(chǎn)雙胎的受體母畜以成年母畜較好，可以減少分娩困難。5胚胎移植的實際效果和影響因素供體取決于成年動物體內(nèi)環(huán)境與外界多種措施及胚胎的質(zhì)量如何，受體主要是與供體發(fā)情同步化程序，受體的黃體功能﹑品種﹑年齡﹑精子的質(zhì)量﹑胚胎保存過程中的技術水準移植人員的技術水平及移植的部位﹑受體牛發(fā)情鑒定的準確性﹑移植后受體母牛的飼養(yǎng)管理﹑手術損傷及外界多方面因素，都影響成功率；胚胎質(zhì)量和發(fā)育期對移植成功也有直接的關系，發(fā)育延遲和變性胚胎移植成功率很低，胚胎移植在普通溫度下進行成功率高，在高溫情況下移植的成功率很低，所以胚胎回收后，應盡快移植，才能獲得較高的胚胎發(fā)育率。新鮮一級和優(yōu)級胚及自然發(fā)情受體受胎率50-60%﹑新鮮一級和優(yōu)級胚及同期發(fā)情受體受胎率40-50%﹑體內(nèi)一級和優(yōu)級凍胚及自然發(fā)情受體受胎率35-45%﹑體內(nèi)一級和優(yōu)級凍胚及同期發(fā)情受體受胎率30-