第5章植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)

主要內(nèi)容原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體培養(yǎng)的優(yōu)越性原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)

現(xiàn)在是1頁\一共有34頁\編輯于星期四原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露球形細胞。現(xiàn)在是2頁\一共有34頁\編輯于星期四一、植物原生質(zhì)體的特點：1、吸收能力增強：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細胞器、細菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細胞壁再生并能進行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；

3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞?，F(xiàn)在是3頁\一共有34頁\編輯于星期四4、分泌能力提高去除了細胞壁的擴散障礙，使細胞膜的透過性增強，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差失去了細胞壁的保護作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響?，F(xiàn)在是4頁\一共有34頁\編輯于星期四原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細胞壁合成機理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機理細胞間的相互作用植物激素的作用機理融合產(chǎn)生體細胞雜種分離各種細胞器引入各種細胞器導(dǎo)入外源基因誘發(fā)突變體現(xiàn)在是5頁\一共有34頁\編輯于星期四

二、原生質(zhì)體的制備

不同的植物細胞，由于細胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有所不同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。

1、用于分離原生質(zhì)體的材料準備：選取生長旺盛的細胞。

無菌試管苗葉片

上胚軸和子葉

培養(yǎng)細胞（愈傷組織）現(xiàn)在是6頁\一共有34頁\編輯于星期四2、原生質(zhì)體的分離1）、機械法2）、酶解法現(xiàn)在是7頁\一共有34頁\編輯于星期四1）、機械法1892年首先用于藻類分離原生質(zhì)體做法：先使細胞質(zhì)壁分離，再用刀把細胞壁切破，使原生質(zhì)體流出或釋放出來。現(xiàn)在是8頁\一共有34頁\編輯于星期四優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。缺點：1)手工操作難度大，原生質(zhì)體得率低，費時費力，難以大量制備。2）能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制?，F(xiàn)在是9頁\一共有34頁\編輯于星期四2）、酶解法1960年英國諾丁漢大學的科金第一次用酶解法從番茄幼苗根尖中大量制備出原生質(zhì)體；常用酶：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶、蝸牛酶等；優(yōu)點：條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、得率高，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，影響所獲原生質(zhì)體的活力?，F(xiàn)在是10頁\一共有34頁\編輯于星期四酶解制備原生質(zhì)體過程1)、取材消毒2)、酶解制備3)、原生質(zhì)體收集現(xiàn)在是11頁\一共有34頁\編輯于星期四A、酶溶劑及其滲透壓酶的種類、

酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制、PH値。

滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解時間：酶濃度及溫度酶解考慮因素：現(xiàn)在是12頁\一共有34頁\編輯于星期四3、原生質(zhì)體的收集和純化：現(xiàn)在是13頁\一共有34頁\編輯于星期四1）沉淀法：篩網(wǎng)過濾除去未消化的細胞、細胞團和碎片后在適當試劑內(nèi)低速離心。

優(yōu)缺點：

比較簡單

但不易除盡一些完整的細胞，或引起原生質(zhì)的破碎現(xiàn)在是14頁\一共有34頁\編輯于星期四2）飄浮法：據(jù)原生質(zhì)體比重小能在一定滲透壓的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。

優(yōu)缺點：可以得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體，但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少現(xiàn)在是15頁\一共有34頁\編輯于星期四3）沉淀法和飄浮法結(jié)合：先沉淀后漂浮，重復(fù)操作，純化后可用于培養(yǎng)或細胞融合。現(xiàn)在是16頁\一共有34頁\編輯于星期四4）界面法采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中優(yōu)缺點：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎現(xiàn)在是17頁\一共有34頁\編輯于星期四

目的：檢驗獲得的原生質(zhì)體是否真正的原生質(zhì)體

鑒定方法(針對有無細胞壁)：4、原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法：原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水脹破，觀察有無細胞壁碎片；熒光染色法：通過熒光增白劑染色后離心去除多余染料，在熒光顯微鏡下觀察（波長3600-4400?），綠光顯示有纖維素，紅光示真正的原生質(zhì)體?，F(xiàn)在是18頁\一共有34頁\編輯于星期四5、原生質(zhì)體活力檢測染色法

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細胞質(zhì)膜，被活細胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。

伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴重損壞使細胞被染色。胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會隨著外界滲透壓的變化體積變化氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧現(xiàn)在是19頁\一共有34頁\編輯于星期四例子:植物（煙草）葉肉細胞原生質(zhì)體的分離1).材料的準備與消毒：2).酶解：3).純化：4).原生質(zhì)體的活力測定現(xiàn)在是20頁\一共有34頁\編輯于星期四1).材料的準備與消毒選取在溫室中生長兩個月左右的煙草植株從生長健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經(jīng)自來水沖洗干凈后放入70%乙醇中進行表面消毒然后再放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3~4次，以充分除去消毒劑現(xiàn)在是21頁\一共有34頁\編輯于星期四2).酶解用一把尖鑷子，小心撕去葉片的下表皮，將葉片切成2cm長的小片，然后放入含酶溶液中處理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，溫度25~28℃下經(jīng)3-4小時的酶解反應(yīng)，其間輕輕搖動培養(yǎng)皿若干次）現(xiàn)在是22頁\一共有34頁\編輯于星期四3).純化將酶解懸浮液通過300-400目網(wǎng)，以除去大的未消化的碎片然后將含有原生質(zhì)體的酶液收集在離心管中，低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底，傾去上清液在離心管中加入適量洗滌液，再離心；重復(fù)此步驟3次，使酶解液充分除去；最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次現(xiàn)在是23頁\一共有34頁\編輯于星期四6、影響原生質(zhì)體活力的因素：分離材料的生理狀態(tài)；酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓；分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間；環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響?，F(xiàn)在是24頁\一共有34頁\編輯于星期四二、原生質(zhì)體的培養(yǎng)一）、培養(yǎng)基1．滲透壓常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。2．無機鹽3．有機成分維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4．激素常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D5．pH值現(xiàn)在是25頁\一共有34頁\編輯于星期四二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體－固體雙層培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)現(xiàn)在是26頁\一共有34頁\編輯于星期四現(xiàn)在是27頁\一共有34頁\編輯于星期四三）影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素基因型：如番茄與秘魯番茄有性雜交后對性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是2個顯性基因所決定；原生質(zhì)體的來源：供體材料體類型、供體細胞的分化程度、供體細胞的生長同步性；起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基：基本起始密度、培養(yǎng)基激素水平、密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性。現(xiàn)在是28頁\一共有34頁\編輯于星期四三、原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生完整細胞植物組織原生質(zhì)體植物細胞去壁植株再生？愈傷組織胚狀體？？現(xiàn)在是29頁\一共有34頁\編輯于星期四一般包括如下幾個步驟：

1）細胞壁再生：體積膨大，葉綠體重新排列，新的細胞壁開始合成，細胞由球形變成橢圓形?，F(xiàn)在是30頁\一共有34頁\編輯于星期四2）分裂：一般在培養(yǎng)2-3天后細胞質(zhì)增加，細胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細胞分裂，形成小的細胞團，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。3）植株再生現(xiàn)在是31頁\一共有34頁\編輯于星期四植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用1、利用原生質(zhì)體融合獲得融合細胞2、利用原生質(zhì)體進行外源基因的轉(zhuǎn)化3、利用原生質(zhì)體再生植株4、利用固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物較多的分泌產(chǎn)物5、