單基因遺傳病的研究策略-2013課件

單基因遺傳病的研究策略醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系細胞樓304電話：如果一種遺傳病的發(fā)病僅僅涉及到一個基因，這個基因稱為主基因(majorgene)，其導(dǎo)致的疾病稱為單基因病。單基因遺傳病單基因遺傳病發(fā)病的復(fù)雜性外顯率：一定基因型個體表現(xiàn)出疾病表型的比例表現(xiàn)度：相同基因型不同個體在疾病表現(xiàn)程度的差異基因多效性：一個基因有多種生物學(xué)效應(yīng)遺傳異質(zhì)性：表型相似而基因型不同的現(xiàn)象從性遺傳和限性遺傳：常染色體上的基因在不同的性別有不同的表達程度和表達方式，從而造成男女性狀分布上的差異遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象：疾病在世代中存在發(fā)病年齡逐漸提前或病情逐代加重的情況臨床診斷、家系調(diào)查與材料收集臨床診斷查閱相關(guān)資料，認(rèn)識不同遺傳病患者臨床表現(xiàn)及其輔助診斷措施臨床診斷：癥狀和體征常規(guī)輔助檢測指標(biāo)特殊診斷指標(biāo)家系調(diào)查與系譜分析調(diào)查家系三代以上所有相關(guān)成員的信息根據(jù)調(diào)查資料，用系譜中常用的符號繪制成系譜系譜分析：區(qū)別遺傳病與非遺傳病區(qū)別單基因與多基因病判斷遺傳方式大家系臨床遺傳病家系特點散發(fā)病例：對于遺傳病，包括單基因遺傳病，多數(shù)病例表現(xiàn)為散發(fā)。小家系病例：在有家族史的病例中，多數(shù)也是小家系。大家系病例：極少數(shù)家系發(fā)病個體多，涉及3-4代都有患者。收集材料采集樣品：

外周血，頰粘膜脫落細胞，毛囊,

病人組織（如可以取材），羊水（產(chǎn)前診斷）采集家系應(yīng)做到盡可能完整患者、同一家系中有相同遺傳背景的表型正常的其他個體、該家系中其他遺傳背景的成員侯選基因的確定文獻檢索數(shù)據(jù)庫

中的OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）數(shù)據(jù)庫中整合了目前已定位的單基因病的信息確定自己所研究家系的可能已知候選基因或已定位的染色體候選區(qū)域根據(jù)疾病名稱檢索檢索最新文獻確定已知致病基因突變獲得已知基因基因組序列設(shè)計引物或參考文獻中引物根據(jù)文獻，采用合適的技術(shù)方法進行基因突變分析（在后面課程中詳細介紹）從數(shù)據(jù)庫中查閱目的基因的相關(guān)信息根據(jù)變異導(dǎo)致的結(jié)果判斷根據(jù)突變數(shù)據(jù)庫和文獻資料排除已知SNP根據(jù)家系共分離與否判斷在正常對照人群中分析保守性分析基因功能分析突變分析結(jié)果的判斷連鎖分析與未知基因的基因定位

利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。連鎖分析注：適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例遺傳標(biāo)記進行連鎖分析時需要的一些已知遺傳位點，這些位點應(yīng)按孟德爾方式遺傳，且具有多態(tài)性以便顯示連鎖關(guān)系，這些標(biāo)記位點稱為遺傳標(biāo)記RFLP，STR,SNP連鎖分析結(jié)果定位克隆基本方法和步驟收集家系，選擇遺傳標(biāo)記進行連鎖分析，對目的基因作圖定位確定候選位置，對目的基因進行精細定位從候選基因中確定正確的基因（二代測序技術(shù)）例：一個X連鎖肌肉病家系致病基因的定位克隆研究

家系情況及前期研究基礎(chǔ)先證者Ⅲ2臨床表現(xiàn)近似DMD排除了DMD/EMD/FHL1基因突變研究策略全基因組90萬個SNP位點；8例樣本；商業(yè)公司完成選取數(shù)個SNP點；增加3個成員連鎖區(qū)域內(nèi)的基因：MapViewer；基因表達：UniGene數(shù)據(jù)庫及HGNC網(wǎng)站；基因功能：OMIM數(shù)據(jù)庫1例樣本(I2)；商業(yè)公司完成SNP芯片數(shù)據(jù)分析

連鎖分析

提示X染色體有三段連鎖區(qū)域：單體型分析

GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)

Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49

Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62

Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段連鎖區(qū)域精細定位分析將Xp22.32-p22.2連鎖區(qū)域由6.78Mb縮短為4.18Mb

排除Xp21.2-p21.1連鎖區(qū)域肯定Xq24-q27.2連鎖區(qū)域最終確定兩段連鎖區(qū)域GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06

連鎖區(qū)域內(nèi)包含的基因Xp22.32-p22.2連鎖區(qū)域共28個基因：14個已知基因,14個預(yù)測基因14個已知基因：6個基因在肌肉組織中表達（3個基因表型已知，均與肌肉病無關(guān)）7個基因不在肌肉組織表達1個基因表達情況未知

Xq24-q27.2連鎖區(qū)域共272個基因：122個已知基因,150個未知基因122個已知基因：79個基因在肌肉組織中表達（18個基因表型已知，其中包括前期已經(jīng)排除的FHL1基因）41個基因不在肌肉組織表達2個基因表達情況不清楚

外顯子組測序平均覆蓋度：23.8×；覆蓋度大于>20×位點占53.7%在上述兩個連鎖區(qū)域測序深度均很低對測序深度>20的變異位點進行驗證，結(jié)果均無變異存在的問題及解決辦法本家系患者未進行肌肉活檢將進行多個樣本的外顯子組測序Genotype和Phenotype相關(guān)性研究例：非綜合征型先天缺牙的分子遺傳學(xué)研究

JDentRes,2009;88:126-131EurJMedGenet,2008;51:536-546EurJMedGenet,2011;54:377-382單基因遺傳病發(fā)病機制的研究——隱性突變往往導(dǎo)致失去功能（lossoffunction）——顯性突變可導(dǎo)致獲得功能（gainoffunction）和失去功能失去功能：單倍劑量不足（halpoinsufficency）獲得功能：顯性負效應(yīng)（dominantnegtive）

隱性突變和顯性突變的致病機制Gainoffunction：

Loricrin基因突變獲得核轉(zhuǎn)位的新功能

BrJDermatol,2008;159:714-719

Loricrin角皮病連鎖分析與1q21區(qū)域連鎖發(fā)現(xiàn)Loricrin基因新突變特殊的臨床表現(xiàn)突變蛋白序列新功能的預(yù)測GFP表達載體的構(gòu)建細胞亞定位分析動物模型過表達和基因敲除小鼠模型均表現(xiàn)正常表型轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出與人類疾病相似的疾病表型，提示突變基因獲得功能為其發(fā)病機制?；蚯贸∈蟊硇突菊＾D(zhuǎn)基因小鼠表型與人類疾病相似結(jié)論

Loricrin基因突變可引起新的疾病表型Loricrin突變蛋白獲得新功能，通過其核定位信號介導(dǎo)了突變蛋白的核轉(zhuǎn)位Haploinsufficiency：

PAX6基因單倍劑量不足影響胰島素成熟過程導(dǎo)致糖耐受異常

Diabetologia.2009;52:504-13先天性無虹膜家系在該家系發(fā)現(xiàn)

PAX6突變(c.1080C>T)導(dǎo)致單倍劑量不足

SSCPanalysis

DNAsequencing

Tonetal.Cell67,1991PAX6

基因及其cDNAEssentialforthedevelopmentoftheeye&brain

homozygous

mutants—noeyes,nobrain,die

heterozygousmutants—smalleyesinmiceaniridiainhumansEssentialforthedevelopmentofpancreas

homozygous

mutants—abnormalpancreaticstructurePAX6的功能Hilletal.Nature354,1991;St-Ongeetal.Nature387,1997;Sanderetal.GenesDev11,1997PAX6在胰腺發(fā)育中的功能Mansourietal.TEM10,1999Dohrmannetal.MechDev92,2000

PAX6在成體胰腺中的功能Homozygousmicewithconditionalk/oPAX6inthepancreascauseddiabetes

FouraniridiapatientswithPAX6mutationswerereportedtosufferfromglucoseintolerance

Ashery-Padanetal.DevBiol269,2004Yasudaetal.Diabetes51,2002

假說PAX6mutation?abnormalglucosehomeostasisOGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDAgeBMI(kgm-2)Glucoselevels(mmolL-1)ClinicalstatusAniridiaGenotype0’120’

Ⅱ-6Ⅱ-7Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-5Ⅲ-6Ⅲ-8Ⅲ-9Ⅲ-10Ⅲ-11Ⅲ-13706850434133304038363217.5820.2217.8820.8621.1520.4220.9920.4320.9622.9320.834.554.084.865.253.694.274.916.055.277.744.668.0412.9911.418.657.806.625.8814.579.7815.617.31IGTDDIGTIGTNGTNGTDIGTDIGT+++++++++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-9171811161419.4120.3315.2819.4116.194.173.984.725.144.587.956.855.666.217.07IGTNGTNGTNGTNGT+

++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢ-15Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-84138343330151171219.9321.1922.3020.4322.8317.3115.4215.0616.544.414.894.254.014.384.155.244.814.716.765.335.036.006.635.485.086.186.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT---------N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N血糖和胰島素水平總結(jié)1AniridiacausedbyPAX6genemutationPAX6mutationcausedimpairedglucosetolerance(IGT)PAX6-relatedIGTwasassociatedwithage問題DoesIGTcomefromdeficiencyofinsulin?Dothesepatientshaveinsulinresistance?Dopatientshaveadefectininsulinprocessing?