基因工程實(shí)驗(yàn)流程課件

基因工程實(shí)驗(yàn)流程總覽DNA提取，純化限制圖譜瓊脂糖電泳檢測(cè)片段體外擴(kuò)增PCR目的基因制備載體選擇DNA重組片段連接未知核酸序列須DNA片段大小估計(jì)互補(bǔ)性黏性不互補(bǔ)性黏性末端平末端限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法簡(jiǎn)單基因組分離如質(zhì)粒和病毒物理化學(xué)法構(gòu)建基因組文庫PCR擴(kuò)增基因的化學(xué)合成雙抗體免疫法酶促反應(yīng)mRNA-cDNA

目的基因分離雙酶切部分酶切Bal31逐步切割轉(zhuǎn)座子基因定位克隆酵母雙雜交前處理防止自連RNA提取RT-PCRTA克隆藍(lán)白選擇膠回收表達(dá)引物PCR載體PCR產(chǎn)物回收轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞油菜TOC33基因片的克隆實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目背景國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（油菜葉綠體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)突變體中差異表達(dá)基因的克隆，編號(hào)：）。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過本綜合實(shí)驗(yàn)，掌握植物基因組DNA的制備技術(shù)、PCR技術(shù)、限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)、重組DNA技術(shù)、克隆鑒定技術(shù)、質(zhì)粒DNA的制備、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、測(cè)序技術(shù)、生物信息技術(shù)等，得到一個(gè)與科學(xué)研究過程相近的分子生物學(xué)綜合技能訓(xùn)練。具體實(shí)驗(yàn)步驟Ⅰ.植物基因組DNA的制備Ⅱ.TOC33基因片段的PCR擴(kuò)增Ⅲ.DNA的瓊脂糖凝膠上回收與純化IV.DNA片段的體外重組與轉(zhuǎn)化V.克隆的篩選與鑒定VI.序列分析Ⅰ.植物基因組DNA的制備取0.2g樣品嫩葉至1.5mLEP管中，放在液氮中冷凍處理后，在EP管中充分搗碎，加入0.6mL抽提緩沖液，65℃水浴處理10min。12,000rpm離心3min，取上清，加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，遇有絮狀沉淀，4,000rpm離心5min。沉淀用50ulTE-RNase（5.0mMTris.HClpH8.0，1.0mMEDTApH8.0，RNaseA30ug/mL）溶解，37℃保溫處理15min。加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃下沉淀10min，4,000rpm離心3min，加適量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ulddH2O溶解備用。Ⅱ.TOC33基因片段的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，為擴(kuò)增Toc33片段，用OLIG05.0設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物:上游引物P1:5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'，下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。在0.2mLEppendorf管內(nèi)配制25ul反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.5ulMg2+1.5ul

dNTP1.0ulPrimer11.0ulPrimer21.0ul

Taq

酶0.5ul

模板1.0ulddH2O16.5ul1)

94oC預(yù)變性5min2)

94oC變性30sec3)

55oC退火30sec4)

72oC延伸45sec5)

重復(fù)步驟2)-4)30次6)

72oC延伸10min電泳染色后，在紫外分析儀上切取所需要的條帶，按1克膠：1000添加提取緩沖液，放在60度的金屬浴中溶解。然后把溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中，6000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；倒掉上清，再加入500微升的extractionbuffer,12000r/min離心1分鐘；倒掉上清，加入750微升的washbuffer,12000r/min離心1分鐘；倒掉上清，重復(fù)步驟三；倒掉上清，在12000r/min下空轉(zhuǎn)1分鐘；把帶有膜的管子換到新的EP管中，加入30~50微升的水，靜置1分鐘，12000r/min離心一分鐘，即得到所要回收的片斷。此樣品可用來做酶切等。Ⅲ.瓊脂糖凝膠上DNA的回收與純化IV.DNA片段的體外重組加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時(shí)離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當(dāng)中37度酶切兩個(gè)半小時(shí)左右，取出酶切產(chǎn)物，用試劑盒進(jìn)行割膠回收進(jìn)一步純化酶切片斷以進(jìn)行連接反應(yīng)。酶切體系：40.0ulddH2O9.0ul10×Buffer4.0ulDNA25.0ulXbaI、1.0ulHindIII1.0ul

連接反應(yīng)：連接體系：（20.0ul）酶切產(chǎn)物3.0ulBuffer1.0ul載體14.0ulLiagse2.0ul加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時(shí)離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當(dāng)中16度連接過夜。V.克隆的篩選與鑒定1.

用移液槍在1.5mlEP管中加入液體LB培養(yǎng)基500ul，再用滅過菌的牙簽在生長(zhǎng)藍(lán)白斑的平板上挑取陽性克隆放于EP管中，丟棄牙簽，蓋緊管口，用報(bào)紙包好放到37OC，200r/min的搖床中過夜培養(yǎng)；2.

EP管出現(xiàn)混濁，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。3.

對(duì)于得到的質(zhì)粒再酶切電泳檢測(cè)陽性克隆，如果酶切后的電泳圖上出現(xiàn)了與插入片斷相應(yīng)大小的條帶，證明是此單菌落是陽性克隆，否則是假陽性的。試劑盒質(zhì)?；厥者^程

把過夜培養(yǎng)菌液，10000r/min離心1分鐘，倒掉上清液；向菌體中加入質(zhì)?；厥赵噭┖兄械腟olutionI400微升，震蕩，直到沉淀的菌體完全懸浮；然后加入400微升的SolutionII，輕輕地顛倒混勻，然后在室溫下放置2分鐘；加入525微升的SolutionIII，顛倒混勻，直到出現(xiàn)白色的絮狀沉淀，10000r/min離心10分鐘；把上清液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中，10000r/min離心1分鐘;倒掉溶液，向管子中加入600微升的bufferHB，10000r/min離心1分鐘；倒掉溶液，加入750微升的washbuffer,10000r/min離心1分鐘;重復(fù)上一步驟7次；倒掉溶液后空轉(zhuǎn)一次，以盡量除盡殘余的washbuffer;將帶有膜的管子轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入100微升的水，靜置1分鐘，10000r/min離心1分鐘，即得到所需要的質(zhì)粒。VI.序列分析獲得的陽性單克隆送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的同源性比較采用GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比較運(yùn)用DNAsist軟件。一、實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備水稻卵細(xì)胞的分離分離準(zhǔn)備工作材料的速凍長(zhǎng)期保存人工氣候箱、制冰機(jī)超凈工作臺(tái)、顯微操作系統(tǒng)RNase-free耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase抑制劑二、卵細(xì)胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細(xì)胞裂解勻漿去蛋白和細(xì)胞殘?jiān)鼫卦〔⒔Y(jié)合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機(jī)恒溫水浴鍋離心機(jī)、旋渦混勻器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材三、目標(biāo)片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建水稻卵細(xì)胞cDNA文庫；目標(biāo)基因的獲得；通過噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標(biāo)質(zhì)粒；利用測(cè)序儀和通用引物對(duì)克隆的目的基因測(cè)序；2.目標(biāo)基因的克隆利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行文庫目標(biāo)基因的篩選將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過印跡轉(zhuǎn)于尼龍膜，并于核酸交聯(lián)儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫?fù)u床中洗膜（探針標(biāo)記：放射性和非放射性）將噬菌體培養(yǎng)于平板，于42℃培養(yǎng)幾小時(shí)后，于37℃用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)并印記于尼龍膜上，利用抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行雜交利用GSP（基因特異引物）通過PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因利用GSP，以文庫為模板通過PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因，并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。利用文庫載體序列和已知的目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)通用引物和GSP，通過5’RACE和3’RACE擴(kuò)增出目標(biāo)基因的5’和3’端序列。并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。通過5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目標(biāo)基因四、DNA、RNA的提取、純化和分析包含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的獲得對(duì)于通過篩庫技術(shù)獲得的目標(biāo)基因，通過噬菌體載體的自切割作用生成目標(biāo)質(zhì)粒。水稻基因組DNA的提取、純化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析水稻基因組DNA的提取、純化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組DNA：利用SDS在高鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質(zhì)的原理提取基因組DNA利用酚-氯仿抽提或過濾柱純化基因組DNA水稻基因組文庫的構(gòu)建利用特異的探針，通過Southernblotting檢測(cè)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析分離所需的水稻各器官組織，并利用Qiagen的RNeasy系列試劑盒提取總RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA在RNase-free的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量利用特異性的探針，通過Northernblotting檢測(cè)目標(biāo)基因在各器官的表達(dá)情況克隆化基因的表達(dá)基因的克?。豪酶弑Ｕ娴腡aq酶和合適的反應(yīng)系統(tǒng)，通過PCR獲得與目標(biāo)基因完全一致的DNA片段（通過測(cè)序確證）體內(nèi)表達(dá)：選擇合適的表達(dá)載體插入目標(biāo)片段。利用化學(xué)方法或電轉(zhuǎn)化儀等手段轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)：兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、小麥胚芽提取物等表達(dá)蛋白的純化SDS聚丙烯酰胺膠回收：利用SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達(dá)目標(biāo)基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標(biāo)蛋白自動(dòng)核酸/蛋白純化工作站目標(biāo)蛋白功能分析抗體的制備：多抗、單抗DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究：Gel-shift實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術(shù)等蛋白體內(nèi)表達(dá)研究Westernblotting：利用抗原-抗體反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)混合物中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒別和定量免疫組織化學(xué)研究：通過切片技術(shù)和免疫反應(yīng)，利用特異抗體檢測(cè)特定蛋白在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：載體、農(nóng)桿菌、特殊抗生素植株的轉(zhuǎn)化：葉盤轉(zhuǎn)化法、基因槍植株的篩選：熒光檢測(cè)、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、FISH等連接反應(yīng)⑴在滅菌的0.5mL離心管中進(jìn)行。

⑵10μL體積反應(yīng)體系中：2×快速連接緩沖液5μL目的基因的雙酶切產(chǎn)物XμLpMal-c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物XμLT4-DNA連接酶0.3μL⑶輕輕混勻，室溫下放置過夜。注意事項(xiàng)：目的基因和c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的加入比例應(yīng)根據(jù)電泳結(jié)果而定，使加入的2片段的濃度比為1：1剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉(zhuǎn)化時(shí)做對(duì)照感受態(tài)菌的制備（1）E.coliTB1菌株37℃過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液1mL加入到50mLLB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min振蕩培養(yǎng)3h，至A600約為0.4左右。（2）無菌條件下，將50mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。（3）在預(yù)冷4℃的離心機(jī)上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃離心10min，棄去上清，每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預(yù)冷的含有10%~20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，100μL/管分裝，于-70℃條件下，可保存半年。注意事項(xiàng)：細(xì)胞一旦離開培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)操作要輕柔。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中注意將細(xì)胞置于冰上不能搖過了?。?！選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞預(yù)先冷卻pMal-ade重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）向分裝有100μLE.coliTB1菌株感受態(tài)細(xì)胞的EP管中加入2μL的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30min。（2）將該EP管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2min。（3）向EP管加入900μLLB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃搖床上，150r/min，溫育45min以復(fù)蘇菌株。（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于瓊脂平板表面。（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)；水浴溫度要準(zhǔn)確，熱擊時(shí)不要搖動(dòng)EP管UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提將過夜培養(yǎng)的1～2ml細(xì)菌12,000rpm離心15秒，徹底去除上清。加入100lSolutionI，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。加入200lSolutionII，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個(gè)方向，慢慢旋轉(zhuǎn)離心管），使細(xì)菌裂解，室溫放置2分鐘。加入350lSolutionIII，立即上下顛倒5～10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。12,000rpm，離心5分鐘。

將步驟5中上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0-ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，8,000rpm室溫離心15秒。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500lWashSolution到UNIQ-10柱，10,000rpm室溫離心30秒。重復(fù)步驟7。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10,000rpm室溫離心30秒以徹底去除WashSolution。將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5-ml離心管中，加50lElutionBuffer，室溫放置2分鐘后，10,000rpm室溫離心1分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。注意：對(duì)于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，請(qǐng)用2～5ml細(xì)胞，同時(shí)按比例相應(yīng)提高SolutionI，II和III的用量。在執(zhí)行步驟5后，將上清分批加入到UNIQ-10柱中，重復(fù)步驟6，直至處理完所有樣品。不能劇烈混合，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA污染。不要吸取沉淀，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染。：（1）如果要提高質(zhì)粒的濃度，可以用30lElutionBuffer，37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm室溫離心1分鐘。（2）55~80℃洗脫可提高回收率10~20個(gè)百分點(diǎn)。PCR篩選1、調(diào)整模板（pMal-ade重組質(zhì)粒）濃度至5ng/μL。2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，TemplateDNA

1.0μL（20ng）10×buffer

2.0μLMgCl2（25mmol/L）

1.5μLPrimer1(10μmol/L)

0.5μLPrimer2(10μmol/L)

0.5μLdNTPs（2mmol/L）

2.0μLTaq酶（5U/μL）

0.5μL加ddH2O至

20μL外源基因的特異引物：引物1（5`--CCGGAATTCTTGAATAAAGAAGCGCTAGTC—3`）和引物2（5`--CGGGGATCCGTCGACTTATTGCAGTGATATGTGTTG—3`）。3．PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置94℃變性反應(yīng)1min；55℃退火反應(yīng)45s；72℃延伸反應(yīng)1min。進(jìn)行25個(gè)循環(huán)后，最后一個(gè)循環(huán)72℃延長(zhǎng)至10min。迅速冷卻4℃。4、檢測(cè)加2μL溴酚藍(lán)和10μL反應(yīng)產(chǎn)物，混勻，取15μL反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳。5、成像分析在1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳0.5~1h，電泳結(jié)束后EB染色15～20min，凝膠成像分析結(jié)果。

pMD18-TVectorpMD18-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)的專用載體。這種載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體（參見第12章基因工程的載體）的多克隆位點(diǎn)處的XbaI和SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加"T"而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)"A"的特性，所以使用這種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。EcoR

V←--T-cloningsitecDNA

文庫應(yīng)用分離新基因的方法

發(fā)現(xiàn)并分離克隆新基因始終是分子生物學(xué)研究的主要任務(wù)和目的，雖然

cDNA

文庫的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的

cDNA

文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對(duì)于非全長(zhǎng)

cDNA

文庫，即不管是經(jīng)典的

cDNA

文庫方法或差減法構(gòu)建的

cDNA

文庫，需要利用已經(jīng)獲得的新

cDNA

序列片段，通過

RACE

方法獲得新基因的全長(zhǎng)序列。第二，利用全長(zhǎng)

cDNA

文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。

從非全長(zhǎng)

cDNA

文庫中篩選新基因

3.1.1

RACE

法

RACE

文庫即快速擴(kuò)增

cDNA

末端法(

Rapid

Amplification

of

cDNA

End，RACE

)只需知道

mRNA

內(nèi)很短的一段序列即可擴(kuò)增出其

cDNA

的5'(5'

RACE

)和3'端(3'

RACE

)。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的特異性引物和一條與

mRNA

的

PolyA

(3'

RACE

)或加至第一鏈

cDNA

3'端的同聚尾(5'

RACE

)互補(bǔ)的通用引物，由于同聚體并非良好的

PCR

引物，同時(shí)為了便于

RACE

產(chǎn)物的克隆，可向同聚體引物的5'端內(nèi)加入一內(nèi)切酶位點(diǎn)。所用的

cDNA

模板可以使用多聚

dT

引物延伸合成(3'，5'-RACE

均可)。當(dāng)

RACE

PCR

產(chǎn)物為復(fù)雜的混合物時(shí)，可取部分產(chǎn)物作模板，用另一條位于原引物內(nèi)側(cè)的序列作為引物與通用引物配對(duì)進(jìn)行另一輪

PCR

(巢式

PCR

)。早在1988年，F(xiàn)ROHMAN

等即用此方法成功地獲得了4種

mRNA

的5'合3'末端序列。

用

PCR

法從

cDNA

文庫中快速克隆基因

通過對(duì)文庫的篩選或適用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行

PCR

反應(yīng)，常常只能獲得不完整的

cDNA

片段。為了得到

cDNA

全長(zhǎng)，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大，RACE

雖然為此提供可方便，但應(yīng)用該方法需重新提取

mRNA

和反轉(zhuǎn)錄。而用

PCR

法從

cDNA

文庫中快速克隆基因的方法，只需提取

λ

噬菌體

DNA，按保守序列設(shè)計(jì)

PCR

引物便可將未知片段進(jìn)行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用

P