基因工程實驗流程課件

基因工程實驗流程總覽DNA提取，純化限制圖譜瓊脂糖電泳檢測片段體外擴增PCR目的基因制備載體選擇DNA重組片段連接未知核酸序列須DNA片段大小估計互補性黏性不互補性黏性末端平末端限制性核酸內切酶酶切分離法簡單基因組分離如質粒和病毒物理化學法構建基因組文庫PCR擴增基因的化學合成雙抗體免疫法酶促反應mRNA-cDNA

目的基因分離雙酶切部分酶切Bal31逐步切割轉座子基因定位克隆酵母雙雜交前處理防止自連RNA提取RT-PCRTA克隆藍白選擇膠回收表達引物PCR載體PCR產物回收轉化感受態(tài)細胞油菜TOC33基因片的克隆實驗項目背景國家自然科學基金項目（油菜葉綠體蛋白質轉運突變體中差異表達基因的克隆，編號：）。實驗目的

通過本綜合實驗，掌握植物基因組DNA的制備技術、PCR技術、限制性內切酶酶切技術、重組DNA技術、克隆鑒定技術、質粒DNA的制備、瓊脂糖凝膠電泳技術、測序技術、生物信息技術等，得到一個與科學研究過程相近的分子生物學綜合技能訓練。具體實驗步驟Ⅰ.植物基因組DNA的制備Ⅱ.TOC33基因片段的PCR擴增Ⅲ.DNA的瓊脂糖凝膠上回收與純化IV.DNA片段的體外重組與轉化V.克隆的篩選與鑒定VI.序列分析Ⅰ.植物基因組DNA的制備取0.2g樣品嫩葉至1.5mLEP管中，放在液氮中冷凍處理后，在EP管中充分搗碎，加入0.6mL抽提緩沖液，65℃水浴處理10min。12,000rpm離心3min，取上清，加入二倍體積預冷的無水乙醇沉淀，遇有絮狀沉淀，4,000rpm離心5min。沉淀用50ulTE-RNase（5.0mMTris.HClpH8.0，1.0mMEDTApH8.0，RNaseA30ug/mL）溶解，37℃保溫處理15min。加入二倍體積預冷的無水乙醇，-20℃下沉淀10min，4,000rpm離心3min，加適量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ulddH2O溶解備用。Ⅱ.TOC33基因片段的PCR擴增引物設計，為擴增Toc33片段，用OLIG05.0設計1對PCR引物:上游引物P1:5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'，下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。在0.2mLEppendorf管內配制25ul反應體系：10×PCRBuffer2.5ulMg2+1.5ul

dNTP1.0ulPrimer11.0ulPrimer21.0ul

Taq

酶0.5ul

模板1.0ulddH2O16.5ul1)

94oC預變性5min2)

94oC變性30sec3)

55oC退火30sec4)

72oC延伸45sec5)

重復步驟2)-4)30次6)

72oC延伸10min電泳染色后，在紫外分析儀上切取所需要的條帶，按1克膠：1000添加提取緩沖液，放在60度的金屬浴中溶解。然后把溶液轉移到試劑盒專用管中，6000轉/分離心1分鐘；倒掉上清，再加入500微升的extractionbuffer,12000r/min離心1分鐘；倒掉上清，加入750微升的washbuffer,12000r/min離心1分鐘；倒掉上清，重復步驟三；倒掉上清，在12000r/min下空轉1分鐘；把帶有膜的管子換到新的EP管中，加入30~50微升的水，靜置1分鐘，12000r/min離心一分鐘，即得到所要回收的片斷。此樣品可用來做酶切等。Ⅲ.瓊脂糖凝膠上DNA的回收與純化IV.DNA片段的體外重組加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當中37度酶切兩個半小時左右，取出酶切產物，用試劑盒進行割膠回收進一步純化酶切片斷以進行連接反應。酶切體系：40.0ulddH2O9.0ul10×Buffer4.0ulDNA25.0ulXbaI、1.0ulHindIII1.0ul

連接反應：連接體系：（20.0ul）酶切產物3.0ulBuffer1.0ul載體14.0ulLiagse2.0ul加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當中16度連接過夜。V.克隆的篩選與鑒定1.

用移液槍在1.5mlEP管中加入液體LB培養(yǎng)基500ul，再用滅過菌的牙簽在生長藍白斑的平板上挑取陽性克隆放于EP管中，丟棄牙簽，蓋緊管口，用報紙包好放到37OC，200r/min的搖床中過夜培養(yǎng)；2.

EP管出現混濁，用質粒提取試劑盒提取質粒。3.

對于得到的質粒再酶切電泳檢測陽性克隆，如果酶切后的電泳圖上出現了與插入片斷相應大小的條帶，證明是此單菌落是陽性克隆，否則是假陽性的。試劑盒質?；厥者^程

把過夜培養(yǎng)菌液，10000r/min離心1分鐘，倒掉上清液；向菌體中加入質?；厥赵噭┖兄械腟olutionI400微升，震蕩，直到沉淀的菌體完全懸?。蝗缓蠹尤?00微升的SolutionII，輕輕地顛倒混勻，然后在室溫下放置2分鐘；加入525微升的SolutionIII，顛倒混勻，直到出現白色的絮狀沉淀，10000r/min離心10分鐘；把上清液轉移到試劑盒專用管中，10000r/min離心1分鐘;倒掉溶液，向管子中加入600微升的bufferHB，10000r/min離心1分鐘；倒掉溶液，加入750微升的washbuffer,10000r/min離心1分鐘;重復上一步驟7次；倒掉溶液后空轉一次，以盡量除盡殘余的washbuffer;將帶有膜的管子轉移到新的EP管中，加入100微升的水，靜置1分鐘，10000r/min離心1分鐘，即得到所需要的質粒。VI.序列分析獲得的陽性單克隆送樣測序，測序結果的同源性比較采用GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比較運用DNAsist軟件。一、實驗起始材料的選取和準備水稻卵細胞的分離分離準備工作材料的速凍長期保存人工氣候箱、制冰機超凈工作臺、顯微操作系統(tǒng)RNase-free耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase抑制劑二、卵細胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細胞裂解勻漿去蛋白和細胞殘渣溫浴并結合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機恒溫水浴鍋離心機、旋渦混勻器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材三、目標片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文庫構建試劑盒構建水稻卵細胞cDNA文庫；目標基因的獲得；通過噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標質粒；利用測序儀和通用引物對克隆的目的基因測序；2.目標基因的克隆利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原-抗體反應進行文庫目標基因的篩選將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過印跡轉于尼龍膜，并于核酸交聯儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫搖床中洗膜（探針標記：放射性和非放射性）將噬菌體培養(yǎng)于平板，于42℃培養(yǎng)幾小時后，于37℃用IPTG誘導融合蛋白的表達并印記于尼龍膜上，利用抗原-抗體反應進行雜交利用GSP（基因特異引物）通過PCR擴增出目標基因利用GSP，以文庫為模板通過PCR擴增出目標基因，并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。利用文庫載體序列和已知的目標基因的序列設計通用引物和GSP，通過5’RACE和3’RACE擴增出目標基因的5’和3’端序列。并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。通過5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目標基因四、DNA、RNA的提取、純化和分析包含有目標基因的質粒的獲得對于通過篩庫技術獲得的目標基因，通過噬菌體載體的自切割作用生成目標質粒。水稻基因組DNA的提取、純化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析水稻基因組DNA的提取、純化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組DNA：利用SDS在高鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質的原理提取基因組DNA利用酚-氯仿抽提或過濾柱純化基因組DNA水稻基因組文庫的構建利用特異的探針，通過Southernblotting檢測目標基因的拷貝數水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析分離所需的水稻各器官組織，并利用Qiagen的RNeasy系列試劑盒提取總RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA在RNase-free的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量利用特異性的探針，通過Northernblotting檢測目標基因在各器官的表達情況克隆化基因的表達基因的克?。豪酶弑Ｕ娴腡aq酶和合適的反應系統(tǒng)，通過PCR獲得與目標基因完全一致的DNA片段（通過測序確證）體內表達：選擇合適的表達載體插入目標片段。利用化學方法或電轉化儀等手段轉入細胞表達體外轉錄和翻譯系統(tǒng)：兔網織紅細胞裂解物、小麥胚芽提取物等表達蛋白的純化SDS聚丙烯酰胺膠回收：利用SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達目標基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標蛋白自動核酸/蛋白純化工作站目標蛋白功能分析抗體的制備：多抗、單抗DNA-蛋白質相互作用研究：Gel-shift實驗、蛋白質磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等蛋白質-蛋白質相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術等蛋白體內表達研究Westernblotting：利用抗原-抗體反應，對蛋白質混合物中的目標蛋白進行鑒別和定量免疫組織化學研究：通過切片技術和免疫反應，利用特異抗體檢測特定蛋白在組織細胞內的表達和定位蛋白質芯片系統(tǒng)基因轉化實驗和轉基因結果分析轉基因載體的構建：載體、農桿菌、特殊抗生素植株的轉化：葉盤轉化法、基因槍植株的篩選：熒光檢測、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、FISH等連接反應⑴在滅菌的0.5mL離心管中進行。

⑵10μL體積反應體系中：2×快速連接緩沖液5μL目的基因的雙酶切產物XμLpMal-c2x質粒雙酶切產物XμLT4-DNA連接酶0.3μL⑶輕輕混勻，室溫下放置過夜。注意事項：目的基因和c2x質粒雙酶切產物的加入比例應根據電泳結果而定，使加入的2片段的濃度比為1：1剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉化時做對照感受態(tài)菌的制備（1）E.coliTB1菌株37℃過夜培養(yǎng)以復蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液1mL加入到50mLLB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min振蕩培養(yǎng)3h，至A600約為0.4左右。（2）無菌條件下，將50mL菌液轉移至離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。（3）在預冷4℃的離心機上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入5mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃離心10min，棄去上清，每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預冷的含有10%~20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細胞沉淀，100μL/管分裝，于-70℃條件下，可保存半年。注意事項：細胞一旦離開培養(yǎng)基，實驗操作要輕柔。整個實驗過程中注意將細胞置于冰上不能搖過了?。?！選用處于對數生長期的細胞預先冷卻pMal-ade重組質粒的轉化（1）向分裝有100μLE.coliTB1菌株感受態(tài)細胞的EP管中加入2μL的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉以混合內容物，冰浴上放置30min。（2）將該EP管放入預加溫至42℃的水浴中，放置90s，快速轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min。（3）向EP管加入900μLLB培養(yǎng)基，轉移至37℃搖床上，150r/min，溫育45min以復蘇菌株。（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉化細胞平鋪于瓊脂平板表面。（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)；水浴溫度要準確，熱擊時不要搖動EP管UNIQ-10柱式質粒小量抽提將過夜培養(yǎng)的1～2ml細菌12,000rpm離心15秒，徹底去除上清。加入100lSolutionI，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。加入200lSolutionII，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個方向，慢慢旋轉離心管），使細菌裂解，室溫放置2分鐘。加入350lSolutionIII，立即上下顛倒5～10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。12,000rpm，離心5分鐘。

將步驟5中上清轉移到套放于2.0-ml收集管內的UNIQ-10柱中，8,000rpm室溫離心15秒。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500lWashSolution到UNIQ-10柱，10,000rpm室溫離心30秒。重復步驟7。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10,000rpm室溫離心30秒以徹底去除WashSolution。將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5-ml離心管中，加50lElutionBuffer，室溫放置2分鐘后，10,000rpm室溫離心1分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質粒DNA。注意：對于低拷貝數的質粒，請用2～5ml細胞，同時按比例相應提高SolutionI，II和III的用量。在執(zhí)行步驟5后，將上清分批加入到UNIQ-10柱中，重復步驟6，直至處理完所有樣品。不能劇烈混合，否則會出現基因組DNA污染。不要吸取沉淀，否則會出現基因組DNA和蛋白質污染。：（1）如果要提高質粒的濃度，可以用30lElutionBuffer，37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm室溫離心1分鐘。（2）55~80℃洗脫可提高回收率10~20個百分點。PCR篩選1、調整模板（pMal-ade重組質粒）濃度至5ng/μL。2、按下列體系配制反應混合液，混勻，TemplateDNA

1.0μL（20ng）10×buffer

2.0μLMgCl2（25mmol/L）

1.5μLPrimer1(10μmol/L)

0.5μLPrimer2(10μmol/L)

0.5μLdNTPs（2mmol/L）

2.0μLTaq酶（5U/μL）

0.5μL加ddH2O至

20μL外源基因的特異引物：引物1（5`--CCGGAATTCTTGAATAAAGAAGCGCTAGTC—3`）和引物2（5`--CGGGGATCCGTCGACTTATTGCAGTGATATGTGTTG—3`）。3．PCR反應循環(huán)條件設置94℃變性反應1min；55℃退火反應45s；72℃延伸反應1min。進行25個循環(huán)后，最后一個循環(huán)72℃延長至10min。迅速冷卻4℃。4、檢測加2μL溴酚藍和10μL反應產物，混勻，取15μL反應產物點樣電泳。5、成像分析在1%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳0.5~1h，電泳結束后EB染色15～20min，凝膠成像分析結果。

pMD18-TVectorpMD18-TVector是一種高效克隆PCR產物(TACloning)的專用載體。這種載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體（參見第12章基因工程的載體）的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoRV識別位點，用EcoRV進行酶切反應后，再在兩側的3'端添加"T"而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產物的3'末端添加一個"A"的特性，所以使用這種制品可以大大提高PCR產物的連接、克隆效率。EcoR

V←--T-cloningsitecDNA

文庫應用分離新基因的方法

發(fā)現并分離克隆新基因始終是分子生物學研究的主要任務和目的，雖然

cDNA

文庫的用途很多，但是，應用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的

cDNA

文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長

cDNA

文庫，即不管是經典的

cDNA

文庫方法或差減法構建的

cDNA

文庫，需要利用已經獲得的新

cDNA

序列片段，通過

RACE

方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長

cDNA

文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。

從非全長

cDNA

文庫中篩選新基因

3.1.1

RACE

法

RACE

文庫即快速擴增

cDNA

末端法(

Rapid

Amplification

of

cDNA

End，RACE

)只需知道

mRNA

內很短的一段序列即可擴增出其

cDNA

的5'(5'

RACE

)和3'端(3'

RACE

)。該法的主要特是利用一條根據已知序列設計的特異性引物和一條與

mRNA

的

PolyA

(3'

RACE

)或加至第一鏈

cDNA

3'端的同聚尾(5'

RACE

)互補的通用引物，由于同聚體并非良好的

PCR

引物，同時為了便于

RACE

產物的克隆，可向同聚體引物的5'端內加入一內切酶位點。所用的

cDNA

模板可以使用多聚

dT

引物延伸合成(3'，5'-RACE

均可)。當

RACE

PCR

產物為復雜的混合物時，可取部分產物作模板，用另一條位于原引物內側的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪

PCR

(巢式

PCR

)。早在1988年，FROHMAN

等即用此方法成功地獲得了4種

mRNA

的5'合3'末端序列。

用

PCR

法從

cDNA

文庫中快速克隆基因

通過對文庫的篩選或適用簡并引物進行

PCR

反應，常常只能獲得不完整的

cDNA

片段。為了得到

cDNA

全長，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大，RACE

雖然為此提供可方便，但應用該方法需重新提取

mRNA

和反轉錄。而用

PCR

法從

cDNA

文庫中快速克隆基因的方法，只需提取

λ

噬菌體

DNA，按保守序列設計

PCR

引物便可將未知片段進行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用

P