生物技術(shù)與食品安全和品質(zhì)控制

生物技術(shù)與食品安全和品質(zhì)控制第1頁/共134頁第一節(jié)生物傳感器及其在食品檢測(cè)分析中的應(yīng)用

由固定化的具有分子識(shí)別功能的生物材料、換能器和信號(hào)處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。（一）生物傳感器的基本組成和分類

1.生物傳感器的基本組成生物識(shí)別元件：生物傳感器中固定化的酶、微生物細(xì)胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識(shí)別能力的生物敏感材料。換能器：能將在生物敏感材料上進(jìn)行的生化反應(yīng)產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的裝置。信號(hào)處理裝置：負(fù)責(zé)信號(hào)的分析處理和放大輸出。一、生物傳感器的基本概念第2頁/共134頁2.生物傳感器的分類根據(jù)生物敏感材料可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器和DNA傳感器。根據(jù)換能器的不同，可分為電化學(xué)傳感器、介體生物傳感器、測(cè)光型生物傳感器、測(cè)熱型生物傳感器等。具體到某一種傳感器的命名，一般是采用“功能+結(jié)構(gòu)特征”的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纖傳感器等。

第3頁/共134頁（二）生物傳感器的工作原理

通過生物的分子識(shí)別作用，生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合，并進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號(hào)，信號(hào)的大小在一定條件下和樣品中被測(cè)物質(zhì)的量存在一定的關(guān)系，這些信號(hào)經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，電信號(hào)再經(jīng)信號(hào)分析處理系統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測(cè)物質(zhì)的量。第4頁/共134頁轉(zhuǎn)換器敏感元件待測(cè)物生物傳感器的模型第5頁/共134頁第6頁/共134頁

1.分子識(shí)別（molecularrecognition）生物傳感器中的分子識(shí)別:指生物敏感材料中生物分子能選擇性地和待測(cè)樣品中的待測(cè)成分進(jìn)行特異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。生物敏感材料包括酶、抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細(xì)胞和DNA等。酶的分子識(shí)別:指酶分子只能和特定的底物分子進(jìn)行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子的識(shí)別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了以酶為生物敏感材料的生物傳感器的分子識(shí)別能力。免疫傳感器的分子識(shí)別：由傳感器上的生物敏感材料－抗原或抗體物質(zhì)的分子識(shí)別能力決定，抗原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）結(jié)合。

DNA傳感器的分子識(shí)別：由DNA分子中堿基對(duì)的互補(bǔ)結(jié)合特性決定。第7頁/共134頁2.生化反應(yīng)中量的變化和信號(hào)的轉(zhuǎn)換（1）熱焓的變化及其轉(zhuǎn)換（2）光效應(yīng)及其轉(zhuǎn)換（3）顏色的變化及其轉(zhuǎn)化（4）阻抗的變化及其轉(zhuǎn)換（5）生化反應(yīng)中其他量的變化及其轉(zhuǎn)化（6）直接產(chǎn)生電信號(hào)

第8頁/共134頁將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)

酶?jìng)鞲衅鳛槔?酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置和固定化酶耦合,即組成酶?jìng)鞲衅?常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。第9頁/共134頁將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)

固定化的生物材料與相應(yīng)的被測(cè)物作用時(shí)常伴有熱的變化.例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。第10頁/共134頁將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)

過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測(cè)定裝置相連,即可測(cè)定過氧化氫含量。還有很多細(xì)菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生熒光.也可以用這種方法測(cè)定底物濃度。第11頁/共134頁上述三原理的生物傳感器共同點(diǎn)：都是將分子識(shí)別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行測(cè)量,這種方式統(tǒng)稱為間接測(cè)量方式.第12頁/共134頁直接產(chǎn)生電信號(hào)方式這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細(xì)胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生.根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。第13頁/共134頁3.生物放大（biologicalamplification）（1）酶催化放大酶是高效專一的催化劑，它可以在很短的時(shí)間內(nèi)催化大量底物的轉(zhuǎn)化，通過測(cè)定酶所催化反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量可以推測(cè)（判斷）反應(yīng)中比底物減少量或產(chǎn)物增加量少得多的酶量，或與酶相關(guān)聯(lián)的其他物質(zhì)的量，從而實(shí)現(xiàn)生物放大作用。應(yīng)用這一放大原理可以使檢測(cè)方法的靈敏度（最小檢出量）比常規(guī)檢測(cè)方法提高2個(gè)數(shù)量級(jí)。第14頁/共134頁

（2）底物循環(huán)放大被測(cè)物S1或S2，在酶E1和酶E2之間不斷循環(huán)，每循環(huán)一次，E1和E2都要分別消耗各自的底物C1和C2，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物P1和P2，而循環(huán)過程中被測(cè)物S1和S2的濃度保持不變，通過分析C1和C2的消耗量或P1和P2的增加量就可以測(cè)定待測(cè)物S1或S2的量，實(shí)現(xiàn)放大效應(yīng)。循環(huán)的次數(shù)越多酶消耗的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，放大效率也越高（圖）。

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（3）酶級(jí)聯(lián)放大生物體內(nèi)的有些酶（通常為酶原）本身是沒有活性，在輔酶、另外一種酶或酶的變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的作用下，酶E1i被激活為酶E1a，E1a激活E2i成E2a，E2a又激活E3i或E3a，由于酶是催化劑可以連續(xù)使用，這樣經(jīng)過一系列的反應(yīng)，一個(gè)分子的輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑就能夠產(chǎn)生成千上萬分子的E3a，然后E3a催化底物S3產(chǎn)生產(chǎn)物P3，通過測(cè)定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量就可以靈敏地測(cè)定輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的量（圖）。優(yōu)點(diǎn)：效率極高，對(duì)提高生物傳感器的靈敏度極為有效。缺點(diǎn)：在生物傳感器中的應(yīng)用條件較為苛刻。

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（4）脂質(zhì)體技術(shù)脂質(zhì)體：由類似于細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜構(gòu)成的微球體，在微球體的內(nèi)部包含有被酶、熒光素或電活性物質(zhì)標(biāo)記的抗原或抗體等標(biāo)志物，微球體的外膜上結(jié)合有抗原（抗體），當(dāng)外膜上的抗原（抗體）與待測(cè)的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，并和補(bǔ)體結(jié)合時(shí)（或在表面活性劑的作用下），微球體破裂，微球體內(nèi)的標(biāo)志物被釋放。標(biāo)志物的量大且容易測(cè)定，通過測(cè)定標(biāo)志物的釋放量就可以測(cè)定出待測(cè)抗體（抗原）的量，從而實(shí)現(xiàn)生物放大（圖）。缺點(diǎn)：目前還存在著微球體內(nèi)的標(biāo)志物容易滲漏和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差等不足之處。

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（四）生物傳感器的特點(diǎn)

(1)根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性,理論上可以制成測(cè)定所有生物物質(zhì)的傳感器,因而測(cè)定范圍廣泛。(2)一般不需進(jìn)行樣品的預(yù)處理,它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測(cè)組分的分離和檢測(cè)統(tǒng)一為一體，測(cè)定時(shí)一般不需另加其他試劑,使測(cè)定過程簡(jiǎn)便迅速,容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析。(3)體積小、響應(yīng)快、樣品用量少,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在位檢測(cè)。第18頁/共134頁(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反復(fù)多次使用(5)準(zhǔn)確度高,一般相對(duì)誤差可達(dá)到1%以內(nèi)(6)可進(jìn)行活體分析(7)傳感器連同測(cè)定儀的成本遠(yuǎn)低于大型的分析儀,因而便于推廣普及(8)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。第19頁/共134頁二、生物傳感器中生物敏感材料的固定化

和成膜技術(shù)（一）生物材料的固定化技術(shù)

指通過物理或化學(xué)的方法將酶、微生物細(xì)胞和抗原抗體等生物材料限制在一定的區(qū)間內(nèi)，使生物材料只能在特定的區(qū)間進(jìn)行生化反應(yīng)，而反應(yīng)的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散的技術(shù)。生物材料常用的固定化方法包括：夾心法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法和微膠囊法等（圖）。

第20頁/共134頁（二）成膜技術(shù)

1.半導(dǎo)體生物傳感器中的成膜技術(shù)（1）紫外線照射法（2）光平板印刷法（3）噴射法

2.L-B膜技術(shù)

第21頁/共134頁三、生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用

（一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析

1.農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測(cè)目前有機(jī)磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、乙基馬拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測(cè)都有相應(yīng)的研究報(bào)道。

1996年余孝穎等采用離子敏場(chǎng)效應(yīng)管為基礎(chǔ)傳感器（換能器），將乙酰膽堿酯酶通過戊二醛共價(jià)交聯(lián)固定于場(chǎng)效應(yīng)管上，制備得到了乙酰膽堿酯酶場(chǎng)效應(yīng)管傳感器，用于分析敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。

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原理：乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，當(dāng)存在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留時(shí)，它們能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，從而使底物的分解減少，膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，其中乙酸的減少量可以通過離子場(chǎng)效應(yīng)管來測(cè)定，且在一定條件下，乙酸的減少量和有機(jī)磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關(guān)系，因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計(jì)算出有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。

第23頁/共134頁第24頁/共134頁2.抗生素殘留的分析

青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘留會(huì)污染動(dòng)物性食品，從而對(duì)人類的健康造成危害。

Sternesioes等人采用免疫傳感器測(cè)定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達(dá)到1ng／g，傳感器表面經(jīng)NaOH和HCl處理后可以重復(fù)使用。

Avon等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度分析法檢測(cè)了牛奶中青霉素的含量。

第25頁/共134頁（二）食品添加劑的分析

亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，美國(guó)FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過1×10-6mol／L。

天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。

煙堿酸屬于B族維生素，可以作為肉類食品的發(fā)色劑，但是人體攝入過量的煙堿酸會(huì)引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，在日本已禁止使用。其他食品添加劑，如防腐劑苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、過氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸等都可以用相應(yīng)的生物傳感器來檢測(cè)它們?cè)谑称分械暮俊?/p>

第26頁/共134頁第27頁/共134頁（三）污染微生物的檢測(cè)

污染食品的微生物可以分為腐敗菌和病原菌。腐敗菌主要是通過對(duì)食品成分的分解和破壞，同時(shí)產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對(duì)人體造成危害。腐敗菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。食品中污染微生物的檢測(cè)方法通常是平板計(jì)數(shù)法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，特別是對(duì)于病原菌的檢測(cè)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)l-2周才能出結(jié)果，因此各種快速檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測(cè)方法就是其中的一種。

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1.腐敗菌的檢測(cè)釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見的食品腐敗菌。

2.病原菌的檢測(cè)常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間很長(zhǎng)，而采用生物傳感器則能迅速地測(cè)定它們的數(shù)量。用來測(cè)定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。目前，上述病原菌都可以用相應(yīng)的生物傳感器來測(cè)定。

第29頁/共134頁（四）生物毒素的檢測(cè)

污染食品的生物毒素主要包括細(xì)菌毒素、真菌毒素、藻類毒素以及動(dòng)植物毒素，其中以細(xì)菌毒素和真菌毒素最為常見。檢測(cè)毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液相色譜、薄層層析等）和生物學(xué)方法等，這些方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)樣品的前處理復(fù)雜繁瑣。以免疫學(xué)方法和生物傳感器檢測(cè)方法為代表的各種快速方法備受歡迎。

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1.細(xì)菌毒素的分析細(xì)菌毒素是由細(xì)菌分泌產(chǎn)生于細(xì)胞外或存在于細(xì)胞內(nèi)的致病性物質(zhì)，有內(nèi)毒素和外毒素之分。

內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一的脂多糖，熱穩(wěn)定，抗原性差，不能轉(zhuǎn)化為類毒素，毒性比較弱，毫克水平才能引起動(dòng)物死亡。外毒素：細(xì)菌（主要是革蘭氏陽性菌，也有少數(shù)革蘭氏陰性菌）分泌于胞外的一種蛋白質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，抗原性強(qiáng)，能轉(zhuǎn)化成類毒素，毒性很強(qiáng)，微克水平就能引起動(dòng)物死亡。目前研究報(bào)道主要集中在運(yùn)用免疫生物傳感器分析檢測(cè)肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細(xì)菌外毒素。運(yùn)用生物傳感器能靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)到它們?cè)诨鹜群湍逃偷仁称分械暮俊?/p>

第31頁/共134頁第32頁/共134頁2.真菌毒素的分析真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。常見的污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭霉素、雜色曲霉素、T-2毒素、腐馬素、鐮刀菌烯醇類毒素、展青霉素和橘霉素等。檢測(cè)食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等。近二十多年來免疫學(xué)方法在真菌毒素的檢測(cè)中得到了較好的應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器快速檢測(cè)真菌毒素的方法也有研究報(bào)道和應(yīng)用，其中以免疫傳感器用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1和腐馬素B1的研究報(bào)道最多。此外，也有運(yùn)用微生物傳感器和以纖毛蟲為生物敏感材料的傳感器檢測(cè)展青霉素、黃曲霉毒素B1和T-2毒素的研究報(bào)道。

3.其他生物毒素的檢測(cè)也有用于檢測(cè)食品中污染的動(dòng)植物毒素。

第33頁/共134頁（五）食品新鮮度的分析

1.魚鮮度傳感器魚死亡后，魚肉中ATP（三磷酸腺苷）在ATP酶的作用下分解成ADP（二磷酸腺苷），ADP在磷酸激酶的作用下分解產(chǎn)生AMP（一磷酸腺苷），AMP在AMP脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為IMP（肌苷酸），IMP在5’-核苷酸酶的作用下分解成HxR（肌苷），HxR在核苷磷酸化酶的作用下分解成Hx（次黃嘌呤），Hx在黃嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→尿酸

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根據(jù)魚死亡后，魚肉中ATP分解代謝后各種代謝產(chǎn)物之間的比例關(guān)系，即K值或K1值也能很好地評(píng)判魚的新鮮度。

K值：指上述ATP代謝產(chǎn)物中，肌苷和次黃嘌呤占ATP代謝產(chǎn)物總量的百分?jǐn)?shù)。即：K（%）=[（HxR+Hx）／（ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx）]×100

魚死亡后ATP、ADP和AMP的代謝非?？?，一般在很短的時(shí)間（24h）內(nèi)，它們?cè)隰~肉中的含量就幾乎為零，而一般在市場(chǎng)上出售的魚都是死亡24h以后的魚，K值可簡(jiǎn)化為K1值。即：

K1（%）=[（HxR+Hx）／（IMP+HxR+Hx）]×100第35頁/共134頁

目前日本等國(guó)已制訂了根據(jù)K值或Kl值判斷魚新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)，也成功研制了測(cè)定K值或K1值的各種生物傳感器。按照日本的標(biāo)準(zhǔn)，K1＜0.2時(shí)，魚的品質(zhì)極好，Kl=0.2-0.4時(shí)，魚品質(zhì)較好。（1）多電極傳感器系統(tǒng)。主要由四根氧電極組成，其中一根作為參照，另外三根電極的表面分別固定有黃嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，5’-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，測(cè)定時(shí)將四根電極同時(shí)放入樣品液中，上述三根酶電極產(chǎn)生的電信號(hào)分別反應(yīng)了樣品液中Hx的濃度，（HxR+Hx）的濃度和（IMP+HxR+Hx）的濃度，通過計(jì)算機(jī)處理很容易計(jì)算出K1的大小。運(yùn)用該傳感器，只需20-50μL樣品液，8min就可以測(cè)定K1值。

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（2）多酶電極傳感器系統(tǒng)。首先將5’-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶固定在一氧電極上，形成多酶電極。測(cè)試時(shí)，樣品液先經(jīng)過一離子交換柱，使IMP、HxR和Hx分開，然后分別流經(jīng)有多酶電極的測(cè)試室，根據(jù)樣品中不同組分流經(jīng)測(cè)試室時(shí)電信號(hào)的響應(yīng)情況，運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析計(jì)算出K1值。除了測(cè)定K1值，也有通過生物傳感器測(cè)定魚肉中胺類物質(zhì)的變化來反應(yīng)魚新鮮度的研究報(bào)道。另外，采用微生物傳感器測(cè)定魚鮮度的研究也有報(bào)道。

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2.肉鮮度傳感器和魚肉一樣，其他肉類也可以通過生物傳感器來測(cè)定其鮮度。Kurube等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了測(cè)定豬肉鮮度的酶?jìng)鞲衅?，該傳感器的響?yīng)時(shí)間為4min,檢測(cè)的線性范圍為5×10-6-10×10-6mo1／L。Kress等人研制開發(fā)出一種測(cè)定肉鮮度的匕首式生物傳感器，測(cè)定時(shí)將傳感器的探頭插入肉表面2-4cm深度，通過測(cè)定葡萄糖的濃度來評(píng)價(jià)肉的鮮度。

3.牛乳鮮度傳感器主要通過測(cè)定牛乳中的微生物數(shù)量，牛乳的乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來評(píng)價(jià)牛乳的鮮度。

第38頁/共134頁第39頁/共134頁第二節(jié)免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測(cè)

（一）抗原（antigen）指進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)能刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞，并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。

1.抗原的分類和基本屬性

半抗原（hapten）:不能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，只能和對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，即只有免疫反應(yīng)性，無免疫原性的抗原。一、抗原與抗體第40頁/共134頁

完全抗原（completeantigen）：既具有免疫原性又具有免疫反應(yīng)性的抗原。超級(jí)抗原（superantigen）：有些物質(zhì)，例如某些細(xì)菌毒素，具有非常強(qiáng)的免疫刺激能力，通?？蛇_(dá)到一般抗原刺激能力的2000倍，只需極低的濃度就可以誘發(fā)極大的免疫反應(yīng)。

免疫原性（immunogenicity）:指抗原進(jìn)入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞的特性。

免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）:指抗原能和對(duì)應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。第41頁/共134頁

2.抗原決定簇（antigenicdeterminant）或稱為抗原表位，是位于抗原物質(zhì)分子表面或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團(tuán)，能與免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞上的受體及相應(yīng)的抗體分子結(jié)合，是免疫原引起機(jī)體特異性免疫應(yīng)答和免疫原與抗體特異性反應(yīng)的基本構(gòu)成單位。在蛋白質(zhì)抗原中，3-8個(gè)氨基酸殘基可以構(gòu)成一個(gè)抗原決定簇，在多糖抗原中3-6個(gè)呋喃環(huán)可以組成一個(gè)抗原決定簇。從結(jié)構(gòu)上抗原決定簇可以分成順序決定簇和構(gòu)象決定簇。第42頁/共134頁

順序決定簇（sequentialdeterminant）：又稱為連續(xù)決定簇，氨基酸的排列順序決定著這類決定簇的功能基團(tuán)。構(gòu)象決定簇（conformationaldeterminant）：又稱為不連續(xù)決定簇，是依賴于蛋白質(zhì)天然空間構(gòu)象的決定簇，這類決定簇通常由不連續(xù)的氨基酸順序片段經(jīng)肽鏈的折疊卷曲而成，一般位于蛋白質(zhì)的表面。研究抗原的決定簇不僅可以揭示抗原與抗體結(jié)合的本質(zhì)，有助于更好地了解免疫學(xué)中的核心問題－免疫識(shí)別和應(yīng)答的機(jī)制，而且可以人工合成某些抗原決定簇，這對(duì)于研制疫苗和特異性診斷試劑，以及藥物合成和抗病毒感染等方面都有很大的益處。

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3.抗原的分類根據(jù)來源抗原可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原等三類。

天然抗原：是天然的生物、細(xì)胞及天然產(chǎn)物，主要來自動(dòng)物、植物和微生物，例如血細(xì)胞、細(xì)菌和病毒、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等都可以是天然抗原。

人工抗原：指人工化學(xué)改造后的抗原，例如半抗原經(jīng)化學(xué)改造后就是人工抗原。

合成抗原：指化學(xué)合成的具有抗原性質(zhì)的分子，主要是氨基酸的聚合物。

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4.抗原的制備

（1）抗原的準(zhǔn)備。對(duì)微生物細(xì)胞等顆粒狀抗原，只需對(duì)微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后收集菌體即可。對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、DNA和脂類等可溶性膠體抗原，應(yīng)根據(jù)其在生物細(xì)胞中的部位進(jìn)行處理。存在于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)首先應(yīng)破細(xì)胞壁，使它們釋放出來，然后收集含有這些物質(zhì)的溶液，再采用各種分離、提取和純化方法進(jìn)行分離和提取。對(duì)于分泌于細(xì)胞外的這些高分子物質(zhì)則只需收集胞外液，然后再進(jìn)行分離純化即可。

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（2）半抗原的改造。通常是將牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OV）或人工合成的多聚氨基酸等連接在半抗原分子上，增加其相對(duì)分子質(zhì)量，從而使其轉(zhuǎn)化成完全抗原（例子見書）。將各種半抗原轉(zhuǎn)化成完全抗原的具體操作方式和注意事項(xiàng)各不相同，但是有一點(diǎn)必須注意，即在操作過程中應(yīng)盡可能保持半抗原結(jié)構(gòu)的“完整性”，不能過度破壞其結(jié)構(gòu)，以保持半抗原的“原始性”。

第46頁/共134頁（二）抗體（amtibody,Ab）

1.抗體的定義、分布和分類由抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）?？贵w主要存在于動(dòng)物血清中，也存在于動(dòng)物的其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細(xì)胞分泌液中。另外，抗體還存在于某些細(xì)胞中。根據(jù)Ig的理化特性和與抗原結(jié)合方式的不同，Ig可以分為類和亞類。

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2.抗體的結(jié)構(gòu)一個(gè)抗體分子通常包括兩個(gè)完全相同的輕鏈分子（1ightchain）和兩個(gè)完全相同的重鏈（heavychain）分子，輕鏈分子大約由210個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.3×104；重鏈分子大約由450個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為5.0×104。這4條鏈在氫鍵和二硫鍵（S-S）作用下連在一起，形成“Y”字形結(jié)構(gòu)。在“Y”字形的兩個(gè)支角上，重鏈和輕鏈的N端區(qū)域在一起形成抗原的識(shí)別位點(diǎn)。有一段大約110個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域隨抗體結(jié)合特異性的不同而變化，這端區(qū)域叫可變區(qū)。除可變區(qū)外，抗體分子上還有恒定區(qū)。第48頁/共134頁第49頁/共134頁

3.抗體的制備（1）多克隆抗體的制備以抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以獲得含有特異性抗體的血清，即抗血清。抗血清中的抗體是由不同的抗原決定簇刺激不同的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，這種抗體又稱為多克隆抗體。制備多克隆抗體包括：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇。用于制備多克隆抗體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括哺乳類的鼠、兔、羊、馬、驢、豚、鼠、豬、猴、狗和禽類的雞、鴨、鴿子，以及兩棲類的蛙等，其中最為常用的是鼠、兔和羊等。第50頁/共134頁

在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)首先應(yīng)考慮抗原的來源和免疫動(dòng)物的親緣關(guān)系。一般來說，兩者的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高，相反則抗體的效價(jià)越差。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡和營(yíng)養(yǎng)狀況與抗體的產(chǎn)生也有密切的關(guān)系，年齡太小易產(chǎn)生免疫耐受；而年齡過大或營(yíng)養(yǎng)不良則動(dòng)物的免疫能力低下，也不易產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。選擇好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，在注射抗原前應(yīng)采集少量的動(dòng)物血清（陰性血清）和抗原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，選擇不和抗原反應(yīng)的動(dòng)物進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。第51頁/共134頁

抗原的處理。除了前面敘述的抗原的分離提純和半抗原的改造外，對(duì)于可溶性抗原，在注射免疫動(dòng)物之前通常還需和免疫佐劑進(jìn)行混合（顆?？乖话銦o需和佐劑混合，可以直接注射），以提高抗原的免疫原性等。佐劑（adjuvant）：是具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)的半衰期，降低抗原毒副作用，以使機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗血清的物質(zhì)。最常用的佐劑是福氏佐劑，它分為完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑。

不完全福氏佐劑：由1-6份的液體石蠟和1份羊毛脂充分混合而成。

完全福氏佐劑：在不完全福氏佐劑的基礎(chǔ)上，于使用前添加滅活的（2-20mg／mL）卡介苗混合而成。第52頁/共134頁

動(dòng)物的免疫。動(dòng)物的免疫是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，在免疫過程中，對(duì)抗原的免疫劑量、注射途徑、加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔和加強(qiáng)免疫的次數(shù)等都需要認(rèn)真綜合考慮。

抗原的劑量應(yīng)根據(jù)抗原的免疫原性強(qiáng)弱、動(dòng)物的種類和大小以及抗原的注射途徑等來決定。對(duì)于同一種抗原，在一定的劑量范圍內(nèi)，抗原的注射量與免疫反應(yīng)的強(qiáng)度成正相關(guān)，抗原量過大或過小都易產(chǎn)生免疫耐受。免疫動(dòng)物越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液量為1-2mL，家兔的為2-4mL。第53頁/共134頁

常用的抗原注射途徑包括靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下和皮內(nèi)等，它們對(duì)抗原的收速度為靜脈＞脾臟＞淋巴結(jié)＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)。

腹腔注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和淋巴結(jié)注射適合于任何抗原，這些途徑主要是通過刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和加強(qiáng)免疫都可以使用。靜脈注射只適合于可溶性抗原和分散的單細(xì)胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。脾臟注射比較適合于微量抗原。

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抗血清的采集、純化和特性鑒定?？贵w的分離純化方法很多，包括中性鹽沉淀法、凝膠柱層析、離子交換柱層析和親和層析等。對(duì)收獲后的抗血清或純化后抗體的一些參數(shù)，例如效價(jià)、親和力和交叉反應(yīng)等進(jìn)行分析非常必要。效價(jià)又稱為滴度（titer）：在一定條件下，抗血清經(jīng)系列稀釋后與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測(cè)出抗血清存在的抗血清的最大稀釋倍數(shù)，是表達(dá)抗血清中特異性抗體相對(duì)含量的一個(gè)指標(biāo)。第55頁/共134頁

親和力（affinity）：表示抗原抗體結(jié)合程度的指標(biāo)，親和力的大小可以用抗原抗體反應(yīng)的平衡常數(shù)K來表示。抗血清的交叉反應(yīng)：衡量抗體特性的另一個(gè)重要的指標(biāo)。理論上講，抗體只能與產(chǎn)生該抗體的抗原發(fā)生反應(yīng)，這是抗體特異性的表現(xiàn)，但實(shí)際上抗體還可以和其他抗原發(fā)生反應(yīng)，即所謂的交叉反應(yīng)。一方面是由于抗原的不純?cè)斐?，另一方面不同抗原間相同或類似的抗原決定簇也是產(chǎn)生交叉反應(yīng)的原因。完全沒有交叉反應(yīng)的抗體是不存在的，但是交叉反應(yīng)太強(qiáng)的抗體沒有應(yīng)用價(jià)值。

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（2）單克隆抗體（monoclonalantibody）的制備

制備原理：免疫致敏后的B淋巴細(xì)胞具有分泌特異性抗體的能力，但是在體外不能長(zhǎng)期存活；而骨髓瘤細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期存活但不能產(chǎn)生抗體；如將兩種細(xì)胞雜交融合后，經(jīng)分離篩選獲得既能在體外長(zhǎng)期存活又能針對(duì)單一抗原決定簇產(chǎn)生特異性抗體的融合子，就可以獲得單克隆抗體。單克隆抗體是通過B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜交獲得，單克隆抗體制備技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。

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（3）生物工程抗體（biologicalengineeringantibody）

應(yīng)用生物工程技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行定向改造獲得的抗體。

抗體的化學(xué)修飾：運(yùn)用雙功能交聯(lián)劑將同位素、酶、毒素和藥物等連接在抗體的Fc片段上，抗體和抗原的特異性結(jié)合發(fā)生在抗體的Fab片段上，交聯(lián)后并不影響抗體與抗原的結(jié)合，交聯(lián)（標(biāo)記）后的抗體可以作為診斷試劑，也可以作為藥物的定向載體，引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位，使藥物或毒素發(fā)揮更有效的作用，即所謂的“生物導(dǎo)彈”。這樣可以大大減少藥物和毒素等在腫瘤等治療過程中的毒副作用，提高治療效果。

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抗體基因文庫(kù)（antibodyrecombinationlibrary）：將不同重鏈和輕鏈的基因隨機(jī)組合，克隆到適合的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞中表達(dá)不同的抗體，從而形成一個(gè)抗體文庫(kù)，運(yùn)用抗原可以從中篩選到相應(yīng)的抗體基因。抗體基因的改造（antibodygenemodification）：將不同來源的抗體基因進(jìn)行重組，可以獲得所需要的抗體。

催化性抗體或抗體酶：具有催化活性的抗體?？贵w酶和酶一樣具有底物和立體專一性，在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和競(jìng)爭(zhēng)抑制等方面也和酶相似。第59頁/共134頁二、常用的免疫學(xué)方法（一）免疫學(xué)方法的分類

抗原抗體的特異性結(jié)合可以發(fā)生在生物體內(nèi)也可以發(fā)生在體外，用于食品衛(wèi)生和安全檢測(cè)的免疫學(xué)方法都是抗原抗體的體外反應(yīng)，通常都需要使用含有特異性抗體的血清，這些方法又稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)方法。根據(jù)給出的檢測(cè)結(jié)果是定性的還是定量的，免疫學(xué)方法（血清學(xué)方法）可以分為定性免疫學(xué)方法和定量免疫學(xué)方法。第60頁/共134頁

定性免疫學(xué)方法：能給出分析樣品中是否含有某種特定的抗原或抗體，或者特定抗原或抗體的含量是否高于或低于某一數(shù)值。

定量免疫學(xué)方法：能給出樣品中特定的抗原或抗體的準(zhǔn)確數(shù)量。根據(jù)免疫分析過程中是否需要將結(jié)合在一起的抗原抗體復(fù)合物和沒有結(jié)合的游離的抗原抗體分離開來，免疫學(xué)方法可以分為均相免疫學(xué)方法和非均相免疫學(xué)方法。

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均相免疫學(xué)方法：無須將抗原抗體的復(fù)合物和游離的抗原抗體分開，一般在較短的時(shí)間內(nèi)就可以得到分析結(jié)果，操作比較簡(jiǎn)便，但是通常靈敏度較低，一般僅適合于定性分析。

非均相免疫學(xué)方法：需要將抗原抗體復(fù)合物和游離的抗原抗體等物質(zhì)分開，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較復(fù)雜，但是在去除游離抗原抗體的同時(shí)也去除了分析樣品中的一些雜質(zhì)，減少了樣品雜質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的干擾，因此靈敏度和特異性都比較高，適合于定量分析。根據(jù)免疫反應(yīng)過程中的現(xiàn)象和特征等，免疫學(xué)方法又包括凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)等。第62頁/共134頁

凝集反應(yīng)：顆粒抗原（例如細(xì)菌、血紅細(xì)胞等）或可溶性抗原（抗體）結(jié)合于不溶性的載體微粒上后與相應(yīng)的抗體（抗原）在適當(dāng)?shù)臈l件下，經(jīng)一定時(shí)間后凝集成肉眼可見的凝聚物。

沉淀反應(yīng)：可溶性抗原（例如蛋白質(zhì)、多糖、類脂或它們的復(fù)合物）與相應(yīng)抗體在適量的電解質(zhì)存在的條件下發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物并出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，這種可見的沉淀只有在抗原抗體比例適合時(shí)才能形成，在固體（或半固體）載體中這種沉淀表現(xiàn)為沉淀線，在液體中則常表現(xiàn)為絮狀沉淀。第63頁/共134頁第64頁/共134頁

標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)：指抗原（抗體）被酶、同位素和熒光素等標(biāo)記（連接）后與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，通過測(cè)定酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物量、同位素的放射性強(qiáng)度或熒光素產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來計(jì)算抗原抗體的結(jié)合量，進(jìn)而計(jì)算出待檢測(cè)物質(zhì)（抗原或抗體）量的方法。根據(jù)標(biāo)記物的不同，標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)可以分為酶免疫分析（enzymeimmunoassay）、放射免疫分析（radioimmunoassay）和熒光免疫分析（fluorescentimmunoassay）。第65頁/共134頁（二）酶免疫分析方法（enzymeimmunoassay）

與熒光免疫方法和放射免疫方法（RIA）相比，酶免疫方法（EIA）有很多優(yōu)點(diǎn)。目前，前面兩種方法正逐步被酶免疫方法所取代。

1.靈敏度

EIA的靈敏度比RIA的更高，用于EIA的酶的檢測(cè)限值可以達(dá)到0.002×10－18～1×10－18mol/100min,個(gè)別報(bào)道甚至可以檢測(cè)出一個(gè)酶分子；125I及其標(biāo)志物最低檢測(cè)限值為5×10－18～10×10－18mol/100min。

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2.對(duì)人的危害

EIA中酶標(biāo)物對(duì)人體和環(huán)境均無害，使用不受限制；RIA使用的放射性標(biāo)志物對(duì)人和環(huán)境均可能造成危害，使用將可能受到越來越嚴(yán)格的限制。

3.檢測(cè)儀器

EIA簡(jiǎn)便，可自動(dòng)化也可以半自動(dòng)化，甚至憑肉眼也可以判讀結(jié)果；RIA檢測(cè)儀器價(jià)格較貴，難以自動(dòng)化，肉眼一般不能判斷結(jié)果。

4.試劑的穩(wěn)定性在合適的保存溫度和介質(zhì)中，酶標(biāo)試劑即使在稀釋的溶液中也可以保存一年至數(shù)年之久；放射性標(biāo)志物由于受到放射性元素半衰期的限制一般保質(zhì)期較短。

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5.多樣性

EIA可以用于制備標(biāo)志物的酶種類很多，酶標(biāo)物的種類多。另外，一種酶標(biāo)物由底物的不同又可以產(chǎn)生多種檢測(cè)信號(hào)；RIA可用于制備標(biāo)志物的放射性元素較少，最常用僅有125I。

6.反應(yīng)體系要求酶標(biāo)物反應(yīng)時(shí)對(duì)pH值、溫度等要求較嚴(yán)格。另外，酶標(biāo)物需要和底物反應(yīng)一段時(shí)間后才能判讀結(jié)果；放射性標(biāo)志物對(duì)反應(yīng)體系的要求不高，可以即時(shí)判讀結(jié)果。

三種方法最本質(zhì)的區(qū)別是標(biāo)記物的不同，熒光免疫分析以熒光素為標(biāo)記物，放射免疫分析以同位素為標(biāo)記物，酶免疫分析以酶為標(biāo)記物。由于標(biāo)記物的不同，具體的分析操作過程也有許多不同。

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三種方法的基本的原理相同，都是以標(biāo)記物（熒光素、同位素或酶）標(biāo)記抗原或抗體，之后和相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，形成帶有標(biāo)記物的抗原抗體復(fù)合物，測(cè)定復(fù)合物中標(biāo)記物產(chǎn)生的各種信號(hào)，即熒光的強(qiáng)度、放射性強(qiáng)度或酶催化底物產(chǎn)生的產(chǎn)物量，在一定的范圍內(nèi)信號(hào)的強(qiáng)弱反映了抗原抗體復(fù)合物的量，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱可以計(jì)算出和標(biāo)記抗原抗體結(jié)合的待測(cè)物（抗體或抗原）的量。酶免疫方法至少包括酶標(biāo)記免疫方法、非標(biāo)記酶免疫方法和酶免疫電鏡方法。酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）是目前應(yīng)用得最為普遍的一種酶免疫方法。

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2.酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）（1）原理以96孔、48孔或40孔的聚丙乙烯塑料微孔板（酶標(biāo)板）為載體，在適當(dāng)?shù)臈l件下使抗原或抗體上包被（吸附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上成為包被（固相）抗原或抗體，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去。然后直接加入酶標(biāo)記抗體或抗原形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定在微孔或試管，沒有吸附的酶標(biāo)記物洗滌去除。加入酶底物溶液（通常沒有顏色）于微孔中，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的產(chǎn)物。在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量（也反應(yīng)了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。

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（2）分類直接法（directELISA）:指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原的量（圖）。間接法（indirectELISA）:將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（圖）。第71頁/共134頁第72頁/共134頁

夾心法（sandwichELISA）:先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與之反應(yīng)形成抗體－抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以像間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體－抗原－抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗體－抗原－抗體－酶標(biāo)二抗復(fù)合物（圖），前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。

競(jìng)爭(zhēng)法：在抗原抗體反應(yīng)過程中有競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象的存在。例子：直接法中的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法（見書）。

第73頁/共134頁第74頁/共134頁第75頁/共134頁第76頁/共134頁第77頁/共134頁

（3）ELISA的操作過程試劑的準(zhǔn)備：主要試劑有抗原抗體、酶標(biāo)抗原或抗體、酶和底物等。酶標(biāo)抗原或抗體是ELISA的核心試劑，這些試劑可以自己制備也有現(xiàn)成的試劑（例如酶標(biāo)二抗），可以購(gòu)買。在自己制備酶標(biāo)物時(shí)，除了應(yīng)準(zhǔn)備好純化的抗原和抗體外，還應(yīng)準(zhǔn)備好純化的酶，酶可以自己從動(dòng)植組織或微生物中提取，但過程復(fù)雜，而且純度和活性通常很難保證，最好從試劑公司購(gòu)買。第78頁/共134頁

酶和抗原或抗體連接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括：以戊二醛為交聯(lián)劑的戊二醛法和以過碘酸鹽為氧化劑的過碘酸氧化法等。

ELISA中常用的酶包括辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β-D-半乳糖苷酶（BG）、脲酶（urease）等，其中HRP和AP應(yīng)用最多。HRP的底物很多，在ELISA中常用是鄰苯二胺與雙氧水和5-氨基水楊酸與雙氧水等。AP常用的底物是對(duì)位硝基酚磷酸酯和酚酞單磷酸酯等。

第79頁/共134頁ELISA的操作過程：間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定黃曲霉毒素B1（AFB1）。

抗原的包被（antigencoating）。將AFB1與牛血清蛋白（BSA）的連接物AFB1-BSA（也可以是卵清白蛋白的連接物AFBl-OV）溶解于0.1mol／LpH9.5碳酸鹽緩沖液中，將溶液加入酶標(biāo)板的微孔內(nèi)，通常每孔加200μL，4℃放置過夜，取出恢復(fù)至室溫，傾去微孔內(nèi)溶液（包被液），以含有0.05%的Tween-20的pH7.0的0.05mol／L的磷酸鹽緩沖溶液生理鹽水（PBST）滿孔洗滌三次，每次5min，扣干，即得到包被有AFB1-BSA的酶標(biāo)板。在這個(gè)過程中AFB1-BSA通過物理吸附包被（黏附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上，沒有包被的抗原洗滌去除。

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封阻（blocking）。指酶標(biāo)板被抗原包被后，在微孔中加入一定濃度BSA、OV、明膠或脫脂牛奶等溶液以封阻微孔內(nèi)沒有被抗原包被的空隙，避免抗體的非特異性吸附于這些空隙，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠度的過程。常用的封阻劑包括BSA、OV、明膠和脫脂牛奶等，其中以脫脂牛奶較為便宜，而且封阻效果和其他幾種封阻劑沒有明顯的差別（圖）。

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抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（competitivereactionofantigenandantibody）。在酶標(biāo)板的每個(gè)微孔中加入一定量（例如90μL）的適當(dāng)稀釋度的抗體（抗血清），同時(shí)分別加入一定量（例如10μL）的不同稀釋倍數(shù)的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，或待測(cè)樣品的抽提液（不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線），混勻，37℃保溫保濕1-2h，包被在酶標(biāo)板上的固定抗原（AFBl-BSA）和添加的AFBl或樣品抽提液中的AFBl等游離抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，HBST洗滌扣干三次，游離的抗原抗體復(fù)合物被洗滌去除。

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酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)（reaction0fsecondantibodvlabeledenzymeandantigen-antibodycomplex）。將一定量（例如100μL）適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗溶液加入各反應(yīng)孔，37℃保溫保濕1-2h，酶標(biāo)二抗和抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物固定在酶標(biāo)板上，PBST洗滌扣干五次，將游離多余的酶標(biāo)二抗去除。

底物顯色反應(yīng)和吸光值的測(cè)定（colorreactionsubstrateofODdetection）。每孔加反應(yīng)底物100μL（40mg鄰苯二胺溶于l00mLpH5.0的0.2mol/L檸檬酸－0.1mo1／L磷酸氫鈉緩沖溶液，加入150μLH2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用），37℃保溫保濕，避光反應(yīng)30min，每孔加50μLmol／LH2SO4終止反應(yīng)。5min后，以酶聯(lián)免疫測(cè)定儀于490nm測(cè)吸光值。第83頁/共134頁

ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線（competitiveinhibitorycurveofELISA）。以AFBl標(biāo)準(zhǔn)物溶液中的AFBl的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以不同AFB1濃度所對(duì)應(yīng)的吸光值和AFBl濃度為零時(shí)吸光值的比值的百分?jǐn)?shù)（稱為競(jìng)爭(zhēng)抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)樣品抽提液的吸光值，利用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算出樣品中AFBl的含量。

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（4）ELISA的進(jìn)展在靈敏度方面，ELISA（包括其他酶免疫方法）的靈敏度依賴于免疫反應(yīng)試劑（主要是抗體）的特異性（specificity）與親和力（affinity）、酶結(jié)合物的比活度（在酶活性一定的情況下主要是酶的結(jié)合量）和酶反應(yīng)產(chǎn)物的可檢測(cè)極限三方面的因素。近幾年來，圍繞后兩個(gè)因素開展了大量的研究，各種放大系統(tǒng)被引入ELISA中，大大提高了ELISA的靈敏度，拓寬了其檢測(cè)范圍，而且放大系統(tǒng)的引入并沒有增加ELISA的操作難度，只是在常規(guī)ELISA的基礎(chǔ)上做了一些增添和改進(jìn)，目前這些方法正逐漸成為ELISA的主流方法，代表著ELISA的發(fā)展方向。

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生物素－親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem,BAS）通過提高酶結(jié)合物的比活度，即酶的結(jié)合量來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，從而提高ELISA靈敏度。親和素（avidin）是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對(duì)生物素（biotin，是復(fù)合維生素B系統(tǒng)中的一小分子的水溶性因子）有很高的親和力，每個(gè)親和素分子可以和四個(gè)生物素分子結(jié)合，而生物素非常容易和抗體或酶等蛋白質(zhì)結(jié)合，一個(gè)分子的抗體或酶的蛋白質(zhì)可以和多個(gè)生物素分子結(jié)合，并且生物素和蛋白質(zhì)結(jié)合后并不影響它和親和素的親和力。這樣過BAS可以將大量的酶標(biāo)記物結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上,從而增加檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，提高靈敏度。目前BAS在ELISA中得到了廣泛的應(yīng)用。第86頁/共134頁

由于親和素是pI值較高的糖蛋白，對(duì)以聚苯乙烯為材料的酶標(biāo)板等有較高的非特異性吸附，因此在BAS的ELISA中容易出現(xiàn)一些假陽性。最近一種由阿維丁鏈霉菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有和親和素相似的性質(zhì)，被稱為鏈親和素（streptavidin），它的pI僅為6.0，其非特異性吸附遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于親和素，近年來日益受到重視，有取代親和素之勢(shì)。第87頁/共134頁

熒光酶免疫分析（fluorescenceenzymeimmunoassay）將熒光底物取代ELISA中的普通底物，熒光底物在酶的催化下產(chǎn)生熒光，通過測(cè)定熒光的強(qiáng)度來測(cè)定抗原抗體的反應(yīng)，這樣可以大大地提高ELISA的靈敏度。。目前ELISA中常用的三種酶，辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）和β-D-半乳糖苷酶（BG）都有相應(yīng)的熒光底物，測(cè)定熒光強(qiáng)度的儀器也得到了很大的改進(jìn)，熒光酶免疫技術(shù)正越來越被廣泛地采用。

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化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminessenceenzymeimmunoassay）和熒光酶免疫分析一樣，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析也是通過提高酶反應(yīng)產(chǎn)物的可檢測(cè)極限來提高ELISA靈敏度的一種方法。本方法將化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)引入酶免疫分析中，通過測(cè)定光強(qiáng)來分析抗原抗體的反應(yīng)。和一般的酶免疫方法（ELISA）相比，測(cè)定光強(qiáng)可以提高靈敏度。除了上述幾種提高ELISA靈敏度的方法外，通過酶級(jí)聯(lián)放大和酶抗酶抗體復(fù)合物系統(tǒng)也可以提高ELISA的靈敏度。

第89頁/共134頁（五）其他免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法由于具有特異、靈敏和快速等特點(diǎn)而愈來愈受到重視，目前主要是從提高檢測(cè)方法的靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間和實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的自動(dòng)化等幾個(gè)方面來改良和開發(fā)免疫學(xué)方法。最近幾年Biocontrol公司和Neogen公司相繼先后推出了沙門氏菌（Salmonellaspp.）、李斯特菌（Listeriaspp.）、大腸桿菌O157：H7（EscherichiacoliO157：H7）、彎曲桿菌（Campylobacterspp.）的快速免疫檢測(cè)試劑條（teststrip）；Charm公司等推出了快速檢測(cè)黃曲霉毒素的試劑條。這些檢測(cè)產(chǎn)品的推出大大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。

第90頁/共134頁第91頁/共134頁

檢測(cè)試劑條雖然形狀各異，但是它們的基本組成和檢測(cè)原理是相同的。它們通常以長(zhǎng)條狀的硝酸纖維素膜為支撐物，被膠體金標(biāo)志的抗體吸附（黏附）于膜的一端，其前方有一樣品孔（槽），在膜的另一端分別有一條對(duì)照帶和反應(yīng)帶（在沒有反應(yīng)前這兩條帶通常是看不見的）（圖）。使用時(shí)，將一定量（通常100μL左右）的樣品提取液或微生物的富集液加入樣品槽中和膠體金標(biāo)志的抗體反應(yīng)，并沿纖維素膜向另一端移動(dòng)擴(kuò)散，與反應(yīng)帶和對(duì)照帶反應(yīng)顯色，比較反應(yīng)帶和對(duì)照帶的顏色深淺就可以判斷出食品樣品中是否含有某種有害物質(zhì)（微生物）或其含量是否超標(biāo)。

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在快速檢測(cè)方面，Clover公司推出了快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的乳膠檢測(cè)試劑，2min就可以得出結(jié)果。在免疫檢測(cè)方法的自動(dòng)化方面，近些年來出現(xiàn)了很多自動(dòng)化的免疫分析儀器，例如BioMerieux公司推出的VIDAS自動(dòng)化免疫檢測(cè)儀。

工作原理:將熒光酶聯(lián)免疫分析所需的所有試劑預(yù)先分裝在同一試劑條的不同孔內(nèi)，然后由儀器自動(dòng)完成整個(gè)分析檢測(cè)的全過程，加入樣品后，無需再進(jìn)行人工操作，60min左右就可以給出結(jié)果。將抗原抗體的特異性反應(yīng)特性和相應(yīng)的儀器相結(jié)合實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化也是免疫學(xué)方法發(fā)展的趨勢(shì)。

第93頁/共134頁第94頁/共134頁三、免疫技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

（一）免疫技術(shù)在食品污染細(xì)菌及其毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用

很早以前，免疫學(xué)技術(shù)在細(xì)菌的病原性和血清型檢測(cè)與鑒定方面就得到了廣泛的應(yīng)用。在食品安全方面，常見的污染食品病原細(xì)菌，例如，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等，都可以通過免疫學(xué)方法進(jìn)行分析和檢測(cè)。第95頁/共134頁

病原微生物產(chǎn)生分泌于食品中的毒素，例如，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素、肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒毒素、大腸桿菌腸毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素等，也可以用免疫學(xué)方法來檢測(cè)和分析。檢測(cè)上述病原菌及其毒素的免疫學(xué)方法包括免疫沉淀法、免疫絮凝法、放射免疫分析方法和酶免疫分析方法等各種免疫學(xué)方法。

第96頁/共134頁（二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析

食品中污染真菌的免疫學(xué)分析方法的研究開始于20世紀(jì)80年代中期，但是食品中常見的污染真菌的免疫學(xué)檢測(cè)方法大都被研究過。到目前為止，食品中常見的污染真菌，已有地霉屬、根霉屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢霉屬、毛霉屬、擬莖點(diǎn)青霉屬、分枝霉屬、腐質(zhì)霉屬、散囊菌屬、鐮孢霉屬等10多個(gè)屬被研究過，并獲得了相應(yīng)的特異性抗原和抗體。第97頁/共134頁

食品中污染真菌毒素免疫檢測(cè)方法的研究開始于20世紀(jì)60-70年代，起初用于真菌毒素的免疫學(xué)檢測(cè)方法是放射免疫方法。目前真菌毒素的檢測(cè)方法主要是酶免疫方法，20世紀(jì)80年代中后期已有酶免疫檢測(cè)真菌毒素的商品試劑盒銷售。食品中常見的污染真菌毒素，例如，黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、串珠鐮刀菌毒素、雜色曲霉素、伏馬素、橘霉素和展青霉素等都有商品試劑盒出售，用以檢測(cè)玉米、稻谷、大米、花生、小麥、大麥、棉子、牛奶、肉類及其制品等中污染的各種真菌毒素。近幾年來真菌毒素的快速檢測(cè)方法和試劑也相繼問世。

第98頁/共134頁（三）食品中農(nóng)藥殘留的免疫學(xué)方法檢測(cè)食品中的農(nóng)藥殘留包括除草劑殘留、有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類等殺蟲劑的殘留。目前農(nóng)藥殘留的檢測(cè)手段主要是毛細(xì)管氣相色譜和高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)。免疫學(xué)方法用于食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)和分析的研究大約開始于十多年前。由于具有快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、無須昂貴的儀器設(shè)備和可以在采樣現(xiàn)場(chǎng)分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的主要發(fā)展方向之一，越來越受到人們的重視。

第99頁/共134頁（四）食品中抗生素殘留的免疫檢測(cè)食品中的抗生素殘留主要包括：農(nóng)用抗生素、畜用抗生素。食品中抗生素殘留的分析檢測(cè)方法主要有薄層層析（TLC）、液相色譜（LC）、氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC／MS）、微生物抑制實(shí)驗(yàn)、微生物受體實(shí)驗(yàn)、免疫學(xué)方法以及這些方法相互結(jié)合在一起的衍生方法。例如，微生物抑制實(shí)驗(yàn)和液相色譜結(jié)合在一起的生物色譜。免疫學(xué)方法作為其中的一種檢測(cè)方法，近年來愈來愈受到重視。目前德國(guó)的г-biopham公司和意大利的Tecnalab公司等已有檢測(cè)食品中磺胺類抗生素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、新霉素、泰樂菌素和慶大霉素等抗生素殘留的免疫檢測(cè)試劑盒出售。

第100頁/共134頁（五）食品中摻假物的免疫學(xué)識(shí)別

免疫學(xué)方法在識(shí)別食品中摻假物方面也發(fā)揮著重要的作用。例如，在綿羊奶或山羊奶奶酪的生產(chǎn)中，如果原料奶中摻雜有牛奶成分將影響綿羊（山羊）奶奶酪的品質(zhì)和加工特性，因此在加工過程中應(yīng)避免牛奶的摻入。通常的分析方法，包括電泳技術(shù)一般很難鑒別出羊奶中是否摻雜有牛奶。以牛奶中特有的酪蛋白為抗原，制備抗體，然后再運(yùn)用免疫學(xué)方法就能夠很容易地鑒別出羊奶中是否摻有牛奶。由于牛奶中特有的酪蛋白的耐熱性好，因此免疫學(xué)方法對(duì)于殺菌或消毒后的奶及其乳酪制品中是否含有牛奶成分也可以進(jìn)行分析和鑒別。同樣原理的免疫學(xué)方法也可以快速鑒別綿羊奶中是否摻雜有山羊奶。目前德國(guó)的г-biopham公司已有上述免疫試劑盒銷售。第101頁/共134頁（六）免疫學(xué)方法在分析樣品凈化中的應(yīng)用

依據(jù)抗原抗體的特異反應(yīng)特性，應(yīng)用免疫學(xué)方法可以快速地從樣品中分離凈化需要分析的成分，然后再進(jìn)行分析。例如，VICAM公司的凈化真菌毒素的免疫親和層析柱，就是先將抗黃曲霉毒素、伏馬素、T-2毒素或赭曲霉毒素的抗體包被在葡萄糖凝膠或瓊脂糖凝膠顆粒上，然后將它們裝入小柱內(nèi)制成，它們具有從樣品中快速分離純化這些真菌毒素的作用。使用時(shí)將樣品的提取液加入親和柱中，并依次用不同的洗脫劑洗脫，就可以得到純凈的真菌毒素，經(jīng)過凈化后的毒素可以用免疫學(xué)方法或HPLC等進(jìn)行分析和測(cè)定。經(jīng)過親和柱凈化后可以大大地提高檢測(cè)方法的靈敏度，減少樣品雜質(zhì)對(duì)分析的干擾，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

第102頁/共134頁第三節(jié)生物芯片及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

（一）定義

第一種是認(rèn)為DNA芯片或基因芯片（DNAorgenechip）就是生物芯片，這主要是因?yàn)镈NA芯片出現(xiàn)最早，研究最多，應(yīng)用最成功。第二種認(rèn)為生物芯片主要包括DNA芯片和蛋白質(zhì)芯片（proteinchip），因?yàn)榈侥壳盀橹惯@兩種芯片最為成功。第三種是將微流路生物分析系統(tǒng)也歸入了生物芯片的范疇。

一、生物芯片的定義及分類第103頁/共134頁

生物芯片：按預(yù)先的設(shè)置排列固定有大量生物識(shí)別分子（例如DNA片段、RNA片段、抗原抗體分子或蛋白質(zhì)或肽分子）的面積很?。ㄍǔＶ挥幸坏綆灼椒嚼迕祝┑墓杵?、載玻片或高分子聚合物薄片。工作原理：將待檢測(cè)樣品加在芯片的表面，由于生物分子特異性親和反應(yīng)（如核酸雜交反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)等），檢測(cè)樣品中的待檢測(cè)成分分別和芯片上固定化的生物識(shí)別分子結(jié)合反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分析和檢測(cè)。生物芯片可以在很小的面積上并行分析成千上萬種生物分子，分析結(jié)果的可比性好，試劑的消耗量少，并可實(shí)現(xiàn)微型化和自動(dòng)化。

第104頁/共134頁第105頁/共134頁（二）分類

根據(jù)芯片上固定的探針不同，生物芯片可分為DNA芯片（DNAchip）和蛋白質(zhì)（肽）芯片（proteinorpeptidechip）等。

DNA芯片：又稱為DNA微陣列。按特定的排列方式排列固定有大量基因片段（可以是相同的基因片段，也可以是不同的）的硅片、玻璃片或塑料片。工作原理：將樣品加在芯片上，通過分子雜交方式對(duì)樣品進(jìn)行分析，從而大規(guī)模高效地獲取相關(guān)的生物信息。

第106頁/共134頁

蛋白質(zhì)芯片：又稱為蛋白質(zhì)微陣列。將大量的蛋白質(zhì)分子（例如抗體或抗原分子）或肽鏈有序排列固定在載體薄片上形成。工作原理：利用蛋白質(zhì)或肽能特異性地與配體分子（如抗原或抗體）結(jié)合的原理，芯片上的蛋白質(zhì)分子或肽鏈與樣品中的相關(guān)成分發(fā)生反應(yīng)，然后加入標(biāo)記分子，并用閱讀儀分析和存儲(chǔ)結(jié)果。其他有可能開發(fā)成功的芯片還有藥物受體芯片、激素芯片、多糖芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。第107頁/共134頁

根據(jù)芯片的用途，生物芯片可以分為樣品制備芯片、生化反應(yīng)芯片、檢測(cè)芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室等。樣品制備芯片：用于制備樣品的芯片，它可以將通常在實(shí)驗(yàn)室需要多個(gè)操作步驟才能完成的工作集中于一個(gè)芯片上完成。生化反應(yīng)芯片：用于進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的芯片。與傳統(tǒng)生化反應(yīng)過程相比，生物芯片可以高效、快速、經(jīng)濟(jì)地完成生物化學(xué)反應(yīng)。目前研究得比較多的生化反應(yīng)芯片是PCR芯片。

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檢測(cè)芯片：用來檢測(cè)生物樣品的芯片。前面敘述的DNA芯片和蛋白質(zhì)（肽）芯片都屬于檢測(cè)芯片。芯片實(shí)驗(yàn)室：將各種功能的芯片集約在同一載體片（通常為硅片）上，形成的（復(fù)合）多功能芯片。芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有望將實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的樣品制備、生化反應(yīng)和檢測(cè)等過程部分或全部地集約“濃縮”在一起，這也是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。

第109頁/共134頁二、生物芯片的制備方法（一）DNA芯片的制備方法

1.載體及其活化作為生物芯片的載體材料至少應(yīng)滿足以下要求：①載體表面必須有足夠多的活性基團(tuán)，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)；②載體應(yīng)有相當(dāng)?shù)亩栊院妥銐虻姆€(wěn)定性。惰性是指載體的其他性能或特異性吸附不應(yīng)該干擾生物大分子的功能；穩(wěn)定性（包括機(jī)械的、物理的和化學(xué)的穩(wěn)定性）是指載體遭受一定的壓力或酸堿條件后不會(huì)發(fā)生變化；③載體應(yīng)具有很好的生物兼容性。

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目前用作生物芯片的載體材料主要有玻璃片、金屬片、硅片和各種有機(jī)高分子制作的薄膜或薄片，其中玻璃片是最常用的載體材料。優(yōu)點(diǎn)：來源方便；表面有足夠多的羥基，便于在適當(dāng)處理后或直接和生物大分子偶聯(lián)；透光性好，適合于發(fā)光檢測(cè)；采用光刻蝕方法可以在其表面刻出微流路。載體的活化：指采用不同的活化試劑通過化學(xué)反應(yīng)在載體表面鍵合上各種各樣的活性基團(tuán)，以便和生物大分子共價(jià)結(jié)合。

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2.DNA芯片的制備方法

點(diǎn)樣法：將合成好的DNA和cDNA等片段通過點(diǎn)樣的方式直接點(diǎn)接于載體上。原位合成法：以單核苷酸為原料在載體表面直接合成DNA片段（寡核苷酸片段）。根據(jù)點(diǎn)樣方式的不同，點(diǎn)樣法又可以分為打印點(diǎn)樣和噴印點(diǎn)樣兩種，在打印點(diǎn)樣中點(diǎn)樣針頭與芯片直接接觸，而噴印的點(diǎn)樣針頭與芯片保持一定距離（圖）。兩種點(diǎn)樣方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常1cm2可打印點(diǎn)樣2500個(gè)點(diǎn)，缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限；噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)，缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，國(guó)此點(diǎn)樣密度較低，通常1cm2只能點(diǎn)400個(gè)點(diǎn)（表）。

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原位合成法主要包括原位噴印合成法和原位光解保護(hù)基合成法兩種。原位噴印合成法的原理：與噴墨打印類似，不過噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是墨水，噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)，并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)DNA片段的序列需要，將特定的堿基噴印在芯片特定的位置進(jìn)行合成，該技術(shù)采用的合成原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，無特殊制備的化學(xué)試劑。

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原位光解保護(hù)基合成法的原理：首先活化載體上的基團(tuán)（如羥基）并偶聯(lián)上光保護(hù)基團(tuán)，然后在載體表面覆蓋上一層具有半透明區(qū)和不透明區(qū)間隔的掩蔽膜，將光束通過掩蔽膜照射載體，光線通過半透明區(qū)照射到載體上使被照射部位光解保護(hù)基團(tuán)光解脫落，被保護(hù)基團(tuán)激活（而不透明區(qū)的光解保護(hù)基團(tuán)不脫落，被保護(hù)基團(tuán)不激活），被激活的基團(tuán)和帶有光解保護(hù)基團(tuán)的單核苷酸反應(yīng)結(jié)合。重復(fù)上述過程逐步增加核苷酸的數(shù)量就可以合成適當(dāng)長(zhǎng)度的特異性的寡核苷酸片斷（圖）。目前通過原位光解保護(hù)基合成法可以在1cm2的載體表面上合成約40萬個(gè)寡核苷酸片斷。

第115頁/共134頁（二）蛋白質(zhì)（肽）芯片的制備方法點(diǎn)樣法：將合成并提取純化的蛋白質(zhì)或肽直接點(diǎn)接在活化載體的表面，使其與載體的活化基團(tuán)結(jié)合而固定在載體上。原位合成法：主要用于肽芯片的制備，和DNA原位光解保護(hù)基合成法一樣，先將載體表面的活性基團(tuán)以光解保護(hù)基團(tuán)保護(hù)起來，然后光線通過掩蔽膜照射到載體表面，使光解保護(hù)基團(tuán)選擇性脫落，被保護(hù)基團(tuán)激活，再將帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸結(jié)合上去。重復(fù)上述過程就可以得到結(jié)合（固定）有一定長(zhǎng)度肽鏈的肽鏈芯片（圖）。

第116頁/共134頁第117頁/共134頁（三）微流路刻蝕技術(shù)（microfluidetchingtechnique）微流路刻蝕通常在硅片上采用光刻平板印刷技術(shù)（opticalsculpturingplateprintingtechnique）進(jìn)行。光刻平板印刷技術(shù)包括光敏膠涂漬、光刻和刻蝕（或增厚）三個(gè)基本的過程。光敏膠涂漬：將光敏感聚合物均勻涂在硅片上，蒸干溶劑，形成光敏層。然后在光敏層上覆蓋掩蔽膜（和DNA芯片制備中的掩蔽膜一樣，掩蔽膜上以半透明區(qū)和不透明區(qū)間隔繪制了預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案），以光照射掩蔽膜，光線通過掩蔽膜的半透明區(qū)照射到光敏層上使被照部位曝光，不透明區(qū)覆蓋的光敏層由于不被光線照射而不曝光。

第118頁/共134頁三、生物芯片的應(yīng)用

（一）DNA芯片的應(yīng)用

1.DNA序列測(cè)定傳統(tǒng)的兩種測(cè)序方法（Sanger和Maxam-Gilbert），在效率、費(fèi)用和可靠性等方面都不能滿足人類基因組測(cè)序的需要，很多高效快速測(cè)序方法相繼誕生，雜交測(cè)序（SBH）和鄰堆雜交（CSB）就是其中的兩種。

第119頁/共134頁SBH是最初發(fā)展起來的DNA芯片技術(shù)，其過程：首先將未知序列的單鏈DNA片段和DNA芯片進(jìn)行雜交，互補(bǔ)序列形成雙鏈，然后通過分析鑒定雙鏈體的情況就可以得出未知DNA的序列。在SBH技術(shù)中，其效率隨著芯片中寡核苷酸數(shù)量及其長(zhǎng)度