miRNA及其發(fā)展和應(yīng)用

miRNA及其研究和應(yīng)用謝東君 2015202030079現(xiàn)在是1頁\一共有21頁\編輯于星期一RNA在生命過程中的作用mRNA——合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖rRNA——合成蛋白質(zhì)的工廠tRNA——合成蛋白質(zhì)的搬運(yùn)工miRNA——？？？現(xiàn)在是2頁\一共有21頁\編輯于星期一被關(guān)注的RNA研究2000年，RNAi的研究進(jìn)展被Science雜志評(píng)為重大科技突破。2001年，RNAi作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”。2002年12月20日，Science雜志將“SmallRNA&RNAi”評(píng)為2002年度最耀眼的明星。同時(shí)，Nature雜志亦將SmallRNA評(píng)為年度重大科技成果之一。2003年，microRNA的研究第四次入選“十大科技突破”。2005年，microRNA的研究第五次入選“十大科技突破”。2006年，RNAi獲得當(dāng)年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。并且microRNA的研究第六次入選“十大科技突破”。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域近20年來，可與HGP相提并論的最重大成果之一?，F(xiàn)在是3頁\一共有21頁\編輯于星期一什么是miRNA現(xiàn)在是4頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在是5頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的產(chǎn)生過程現(xiàn)在是6頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的作用機(jī)制現(xiàn)在是7頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的特點(diǎn)與其他寡核苷酸相比,主要有三點(diǎn)不同:沒有開放閱讀框架及蛋白質(zhì)編碼基因的特點(diǎn)通常的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸,但在3’端可以有幾個(gè)堿基的長(zhǎng)度變化成熟的miRNA5’端有一磷酸基團(tuán),3’端為羥基現(xiàn)在是8頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的生物學(xué)功能miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞的早期發(fā)育參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)可用于腫瘤診斷和治療有抗病毒作用調(diào)控干細(xì)胞的自我更新現(xiàn)在是9頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的保守性Let-7RNA脊椎動(dòng)物半索動(dòng)物軟體動(dòng)物環(huán)節(jié)動(dòng)物節(jié)肢動(dòng)物刺胞動(dòng)物海綿動(dòng)物現(xiàn)在是10頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA靶基因的尋找盡管數(shù)百種miRNA在最近幾年中被發(fā)現(xiàn)了,但是只有非常少量的miRNA被確定其作用,許多其他的miRNA基因的作用還沒有被闡明。因此發(fā)現(xiàn)miRNA的作用靶點(diǎn)成為了解其在不同的生理過程中的功能的關(guān)鍵。目前主要利用生物信息學(xué)方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA的靶基因。尋找靶基因生物信息學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在是11頁\一共有21頁\編輯于星期一生物信息學(xué)方法尋找miRNA靶基因生物信息學(xué)方法主要是利用某種算法對(duì)靶基因樣本進(jìn)行評(píng)分及篩選。主要遵循以下幾個(gè)常用原則:miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性miRNA靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)miRNA5′端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于3′端常用的算法有：

miRanda、TargetScan、RNAhybrid、PicTar、miTarget等現(xiàn)在是12頁\一共有21頁\編輯于星期一現(xiàn)在是13頁\一共有21頁\編輯于星期一生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA靶基因由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測(cè)miRNA靶基因時(shí)存在一定的局限性,因此很多學(xué)者也希望能夠利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直觀地尋找miRNA靶基因。一般可以從兩個(gè)水平去尋找miRNA靶基因從mRNA

水平尋找miRNA

靶基因從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA

靶基因現(xiàn)在是14頁\一共有21頁\編輯于星期一從mRNA水平尋找miRNA靶基因

——基因芯片法將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,使得miRNA在細(xì)胞中過表達(dá),之后利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應(yīng)miRNA的靶基因。由于miRNA在體內(nèi)通過翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用,因此這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時(shí)存在一定困難.現(xiàn)在是15頁\一共有21頁\編輯于星期一從mRNA水平尋找miRNA靶基因

——免疫共沉淀法利用AGO蛋白家族既能結(jié)合miRNA又能結(jié)合mRNA的特性,分別使用AGO-1和AGO-2蛋白的單克隆抗體在人類細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀,得到與AGO-1和AGO-2蛋白結(jié)合的mRNA各600條,并通過克隆測(cè)序?qū)@些mRNA進(jìn)行鑒定.同時(shí)從與AGO-1蛋白結(jié)合的mRNA中隨機(jī)挑選6條進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其中有5條都是miRNA的靶基因.現(xiàn)在是16頁\一共有21頁\編輯于星期一從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA靶基因

——細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)分別將成熟miRNA雙鏈轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture),將轉(zhuǎn)染了成熟miRNA雙鏈的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別培養(yǎng)于含輕/重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培養(yǎng)基中,經(jīng)過若干次細(xì)胞倍增后,穩(wěn)定同位素按照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中,通過比較標(biāo)記前后同一肽段的質(zhì)譜峰值變化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的精確定量.在檢測(cè)了2000~5000個(gè)蛋白后,兩個(gè)研究組分別發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染一條miRNA后有幾百個(gè)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了改變,許多改變?cè)趍RNA水平上不能得到體現(xiàn).現(xiàn)在是17頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA靶基因的鑒定目前最為常用的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法.其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體,將希望鑒定的miRNA靶基因的3′UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3′UTR中,之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平,最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3′UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。

現(xiàn)在是18頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA在在腫瘤研究中的應(yīng)用隨著對(duì)miRNA認(rèn)識(shí)和了解,越來越多的研究認(rèn)識(shí)到它與腫瘤的形成有密切的關(guān)系。如抑制癌基因的miRNA表達(dá)降低,可導(dǎo)致癌基因的過表達(dá);而抑制抑癌基因的miRNA表達(dá)過度,可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)降低。致癌基因的過表達(dá)與抑癌基因表達(dá)降低均可使腫瘤發(fā)生。例如miR-155是由人BIC基因編碼的miRNA,在hodgkin淋巴瘤和burkitt淋巴瘤中均高表達(dá)。在burkitt淋巴瘤中,

miR-155的前體RNA出現(xiàn)10-30倍的蓄積現(xiàn)象,但是在非hodgkin淋巴瘤中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)?，F(xiàn)在是19頁\一共有21頁\編輯于星期一miRNA的研究現(xiàn)狀和展望目前已發(fā)現(xiàn)了大量的?。遥危练肿?它們?cè)谛蛄?、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能等方面都不同程度地表現(xiàn)出了多樣性,其中miRNA的表現(xiàn)尤為突出,它很可能在生命活動(dòng)中起著重要作用,對(duì)基因表達(dá)、生長(zhǎng)、發(fā)育