神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)

神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)第1頁(yè)/共145頁(yè)本講提綱1神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)概述2阿爾茨海默?。ˋlzheimerDisease,AD）3精神分裂癥(Schizophrenia)4抑郁癥（Depression）5小結(jié)第2頁(yè)/共145頁(yè)1神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)概述

1-1神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)的時(shí)代必然到來(lái)

1）揭示大腦奧秘和神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的

必要性和緊迫性（1）腦科學(xué)是未解之謎最多的現(xiàn)代人體科學(xué)（2）該系統(tǒng)主要疾病的發(fā)病機(jī)制不明第3頁(yè)/共145頁(yè)（1）腦科學(xué)是現(xiàn)代人體科學(xué)中未解之謎最多的領(lǐng)域

“21世紀(jì)是腦科學(xué)時(shí)代”：最前沿、最熱門(mén)的領(lǐng)域大宇宙：自然；人腦：小宇宙最需搭建的橋梁：左右腦之間的那一座

最應(yīng)挖掘的寶藏：**“人腦功能尚有93-95％在沉睡，可能是世界最富饒的寶藏”

**地球上，人類(lèi)開(kāi)發(fā)最少的神秘地域，就在我們頭皮下的空間“愛(ài)因斯坦只是比常人多開(kāi)發(fā)了百分之幾的腦功能，就造成了相互之間的天壤之別”

第4頁(yè)/共145頁(yè)

2011年11月25日第5頁(yè)/共145頁(yè)美博物館首次展出愛(ài)因斯坦大腦切片

館長(zhǎng)：“展出目的在于讓觀眾看看天才的大腦長(zhǎng)成什么樣，了解大腦及其生理機(jī)能。目前也不知道究竟哪部分大腦結(jié)構(gòu)令?lèi)?ài)因斯坦取得非凡成就?！薄八鼈儗⒄钩鲆欢螘r(shí)間，之后博物館可能考慮借出這些切片用于神經(jīng)學(xué)研究”

費(fèi)城醫(yī)學(xué)院穆特博物館正在展出著名物理學(xué)家艾伯特·愛(ài)因斯坦的部分大腦組織切片：46片大腦切片，其中1片可借助顯微鏡細(xì)看第6頁(yè)/共145頁(yè)（1）腦科學(xué)：人體科學(xué)中未解之謎最多的領(lǐng)域

其挑戰(zhàn)性在于：神經(jīng)系統(tǒng)具有復(fù)雜的（亞）細(xì)胞結(jié)構(gòu)、復(fù)雜的蛋白間相互作用，且大多數(shù)功能蛋白表達(dá)量極低

例如：

①大腦有103種以上的細(xì)胞類(lèi)型

②

人CNS＝neuron（10%，約1000億個(gè)）

＋neuroglia（90%）

人大腦皮層：約140億個(gè)神經(jīng)元③神經(jīng)元＝胞體＋突起第7頁(yè)/共145頁(yè)④

神經(jīng)元之間的聯(lián)系千絲萬(wàn)縷，其間信息往返穿梭，其復(fù)雜和精準(zhǔn)的程度無(wú)與倫比

神經(jīng)元之間相互作用的方式主要為突觸傳遞，103-104個(gè)突觸/細(xì)胞

僅一個(gè)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突表面就有1800個(gè)左右的突觸小體覆著⑤

103種蛋白質(zhì)/突觸后密集區(qū)（Postsynapticdensity,PSD）

PSD：化學(xué)突觸后膜上附著的圓盤(pán)狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，amultiproteincomplexcontainingmembraneproteins,signalingmoleculesandcorePSDproteins.：

復(fù)雜、神秘的寶藏第8頁(yè)/共145頁(yè)（2）該系統(tǒng)的主要疾病及特點(diǎn)

神經(jīng)變性疾?。喊柎暮Ｄ?AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS)等多發(fā)性硬化癥(MS)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性、多灶性、脫髓鞘為主的自身免疫系統(tǒng)疾病精神疾病：已歸入腦功能障礙（如抑郁癥和精神分裂癥）顱內(nèi)腫瘤：星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤癲癇和感染性疾病等腦血管疾病：包括出血性和缺血性腦血管病，尤其缺血性腦血管病發(fā)病率、致殘率高第9頁(yè)/共145頁(yè)

以阿爾茨海默病（AD)為例

①

發(fā)生率高

②病因和發(fā)病機(jī)制不清

③

缺乏客觀、特異、敏感的指標(biāo)，診斷難④

缺乏特異性治療措施

⑤

其致殘（死）率高，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)

嚴(yán)重負(fù)面影響目前：研究手段不能滿足其基礎(chǔ)和臨床研究的需要

神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特點(diǎn)第10頁(yè)/共145頁(yè)1-1Neuroproteomics時(shí)代必然到來(lái)

因此，迫切需要揭示：

1）大腦活動(dòng)的奧秘，以挖掘潛能2）神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制3）尋找該系統(tǒng)疾病的特征性標(biāo)志物

4）發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)疾病治療的靶標(biāo)

以提高診治水平和改善預(yù)后第11頁(yè)/共145頁(yè)1神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)概述

1-1神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)的時(shí)代必然到來(lái)

1）揭示大腦奧秘和神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的必要性和緊迫性2）蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代已經(jīng)到來(lái)，為從事神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理的研究提供了技術(shù)平臺(tái)（可行性）

**HGP后，達(dá)成共識(shí):

生命的復(fù)雜程度與

蛋白質(zhì)的多樣性及其相互作用的復(fù)雜性有關(guān)**組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)建立并逐步完善中

SO,

Neuroproeomics時(shí)代必然到來(lái)第12頁(yè)/共145頁(yè)

1-2國(guó)外相關(guān)的組織和研究計(jì)劃舉例1)HumanBrainProteomeProject2)InUniversityofCaliforniaatDavis3)InSweden第13頁(yè)/共145頁(yè)

HUPO于2003年啟動(dòng)

負(fù)責(zé)人：Dr.HelmutE.Meyer(德國(guó))主要致力于人腦變性疾病患者（AD,PD

andAging）

以及相應(yīng)動(dòng)物模型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

/1）HumanBrainProteomeProject

(HBPP)orHUPOBPP

帕金森氏綜合癥（Parkinson‘sDisease，PD），震顫麻痹，頭及四肢顫動(dòng)、振搖，部分或全部肢體不能自主運(yùn)動(dòng)。

第14頁(yè)/共145頁(yè)HBPP：isanopen

internationalprojectunderthepatronage（贊助）ofHUPOthataims

（1）

toanalyzethebrainproteomeofhumanaswellasmousemodelsin

healthy,neurodiseasedandagedstatuswithfocuson

ADandPD

（2）toperform

quantitativeproteomics

aswellascomplemantarygeneexpressionprofilingondisease-relatedbrainareas

and

bodilyfluids

（3）toadvanceknowledgeofneurodiseasesandaginginordertopushnew

diagnostic

approachesandmedications（4）

to

exchange

knowledgeanddata

withotherHUPOprojectsandnational/

internationalinitiativesintheneuroproteomicfield（5）tomakeneuroproteomicresearchanditsresultsavailableinthescientificcommunityandsociety第15頁(yè)/共145頁(yè)

HBPP年會(huì)20021stVersailles（凡爾賽，法國(guó)）20032ndMontreal（蒙特利爾，加拿大）20043rdBeijing20054thMunich（慕尼黑，德國(guó)）20065thLongBeach（長(zhǎng)島，美國(guó)）20076thSeoul（漢城，韓國(guó)）20087thAmsterdam（阿姆斯特丹，荷蘭）20098thToronto（多倫多，加拿大）20109thSydney（悉尼，澳大利亞）201110thGeneva(日內(nèi)瓦，瑞士9月5號(hào)）除年會(huì)，還有頻繁的專(zhuān)題研討會(huì)第16頁(yè)/共145頁(yè)HBPP活動(dòng)頻繁（workshop，專(zhuān)題討論會(huì)）第17頁(yè)/共145頁(yè)

Creatingahumanbrainproteomeatlas--13thHUPOBPPWorkshop

March30-31,2010,Ochang,KoreaCreatingahumanbrainproteomeatlas--14thHUPOBPPworkshop

September20-21,2010,Sydney,Australia.September5th2011,

The17thHUPOBPPWorkshop

inGeneva（日內(nèi)瓦）,Switzerland

(duringthe10thHUPOWorldCongress)The

19thHUPOBPPWorkshop

willtakeplaceinEssen,Germany

onMay23rd&24th2013

第18頁(yè)/共145頁(yè)TheaimsoftheHBPPworkshoppresent

recent

sophisticatedproteomics

approaches

discussthefutureHUPOBPP

roadmapfileaHUPOBPP

wishlist

第19頁(yè)/共145頁(yè)

toseektogenerateupto

500quality-assuredmonoclonalantibodiesagainstneuronalproteins,startingwithmembraneandsynapticproteins,andtheplanistoprovideantibodies

cheaplytotheresearchcommunity

2）InUniversityofCaliforniaatDavis

第20頁(yè)/共145頁(yè)3）InSweden

thegroupnowhasin

excessof700rabbitpolyclonalantibodies

whichhavebeenusedintissuemicroarrays,usingcoresofvarioushumantissues

includingcerebellarcortexandcerebellum

/rodentbrain第21頁(yè)/共145頁(yè)1-3中國(guó)的有關(guān)情況1）資助機(jī)構(gòu)國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃

國(guó)家科技支撐計(jì)劃

國(guó)家自然科學(xué)基金

第22頁(yè)/共145頁(yè)

2）若干蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心和

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室相繼成立

復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)研究中心軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組中心中國(guó)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心高等院校蛋白質(zhì)組學(xué)研究院

（是由國(guó)內(nèi)多所高校、臨床單位和國(guó)內(nèi)外有關(guān)公司聯(lián)合建立的研究機(jī)構(gòu)，是我國(guó)高校大規(guī)模打破學(xué)校界限，與國(guó)內(nèi)外多方面力量聯(lián)手，進(jìn)軍蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域所采取的新舉措）第23頁(yè)/共145頁(yè)重醫(yī)生命科學(xué)院--蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)

ABSCIEXTripleTOFTM5600系統(tǒng)在LC/MS/MS性能上獲得創(chuàng)新性突破，獨(dú)一無(wú)二地、在同一平臺(tái)上集成了全面定性探索、快速全貌解析和高分辨定量的三種工作流程該系統(tǒng)同時(shí)具備以下特點(diǎn)：最高的檢測(cè)靈敏度，高分辨率，至少5倍以上的高速采集……

ABSCIEX公司:是唯一且持續(xù)專(zhuān)注于質(zhì)譜儀器的全球領(lǐng)導(dǎo)者；由合資公司Applied

Biosystems/MDS

Analytical

Technologies發(fā)展而來(lái)

第24頁(yè)/共145頁(yè)3）研究單位和項(xiàng)目

（1）由重慶醫(yī)科大學(xué)牽頭，聯(lián)合軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、武漢大學(xué)生命科學(xué)院、中南大學(xué)4家獲得國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（973）“抑郁癥的蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽組學(xué)研究”，2009年正式啟動(dòng)

由三個(gè)子課題組成課題一抑郁癥動(dòng)物模型的蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽組學(xué)研究課題二抑郁癥的蛋白質(zhì)和多肽組學(xué)研究課題三神經(jīng)系統(tǒng)疾病繼發(fā)抑郁的蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽組學(xué)研究（2）復(fù)旦大學(xué)--從事精神分裂癥蛋白質(zhì)組學(xué)等的研究（3）軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院--脊髓損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)等的研究（4）山東大學(xué)--腦脊液、癲癇等的蛋白質(zhì)組學(xué)等的研究（5）中科院藥物所—帕金森的蛋白質(zhì)組學(xué)第25頁(yè)/共145頁(yè)1-3研究材料

1)腦組織（腦庫(kù)）2）腦脊液（CSF)3)細(xì)胞間液4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型第26頁(yè)/共145頁(yè)

1)人腦組織：最好的研究對(duì)象

開(kāi)展腦科學(xué)研究的基本條件之一是有可供研究的腦組織標(biāo)本人腦標(biāo)本的特殊性：死后捐贈(zèng)

CNS具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，直接開(kāi)顱取活體腦組織會(huì)造成不可逆的組織損傷和功能缺損So,以前主要是使用動(dòng)物標(biāo)本，而人與動(dòng)物的腦組織差別大現(xiàn)在：世界各國(guó)在腦科學(xué)領(lǐng)域的研究競(jìng)爭(zhēng)激烈

已有十幾個(gè)國(guó)家建立腦庫(kù)第27頁(yè)/共145頁(yè)1）人腦庫(kù)（1）日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系腦庫(kù)（2）BrainNetEurope（3）TheBrainEndowmentBank

（4）HarvardBrainTissueResourceCenter（5）AustralianMSBrainBank（6）加拿大麥克馬斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦庫(kù)(7)

印度腦庫(kù)（8）腫瘤腦庫(kù)（9）自閉癥腦庫(kù)（10）中國(guó)腦庫(kù)第28頁(yè)/共145頁(yè)1）人腦組織（腦庫(kù)）（1）日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系腦庫(kù)：世界上建立最早、擁有名人腦組織最多的腦庫(kù)（自1913年始），至今已有131個(gè)首相、小說(shuō)家、藝術(shù)家和著名學(xué)者的大腦供研究用20世紀(jì)90年代開(kāi)始建立人腦庫(kù)（2）BrainNetEurope（）

OneofPurposesofBNEis

to

develop

goldstandardsfortissuehandling,tissuequalitycontrolandethics

leadingtobestpracticeguidelinesforbrainbanking.

第29頁(yè)/共145頁(yè)(3）TheBrainEndowmentBankTheprogramwasestablishedin1986attheUniversityofMiami

MillerSchoolofMedicine.

ItisoneofthelargestbraintissueresourcesintheUS.

Thebiorepositoryhasgrownoverthepast20years,nowcryopreservingover1500brainswithadditional800-registeredlivingdonors,whohaveconsentedtobraindonationafterdeath.第30頁(yè)/共145頁(yè)(3）TheBrainEndowmentBanktosupportbasicandclinicalresearchers,whostudythecausesofbraindisordersandtheeffectsofaging.

AdvancesinmoleculargeneticsandpathologymakeitpossibleforresearcherstoidentifycausesandcuresforbraindisorderssuchasPD,ALS（脊髓側(cè)索硬化癥）,…,AD…,Schizophrenia（精神分裂癥）,AlcoholandDrugDependence,MajorDepression（抑郁癥）,…/x24.xml第31頁(yè)/共145頁(yè)(3）TheBrainEndowmentBanktostandardizebiospecimencollectionandmanagement

(paraffin-embeddedandfrozentissue,serumand/orplasma)to

support21stcenturyNeuroscienceresearch.Researchersinacademiaandindustrymayapplyon-line.Beavailable24hours/365days/year第32頁(yè)/共145頁(yè)（3）TheBrainEndowmentBank

1501NW9thAvenue

Room4013(D4-5)

Miami,FL33136

1(800)UM-BRAIN(862-7246)

Tel:(305)243-6219

Fax:(305)243-3649第33頁(yè)/共145頁(yè)TheHarvardBrainTissueResourceCenterisfundedbytheNIHaswellasseveralprivateorganizationstoserveasavitalresourceforthecollectionanddistributionofpostmortembraintissuesformedicalresearchintothecausesofdevastatingneurologicaland

psychiatricdisorders.

'Understandingthechemistryofcellsindiseasedregionsofthebrain—whatproteinsarepresent,whichgenesareactive—canhelpscientistsdeterminewhatwentwrong,anddevelopdiagnostictestsandtreatments.‘—Dr.FrancineM.Benes,HarvardBrainTissueResourceCenter

第34頁(yè)/共145頁(yè)TheCenterhasbeenestablishedatMcLeanHospital.Inordertoperformresearchintotheneurologicalorpsychiatricdisorders,itisvitaltocollect

normalcontroltissue

aswell.

第35頁(yè)/共145頁(yè)（5）AustralianMSBrainBank

.au

MS（多發(fā)性硬化癥）canbeadevastatingdiseaseandacommoncauseofneurologicaldisabilityinyoungadults.IthasahugeeconomicimpactonPeoplewithMS,theircarersandthecommunity.…alsohave

nousefultreatment

forpeoplewithprogressiveMS.Thisiswhythereisa

needforcontinuingresearch

intoMS.第36頁(yè)/共145頁(yè)（6）加拿大麥克馬斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦庫(kù)

McMasterUniversityinOntario,Canada

冷凍著125個(gè)人大腦是世界上最大的正常人類(lèi)大腦收藏庫(kù)，其中包括20世紀(jì)最偉大的科學(xué)家艾伯特·愛(ài)因斯坦和幾何學(xué)家麥克唐納·麥克斯特的大腦人類(lèi)大腦的很多秘密正在這里揭開(kāi)第37頁(yè)/共145頁(yè)AlbertEinstein’stheparietallobe（頂葉）,theregionresponsibleforvisualthinkingandspatialreasoning,was15percentlargerthanaverage(1999)第38頁(yè)/共145頁(yè)這個(gè)就是改變?nèi)澜绲拇竽X

50年前湯姆斯醫(yī)師，在愛(ài)因斯坦過(guò)世時(shí)，取得這一顆歷史上最偉大的腦，企圖解開(kāi)這個(gè)謎湯姆斯醫(yī)師先把防腐劑，注射到愛(ài)因斯坦的大腦，接著把大腦切成240小塊，用顯微鏡觀察，不過(guò)，當(dāng)時(shí)並沒(méi)有太多發(fā)現(xiàn)直到最近，科學(xué)家利用電腦3D技術(shù)，將240塊樣本一一拼湊，終于重建了愛(ài)因斯坦完整的大腦圖像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，愛(ài)因斯坦的腦容量，雖然和一般人差不多，不過(guò)，他的頂葉（掌管腦中的數(shù)學(xué)和邏輯）卻比一般人大15％，尤其是左下頂葉的膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯偏高；另外他們也從愛(ài)因斯坦的側(cè)腦裂較不明顯的特征推論，愛(ài)因斯坦的大腦生來(lái)就有些重疊區(qū)域，這些重疊也許讓他更有數(shù)學(xué)和空間觀念第39頁(yè)/共145頁(yè)SandraWitelson**menmayhavebiggerbrains

(theaveragefemalebrainis10percentsmallerthanthemalebrain.)

**women’sbrainshavemorenervecellsintheirfrontallobes(額葉）thanmen'sbrains,butbyoldage,menandwomenhavesimilarnumberofcellsinthefrontallobes.Thisisbecausewomenlosecellsintheseareasfasterastheyagethanmendo.ThismaycontributetothehigherincidenceofAlzheimer'sdiseaseinwomen.**Judgingwhoissmarterismuchmorecomplexthanfindingoutwhohasthelargestbrain第40頁(yè)/共145頁(yè)

（7）theNationalInstituteofMentalHealthandNeurosciences(NIMHAN)brainbankisIndia’sonlybrainbank,whichwassetupin1995,andhasoverhundredsamples（8）TheBrainTumourTissueBank,locatedinLondon,Ont.,isfundedbytheBrainTumourFoundationofCanada

（9）

.uk/bba_news.html自閉癥：autism第41頁(yè)/共145頁(yè)(10)國(guó)內(nèi)腦庫(kù)我國(guó)首家人腦庫(kù)2002年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)舉行了掛牌儀式2004年2月，香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院和中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院正式簽定協(xié)議，兩校正式聯(lián)合建立國(guó)內(nèi)腦組織庫(kù)第42頁(yè)/共145頁(yè)(7)國(guó)內(nèi)腦庫(kù)/中國(guó)人腦庫(kù)中心(ChineseBrainBankCenter，CBBC)：2004年起開(kāi)始籌建，在國(guó)家自然科學(xué)基金的首次資助下，經(jīng)過(guò)三年多時(shí)間的籌備，于2007年正式啟動(dòng)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系和中南民族大學(xué)武漢神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)工程研究所聯(lián)合管理和運(yùn)作目標(biāo)：在國(guó)內(nèi)建立一個(gè)達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的中國(guó)人腦庫(kù)中心，為相關(guān)研究收集人死亡后腦組織

第43頁(yè)/共145頁(yè)(8)國(guó)內(nèi)腦庫(kù)CBBC制定了樣本的選擇、腦解剖、腦組織的固定和儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)化管理程序，同時(shí)通過(guò)與同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系的合作，突破了人腦來(lái)源短缺問(wèn)題每年可以收集包括腦損傷、中毒、自殺、抑郁癥、糖尿病和高血壓等人腦150～200例，特別是在收集年輕的人腦組織具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)目前，已建立起有1200多個(gè)人腦的標(biāo)本庫(kù)(2012)第44頁(yè)/共145頁(yè)

盡管如此，由于我國(guó)千百年來(lái)的喪葬習(xí)俗和保留全尸的傳統(tǒng)觀念根深蒂固，加上很多人對(duì)器官捐獻(xiàn)和人腦庫(kù)的價(jià)值缺乏認(rèn)識(shí)，因此目前都普遍存在著人腦獲取上的困難，造成了中國(guó)腦科學(xué)的研究不得不借用外國(guó)人腦庫(kù)的腦組織，

而中國(guó)人腦與歐洲、美洲人腦存在差異武漢每年需求千具遺體，但是12年遺體捐獻(xiàn)僅500多例腦庫(kù)成立五年僅有兩例新生兒腦組織

其中一例：沈毛毛出生僅6天，“看了一眼這個(gè)世界，就離開(kāi)了”，因高膽紅素血癥、腸閉鎖等引發(fā)的呼吸循環(huán)衰竭

第45頁(yè)/共145頁(yè)腦庫(kù)標(biāo)本的不足

①標(biāo)本很難得②其中的蛋白不同程度地降解：不同個(gè)體腦死亡后送到腦庫(kù)的時(shí)間不同；越長(zhǎng)者，標(biāo)本質(zhì)量越差—其間會(huì)出現(xiàn)與疾病無(wú)關(guān)的腦組織內(nèi)蛋白質(zhì)的降解等，從而影響了蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果的可靠度③雖然尸腦組織適合對(duì)不同的腦區(qū)進(jìn)行直接分析，但無(wú)法動(dòng)態(tài)研究，故而難以確定造成蛋白質(zhì)表達(dá)變化的始動(dòng)因素第46頁(yè)/共145頁(yè)腦庫(kù)標(biāo)本的不足④干擾因素多：不同的(疾病)終末狀態(tài)，如不同的合并癥或老年化狀態(tài)、不同的用藥情況等⑤腦組織中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì),可能在腦脊液或血液中檢測(cè)不到，因此不能作為診斷標(biāo)志物，限制了臨床應(yīng)用⑥腦組織本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同一小區(qū)的細(xì)胞類(lèi)型也多。對(duì)此，已有一些針對(duì)性的措施，如：

第47頁(yè)/共145頁(yè)研究方法進(jìn)展近年來(lái)，采用激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)技術(shù)可以在顯微鏡下快速、準(zhǔn)確地獲取所需的單一細(xì)胞亞群，甚至單個(gè)細(xì)胞，從而成功地解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性的問(wèn)題，使得能夠確切地分析某一特定類(lèi)型的細(xì)胞；還發(fā)展了免疫-LCM免疫共沉淀：先選擇性純化相應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)，再對(duì)后者進(jìn)行組學(xué)研究第48頁(yè)/共145頁(yè)Immuno-lasercapturemicrodissection

offrozenprolactioma（泌乳素瘤）

sectionstoprepareproteomicsamples

ColloidsSurfBBiointerfaces.2009Jul1;71(2):187-93.

LiuY,WuJ,LiuS,ZhuangD,WangY,ShouX,ZhuJ.ShanghaiNeurosurgicalCenter,DepartmentofNeurosurgery,HuashanHospital,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200040,China.LCMtechnologycombinedwithimmunohistochemistry(immuno-LCM)

isavaluabletooltoobtainspecifictargetcellpopulationsandthereforethistechniqueenablesmoreaccurateproteomicprofile.Inthisstudy,

morepureprolactincells

couldbe

isolatedandprepared

forfurther

proteomicanalysis

fromeithernormalhumanpituitaryorprolactioma.

第49頁(yè)/共145頁(yè)P(yáng)roteomicsanalysisof

immuno-precipitated

synapticproteincomplexes

JProteomics.2009Feb15;72(1):82-90.KlemmerP,SmitAB,LiKW.DepartmentofMolecularandCellularNeurobiology,CenterforNeurogenomicsandCognitiveResearch,VUUniversityAmsterdam,DeBoelelaan1085,1081Amsterdam,TheNetherlands.

Synapsesarekeyneuronalelementsofthebrain....Asynapseisconsideredasthemostcomplexcellularorganelleconsistingofapproximately1500ofproteinsthatareinteractinginanactivitydependentmanner.Wehaveinitiated

aseriesofimmuno-precipitationexperimentsinconjunctionwithLC-MS/MSanalysis

inordertogainbetterinsightintotheorganizationofthesynapse.

第50頁(yè)/共145頁(yè)2)腦脊液（Cerebrospinalfluid,CSF）生理態(tài)：含極微量的蛋白質(zhì)

80％自血液濾過(guò)，20％為大腦分泌，包括腦室周?chē)鶦NS組織表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)CSF蛋白

其組成可反映腦組織的代謝活動(dòng)和CNS的病理過(guò)程，即在疾病時(shí)，CSF中蛋白質(zhì)可發(fā)生不同程度的質(zhì)變和量變患CNS疾病時(shí)，常常通過(guò)作腰椎穿刺采集CSF檢查，以協(xié)助診斷

第51頁(yè)/共145頁(yè)CSF也是神經(jīng)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究的好材料不足：**疾病特異的蛋白質(zhì)在CSF中的濃度很低（需要在2-DE前進(jìn)行CSF蛋白質(zhì)的預(yù)分離，以富集低豐度蛋白質(zhì)

目前采用的方法包括親和色譜、反相高效液相色譜和液相等電聚焦方法，以提高低豐度蛋白質(zhì)的檢出率）**不能實(shí)現(xiàn)定位、定時(shí)研究?jī)?yōu)勢(shì)：*可從活體獲得*從中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物可用于臨床診斷、治療監(jiān)測(cè)等*蛋白種類(lèi)少

1500+（血液有4000+），易于研究和建立數(shù)據(jù)庫(kù)，等第52頁(yè)/共145頁(yè)3）細(xì)胞間液即神經(jīng)細(xì)胞之間的體液，其蛋白來(lái)源包括神經(jīng)細(xì)胞分泌和血液濾過(guò)獲取方法：微透析技術(shù)（microdialysis），微創(chuàng)的、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)組織器官活性物質(zhì)（如神經(jīng)遞質(zhì)）變化的方法，為活體、實(shí)時(shí)、定位地尋找腦的特異標(biāo)志物提供了可能第53頁(yè)/共145頁(yè)第54頁(yè)/共145頁(yè)3）細(xì)胞間液

該技術(shù)中的透析膜阻隔了體液中大量的蛋白、酶、免疫相關(guān)因子，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)取樣與純化兩個(gè)目的，從而使對(duì)小分子多肽的檢測(cè)成為可能

該技術(shù)20世紀(jì)80年代已被用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，近年來(lái)也開(kāi)始用于臨床，是一種有效而又安全先進(jìn)的監(jiān)測(cè)手段，可指導(dǎo)臨床治療

特點(diǎn)：微創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、定位

不足：有創(chuàng)第55頁(yè)/共145頁(yè)4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型##實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的主要類(lèi)型

①疾病動(dòng)物模型

②基因敲除動(dòng)物模型③轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，等第56頁(yè)/共145頁(yè)4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（1）小鼠

①暴露于百草枯和乙撐雙二硫化氨基甲酸鎂環(huán)境因素下，可建立小鼠的PD的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

②快速老化敏感小鼠8:常作為研究AD的一種模型

③強(qiáng)黑質(zhì)毒素(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,MPTP）小鼠模型：是PD的模型。它能夠通過(guò)血液和BBB，然后代謝成有毒代謝產(chǎn)物MPP+，并被多巴胺能神經(jīng)元攝取，繼而抑制線粒體電子運(yùn)輸鏈的I型復(fù)合物，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡

但是，它不能形成嗜酸性包涵體（Lewy小體）----PD的特征性病理改變第57頁(yè)/共145頁(yè)（2）大鼠：用于復(fù)制腦缺血、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、癲癇、PD、AD等多種動(dòng)物疾病模型最近也誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（3）長(zhǎng)爪沙鼠：size介于大、小鼠之間，也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的常用動(dòng)物。用于腦炎、脊髓灰質(zhì)炎的研究；其腦底動(dòng)脈環(huán)后交通支缺損，很容易建立腦缺血模型；還具有類(lèi)似人的自發(fā)性癲癇發(fā)作的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)選擇飼養(yǎng)其易感性可接近100%，故可建立理想的癲癇動(dòng)物模型

第58頁(yè)/共145頁(yè)（4）豬

人類(lèi)亨廷頓舞蹈癥HD的轉(zhuǎn)基因豬模型

(2010年)此前，用于HD研究的動(dòng)物模型主要是嚙齒類(lèi)（大鼠、小鼠）。由于在生理、代謝等各個(gè)方面與人類(lèi)差別巨大，嚙齒類(lèi)模型還存在一些與人類(lèi)疾病癥狀不一致的表現(xiàn)，這對(duì)于病理的研究、特別是一些治療藥物和手段的研究非常不利中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員賴(lài)良學(xué)與美國(guó)愛(ài)默瑞大學(xué)教授李曉江合作，在南方醫(yī)科大學(xué)教授顧為望協(xié)助下，采用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)成功獲得了人類(lèi)HD的轉(zhuǎn)基因豬模型同時(shí)，首次在轉(zhuǎn)基因豬大腦中發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)HD患者腦中類(lèi)似的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象第59頁(yè)/共145頁(yè)（5）獼猴：非人靈長(zhǎng)類(lèi)在生物學(xué)、遺傳學(xué)和行為學(xué)等方面與人類(lèi)的高度相似性，使之成為人類(lèi)疾病理想的、甚至是不可替代的動(dòng)物模型，在治療、藥理藥效的臨床前安全評(píng)價(jià)致關(guān)重要，因此是生物醫(yī)學(xué)研究中極為珍貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

研究結(jié)果與臨床多相符合，但價(jià)格高昂，難以進(jìn)行廣泛的研究

獼猴在神經(jīng)科學(xué)研究中的經(jīng)典應(yīng)用：即利用恒河猴建立了PD動(dòng)物模型，并用此模型誕生了一個(gè)治療方法，即將腎上腺內(nèi)多巴胺生成細(xì)胞移植到患病動(dòng)物大腦皮層內(nèi)，取得明顯效果第60頁(yè)/共145頁(yè)人類(lèi)疾病的轉(zhuǎn)基因猴（2010，昆明）由于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物較長(zhǎng)的生殖和生育周期，故建立其轉(zhuǎn)基因模型較為困難昆明動(dòng)物研究所獲得轉(zhuǎn)基因猴標(biāo)志著昆明動(dòng)物研究所在非人靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究方面達(dá)到了世界領(lǐng)先水平，這為未來(lái)人類(lèi)重大疾病的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)

季維智選定的下一個(gè)攻堅(jiān)目標(biāo)是：培育PD轉(zhuǎn)基因獼猴

/ypen/20101110/80590.html一雌一雄第61頁(yè)/共145頁(yè)4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

優(yōu)勢(shì)適合動(dòng)態(tài)觀察，重復(fù)性好適合發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選等

不足臨床表現(xiàn)和病理改變都難以完全模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)變性疾病的發(fā)生呈一緩慢進(jìn)展的過(guò)程，而目前采用的動(dòng)物模型基本均為急性發(fā)病。因此應(yīng)謹(jǐn)慎地解釋由此獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果不能直接用于人類(lèi)，需要在人類(lèi)的組織和體液上驗(yàn)證第62頁(yè)/共145頁(yè)2阿爾茨海默?。ˋlzheimerDisease，AD)

的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2-1AD概述

1）概況：是老年人最常見(jiàn)的退行性神經(jīng)疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能全面減退為臨床特征，早期表現(xiàn)為漸進(jìn)性的記憶障礙，尤其近期記憶障礙，繼而各種認(rèn)知功能全面受損，晚期則智力嚴(yán)重衰退，生活完全不能自理是一種多基因遺傳病

父母或兄弟中有AD患者，則其患AD的可能性高出無(wú)家族史者4倍患病率隨年齡增加而上升

*65-74歲為3%，75-84歲為19%，85歲以上為47%

第63頁(yè)/共145頁(yè)

2-1AD概述據(jù)中國(guó)AD協(xié)會(huì)估計(jì)（2011）:

目前全球有3650萬(wàn)AD病人，并以每7秒鐘新增一名患者的速度遞增2015年，一對(duì)夫妻面對(duì)的4位80歲以上的老人中將有一位是AD患者中國(guó)目前患者人數(shù)600-1000萬(wàn)

2030年，我國(guó)AD患者可達(dá)1500萬(wàn)

每年的9月21日是“世界老年癡呆日”

第64頁(yè)/共145頁(yè)2-1AD概述AloisAlzheimer（1986－1915）RonaldReagan（1911-2004）1910年命名該病第65頁(yè)/共145頁(yè)前美國(guó)總統(tǒng)里根的妻子南茜目睹丈夫生病的痛苦后感概地說(shuō)：“這可能是世界上最可怕的疾病……因?yàn)闊o(wú)法與之溝通和分享自己的感受。”

記憶化作流沙，親人變得陌生，心智有如孩童，世界重新歸零——對(duì)于老年癡呆癥患者來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)幻妙的過(guò)程；而對(duì)于身旁的親人來(lái)說(shuō)，是不可逆的挑戰(zhàn)里根在1994年被確診患上老年癡呆癥后，就在年底公開(kāi)了自己的病情，以自己的知名度喚起全世界對(duì)這種病的關(guān)注。1983年，里根在擔(dān)任總統(tǒng)時(shí)就簽署法令，將每年的11月定為全國(guó)老年癡呆月，而1995年成立的里根和南茜研究所，也專(zhuān)門(mén)研究該疾病。2004年6月5日，里根在與老年癡呆癥抗?fàn)幜?0年以后，以93歲的高齡去世

美國(guó)AD協(xié)會(huì)資深副主席凱恩說(shuō)：“里根為戰(zhàn)勝AD做出了兩項(xiàng)最大貢獻(xiàn)：一是極大地提高了公眾對(duì)AD的認(rèn)識(shí)；二是使人們勇于公開(kāi)談?wù)撨@種疾病。里根的勇氣鼓舞了成千上萬(wàn)的患者?！?/p>

第66頁(yè)/共145頁(yè)基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展HGP時(shí)代：13年+30億美元2007年：

2年+近100萬(wàn)美元（JamesWatson）

Watson授權(quán)454生命科學(xué)公司在測(cè)序完成后公開(kāi)他的基因組排序，但要保密一部分基因信息。如，他不想知道自己的ApoE基因是否變異。因?yàn)樵摶蜃儺愂穷净祭夏臧V呆癥的標(biāo)志Now：

1天+1000美元IonProton臺(tái)式基因組測(cè)序儀第67頁(yè)/共145頁(yè)患AD的又一名人英國(guó)前首相威爾遜：在1964～1970年和1974～1976年4月間，兩度擔(dān)任英國(guó)首相正當(dāng)政治生涯如日中天的時(shí)候，卻在1976年3月做出震驚全國(guó)的決定，辭去首相的職務(wù).WHY?因?yàn)檫@時(shí)他已感受到AD的影響，記憶力衰退，難以集中精神處理政務(wù)

辭職不久，他的病就被確診；1995年病逝，享年79歲第68頁(yè)/共145頁(yè)2009年12月10日，在頒獎(jiǎng)儀式上，瑞典國(guó)王向華裔科學(xué)家-光纖之父高錕（左）頒獎(jiǎng)77歲；2004年診斷患老年癡呆第69頁(yè)/共145頁(yè)

高錕1933年生于上海，1949年隨家前往香港；1954年赴英國(guó)倫敦大學(xué)攻讀電機(jī)工程，并于1957年及1965年獲學(xué)士和哲學(xué)博士學(xué)位。1987年10月，高錕從英國(guó)回到香港，并出任香港中文大學(xué)第三任校長(zhǎng)。高錕于1996年當(dāng)選為中國(guó)科學(xué)院外籍院士。2004年，高錕被診斷患有AD因擔(dān)心他忘記領(lǐng)獎(jiǎng)路徑而在領(lǐng)獎(jiǎng)后不能順利返回得獎(jiǎng)?wù)呶恢?，從而致?chǎng)面尷尬令高錕不安，瑞典國(guó)王特地為高錕安排特別的頒獎(jiǎng)程序--破例親自走到他面前，向他頒獎(jiǎng)。高錕向國(guó)王說(shuō)了一句“謝謝”，然后回到自己座位上就座

同時(shí)，由太太以“古沙遞捷音”為題代其演說(shuō)。她表示，丈夫未能親自演講，非常遺憾，但他為獲諾貝爾基金會(huì)肯定其成就感到自豪，全家亦為他深感榮幸第70頁(yè)/共145頁(yè)第71頁(yè)/共145頁(yè)

2-1AD概述病因不明,發(fā)病機(jī)制不清，女性多于男性診斷：主要靠臨床表現(xiàn)，缺乏有效的特異標(biāo)志物，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，因而延誤治療尚無(wú)有效的治療方法多數(shù)AD患者3～15年死亡（平均8年）；是全球致死疾病的第四位（腫瘤、心臟病和腦血管病）醫(yī)療費(fèi)用高：在美國(guó)的醫(yī)療支出中，占首位第72頁(yè)/共145頁(yè)AD發(fā)病率女性高于男性第73頁(yè)/共145頁(yè)2-1AD概述2）病理特征大腦皮層（顳葉和額葉）

（1）萎縮：N元異常丟失或死亡、突觸丟失和空泡變性等

（2）膠質(zhì)增生

（3）神經(jīng)元外：老年斑（senileplaque,SP），其主要成分是β-淀粉樣蛋白（Amyloidβ,Aβ）

（4）神經(jīng)元內(nèi)：神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangle,NFT），是過(guò)度磷酸化的tau蛋白聚集而成tau蛋白：是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的低分子量含磷的糖蛋白第74頁(yè)/共145頁(yè)APP蛋白：是β-淀粉樣物質(zhì)（Aβ）的前體蛋白（基因在21號(hào)染色體上），是一種廣泛存在于全身諸多組織細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，Aβ位于APP的疏水部分，在細(xì)胞膜內(nèi)部，APP通過(guò)降解生成Aβ（Aβ1-40，Aβ1-42）Aβ1-42具有很強(qiáng)的自聚性，形成以后如不能及時(shí)清除，則很快形成極難溶解的沉淀。第75頁(yè)/共145頁(yè)

關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制，目前主要的學(xué)說(shuō)

β淀粉樣蛋白(Aβ)

假說(shuō)：

凝聚態(tài)Ａβ在腦實(shí)質(zhì)的異常沉積是發(fā)病的核心因素它啟動(dòng)病理級(jí)聯(lián)（cascade），包括

：1）影響G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；2）氧自由基代謝紊亂進(jìn)而損害神經(jīng)元膜性結(jié)構(gòu)等，終致---

神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT，tau)、神經(jīng)元死亡

進(jìn)而呈癡呆表現(xiàn)

SO，清除或減少Aβ形成是眾多新藥的目標(biāo)第76頁(yè)/共145頁(yè)

2-2AD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1）概況2）發(fā)病機(jī)制的研究及進(jìn)展3）臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)4）AD治療藥物的研究第77頁(yè)/共145頁(yè)2-2AD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1）概況：組學(xué)的“全景全息式+動(dòng)態(tài)性”改變了既往的疾病研究模式和方法

（1）腦組織是AD發(fā)生發(fā)展的重要場(chǎng)所

對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過(guò)分析差異蛋白與糖代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)介質(zhì)等的關(guān)系，可揭示AD發(fā)病機(jī)制和藥物靶點(diǎn)（2）比較疾病狀態(tài)與正常的腦組織/CSF/血液中的蛋白質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)與AD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的特異性蛋白，為實(shí)現(xiàn)AD的客觀診斷(尤其早期診斷)提供依據(jù)

早期診斷和有效地治療可延緩/阻斷病程的進(jìn)展第78頁(yè)/共145頁(yè)2）AD發(fā)病機(jī)制的研究及進(jìn)展（1）氧化損傷

蛋白羰基化酪氨酸硝基化（2）磷酸化（3）異常剪接（4）AD的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究第79頁(yè)/共145頁(yè)2）AD發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

（1）氧化損傷氧化應(yīng)激是當(dāng)體內(nèi)活性氧的生成與清除平衡狀態(tài)被打破所致的氧自由基（ROS）增加的過(guò)程當(dāng)活性氧濃度超過(guò)生理限度時(shí)，就會(huì)損傷生物大分子，包括脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA的氧化損傷、蛋白質(zhì)的氧化和單糖氧化等氧化后的蛋白質(zhì)功能降低對(duì)AD患者或動(dòng)物模型特異腦區(qū)內(nèi)蛋白質(zhì)氧化水平的研究發(fā)現(xiàn)，在腦內(nèi)可檢測(cè)出的數(shù)千種蛋白質(zhì)中，一些特定蛋白質(zhì)的氧化程度是正常的2～10倍(見(jiàn)附表)

第80頁(yè)/共145頁(yè)

最近報(bào)道的AD腦內(nèi)氧化損傷的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)

第81頁(yè)/共145頁(yè)（1）氧化損傷這些蛋白廣泛參與AD的各個(gè)病理環(huán)節(jié)，并在其中發(fā)揮重要作用

包括：能量代謝、興奮性毒性、神經(jīng)元生長(zhǎng)及通訊

突觸可塑性、蛋白質(zhì)折疊、組裝及水解等AD腦中的氧化損傷機(jī)制可能是以其中某幾種特定蛋白質(zhì)的氧化損傷為始動(dòng)環(huán)節(jié)的目前對(duì)于蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測(cè)指標(biāo)主要有兩個(gè)

①蛋白羰基化

②酪氨酸硝基化第82頁(yè)/共145頁(yè)①蛋白羰基生成（羰基化）是指蛋白質(zhì)氨基酸殘基側(cè)鏈中的氨基（亞氨基）受到氧自由基攻擊，最后轉(zhuǎn)變成醛基,并釋放NH3的過(guò)程

檢測(cè)蛋白質(zhì)特異氧化的有力工具：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)+氧印跡

(2D-Oxyblot)

步驟：用2，4-二硝基苯肼法(DNP)標(biāo)記含有羰基的氧化蛋白質(zhì)→2-DE→用Anti-DNP行免疫印跡（Oxyblot）→質(zhì)譜鑒定與該Ab結(jié)合的蛋白質(zhì)→發(fā)現(xiàn)與AD相關(guān)的氧化蛋白質(zhì)和實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白羰基化程度的特異檢測(cè)

為探討AD發(fā)病機(jī)制及研發(fā)其治療藥物提供有價(jià)值的線索第83頁(yè)/共145頁(yè)

②酪氨酸硝基化

NO+超氧化物→過(guò)氧化亞硝酸鹽→蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)（nitration），是蛋白質(zhì)的不可逆損傷，進(jìn)而功能喪失

雖然疾病中蛋白質(zhì)硝基化的特異性靶點(diǎn)還不清楚，但大量研究顯示：

1）AD腦中蛋白質(zhì)硝基化水平增加

2）氮氧自由基對(duì)蛋白質(zhì)的相關(guān)修飾與神經(jīng)退行性疾病間

有著密切的聯(lián)系

第84頁(yè)/共145頁(yè)例如：

**α-突觸核蛋白（a-synuclein）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前表達(dá)的可溶性蛋白**其硝基化→錯(cuò)誤折疊→形成具有神經(jīng)細(xì)胞毒性的聚集物→通過(guò)一系列的氧化應(yīng)激等生化反應(yīng)→神經(jīng)元的毒性作用→從而參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，包括AD、帕金森病、路易體癡呆（Lewybody）和多系統(tǒng)萎縮等第85頁(yè)/共145頁(yè)（2）磷酸化：絲/蘇/酪氨酸是磷酸化的主要位點(diǎn)

“蛋白質(zhì)組學(xué)+酵母雙雜交”顯示：

位于胞內(nèi)的APP蛋白C末端Tyr682磷酸化后，可與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)特異結(jié)合，導(dǎo)致Ras及MAPK等下游信號(hào)通路活化此可能是AD腦中tau蛋白過(guò)度磷酸化的機(jī)制之一APP蛋白：是β-淀粉樣物質(zhì)（Aβ）的前體蛋白，是一種廣泛存在于全身諸多組織細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，Aβ位于APP的疏水部分，在細(xì)胞膜內(nèi)部，APP通過(guò)降解生成Aβ，Aβ具有很強(qiáng)的自聚性，形成以后如不能及時(shí)清除，則很快形成極難溶解的沉淀。第86頁(yè)/共145頁(yè)蛋白c-Abl與AD(2011-5-31)Davies博士等發(fā)現(xiàn)蛋白c-Abl：是AD大腦中老年斑塊和纖維纏結(jié)的一部分是一種酪氨酸激酶，參與細(xì)胞分化、分裂和粘附

慢性髓細(xì)胞樣白血病（CML）的病人B細(xì)胞出現(xiàn)蛋白c-Abl。采用抗癌藥格列衛(wèi)(Gleevec)抑制c-Abl的活性，能阻止細(xì)胞分裂

&&該激酶能磷酸化在疾病形成過(guò)程中堆積在神經(jīng)元內(nèi)部的tau蛋白&&激活c-Abl會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞周期和殺死成年細(xì)胞，尤其是在海馬狀突起中&&格列衛(wèi)在CML中起作用，但是它不能跨越BBB，因此它無(wú)法在腦內(nèi)發(fā)揮作用Davies博士等正在尋找其它的在抑制c-Abl的同時(shí)也能進(jìn)入大腦中的藥物第87頁(yè)/共145頁(yè)（3）異常剪接

“蛋白質(zhì)組學(xué)+Westernblot”顯示：

AD的早、中和晚期均有60%的Aβ的N端被剪切，其產(chǎn)生的Aβ1～42是形成寡聚體的主要成分提示：N端剪切修飾在Aβ變性中發(fā)揮重要作用

第88頁(yè)/共145頁(yè)

（4）AD的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Kim等在進(jìn)行AD患者腦區(qū)線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)AD患者

：

*腦顳葉的輔酶Q-細(xì)胞色素C氧化還原酶(即呼吸鏈中的復(fù)合物Ⅲ)的核心蛋白1顯著下降

*而線粒體呼吸酶的減少可能與AD腦能量代謝損傷、活性氧(ROS)的生成及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)

第89頁(yè)/共145頁(yè)3)AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

**AD診斷金標(biāo)準(zhǔn)：

尸檢的神經(jīng)病理學(xué)改變**要實(shí)現(xiàn)生存狀態(tài)下AD的早期診斷、準(zhǔn)確分期以及療效的監(jiān)測(cè)，需尋找足夠特異和敏感的標(biāo)志物第90頁(yè)/共145頁(yè)3)AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

（1）AD患者CSF蛋白質(zhì)組的研究發(fā)現(xiàn)

（2）AD患者血漿/血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

相對(duì)于CSF，外周系統(tǒng)的檢測(cè)更簡(jiǎn)單易行，更易為病人接受

Itwillbeimportanttodevelop

"non-invasive"

markersutilizingreadilyobtainabletissue

samplessuchasserumorurineto

monitordiseaseprogression(or

hopefullyregression).第91頁(yè)/共145頁(yè)3)AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

CSF：能夠較安全地通過(guò)腰椎穿刺獲得病人的樣品，但是健康志愿者的樣本獲取依然受限

對(duì)AD患者CSF中蛋白質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)了一系列蛋白質(zhì)的改變(見(jiàn)附表)

第92頁(yè)/共145頁(yè)AD患者CSF中特異改變的蛋白質(zhì)第93頁(yè)/共145頁(yè)**Davidsson等（2002）的研究結(jié)果

AD組患者CSF中共有37個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)至少2倍（較正常對(duì)照組）其中分離鑒定出：α-2-HS糖蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白和β2-微球蛋白**Puchades等（2003）研究發(fā)現(xiàn)

AD患者CSF中表達(dá)下調(diào)：激肽原、α1-β糖蛋白、載脂蛋白-J、E和A-I、β-痕量蛋白和視黃醇結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)：α1-AT第94頁(yè)/共145頁(yè)Sihlbom等（2008）GlycoproteinsinCSFarealteredinADpatientscomparedtocontrolindividuals.Wehaveutilizedalbumindepletionpriorto

2DE

toenhanceglycoproteinconcentration.Aquantitativecomparisonofgel-separatedglycoproteinisoformsfrom12ADpatientsand12controlsubjectswasperformedwithglycoprotein-specificandtotalproteinstains.WehavealsocomparedglycoformsinpooledCSFobtainedfromADpatientsandcontrolsubjectswith

massspectrometry.

結(jié)果：1）α1-AT的一種類(lèi)型的糖基化程度下降

2）α1-AT的表達(dá)水平下調(diào)3）一種未鑒定的蛋白的糖基化型上調(diào)

4）載脂蛋白E和簇蛋白上調(diào)

5）沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AD特異的糖型第95頁(yè)/共145頁(yè)Carrette等（2003）采用SELDI-TOF-MS

比較9例AD患者和10例正常對(duì)照者的CSF，發(fā)現(xiàn)：1）AD患者CSF中表達(dá)有改變的蛋白：胱抑素C(cystatinC)、β-微球蛋白的2種異構(gòu)體、神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白VGF以及1個(gè)MW為7.70×103的多肽2）聯(lián)合應(yīng)用這5種生物學(xué)標(biāo)志物診斷AD，其特異度為100％、敏感度為66％&&&&&不過(guò)，尚需在更大的臨床樣本中進(jìn)一步證實(shí)第96頁(yè)/共145頁(yè)**臨床表現(xiàn)類(lèi)似疾病的鑒別診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)CSFbiomarkersinfrontotemporallobardegeneration（FTLD，額顳葉失智癥)withknownpathology（2008）Background—ItisimportanttodistinguishFTLDfromotherneurodegenerativediseaseslikeAD,butthismaybedifficultclinicallybecauseofatypicalpresentations.Conclusions—TheratioofCSFtau/Aβ42

isasensitiveandspecificbiomarkeratdiscriminating

FTLDfromAD

inpatientswithknownpathology.第97頁(yè)/共145頁(yè)3)AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)下表中所列，是AD可能的標(biāo)志物（2個(gè)或更多的獨(dú)立研究中同時(shí)報(bào)道的）Notably,the

overlap

betweenthesetwostudiesintheidentifiedpossiblebiomarkersis

low.甚至，其中一些結(jié)果也是矛盾的

例如：

不同研究中，前列腺素D合成酶或上調(diào)，或下調(diào)第98頁(yè)/共145頁(yè)ZetterbergH,etal.ActaNeurolScand2008:118:1–11第99頁(yè)/共145頁(yè)Theinternationalproteinindex(IPI)providesaguidetothemaindatabasesthatdescribethehumanproteome:Ensembl,SWISS-PROT?TrEMBLandRefSeq(/IPI/).↑：upregulatedinAD;↓：downregulatedinAD;–,nodifference.第100頁(yè)/共145頁(yè)3)AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)（2）AD患者血漿/血清等的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

血液：易獲得，是進(jìn)行大樣本量臨床研究較理想的樣品，也是臨床診斷更容易接受的樣品；但，

Themajorchallengesinminingtheplasmaproteomeare

that

anybiomarkerforabraindiseaseisdilutedatleasta30-folduponcrossingtheblood–brainbarrier,andthat

abundantplasmaproteins,suchasalbuminandimmunoglobulins,produceaveryhighbackground

明顯影響著低豐度蛋白的檢出，尤其在傳統(tǒng)的2D電泳中

第101頁(yè)/共145頁(yè)3）AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)**Yu等發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中鑒定出9個(gè)糖蛋白--鐵傳遞蛋白、血紅素蛋白和α1-胰島素的亞型**Liu等發(fā)現(xiàn)在AD患者血清中ApoA-I水平顯著降低，認(rèn)為血清中ApoA-I

低表達(dá)可能是AD的潛在標(biāo)志**Choi等研究血漿，發(fā)現(xiàn)7個(gè)主要的氧化蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為纖維蛋白原γ鏈前體蛋白質(zhì)的亞型和α1-胰島素前體的亞型。此研究顯示：這些蛋白質(zhì)的氧化亞型可望成為AD的標(biāo)志物第102頁(yè)/共145頁(yè)3）AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)第103頁(yè)/共145頁(yè)3）AD臨床標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

但是，這些標(biāo)志物的疾病特異性和敏感性并未滿足需要；因此提出聯(lián)合分析2～3個(gè)標(biāo)志物以提高診斷的特異性和敏感性。例如：

AtripletofbiomarkersforAD,

totalandhyperphosphorylatedtau（↑）andAβ42（↓）inCSF,hasalreadybeenestablishedfor

earlydetectionofADbefore

theonsetofdementiaand

distinguishingADfrom

otherdementiasintheearlystages.第104頁(yè)/共145頁(yè)4）AD治療藥物的研究

由于AD的發(fā)病機(jī)制至今未明，AD的治療一直是臨床醫(yī)生最棘手的問(wèn)題目前治療的目標(biāo)：改善癥狀，延緩其進(jìn)展目前應(yīng)用的藥物：非特異的

膽堿能替代藥物、腦細(xì)胞代謝激活劑、腦循環(huán)促進(jìn)劑、鈣離子拮抗劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗氧化劑等

新興的療法：抗炎藥，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增生，干擾老年斑的形成，延緩AD，但是副作用較大，還在進(jìn)一步的研究中

第105頁(yè)/共145頁(yè)4）AD治療藥物的研究

關(guān)鍵是尋找AD藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)

靶點(diǎn)即AD發(fā)病的關(guān)鍵蛋白，其發(fā)現(xiàn)將為抗AD藥物的研制指明方向

功能基因組學(xué)的研究認(rèn)為：

**人類(lèi)每種疾病平均與10個(gè)左右的基因相

**每種基因又可能與3～10種蛋白質(zhì)有關(guān)因此，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展必將會(huì)為AD的治療提供更加豐富的藥靶第106頁(yè)/共145頁(yè)基因治療針對(duì)Aβ和TAU治療-疫苗抗炎治療抗氧化治療神經(jīng)保護(hù)藥物對(duì)癥治療第107頁(yè)/共145頁(yè)4)AD治療藥物的研究

例如：尋找可阻止淀粉樣蛋白聚集或溶解已聚集的蛋白等的作用靶點(diǎn)

對(duì)此靶點(diǎn)，在研的方向之一就是疫苗

既然AD顯著的病變是異常蛋白質(zhì)的積聚，那設(shè)法抑制或清除這些異常的蛋白在腦內(nèi)的積聚~~

疫苗治療產(chǎn)生特異的抗體可抑制Aβ的集