血漿總蛋白的測定及白球比例的測定課件

血清總蛋白的測定及白球的含量比雙縮脲法和溴甲酚綠法小組成員：付德華程耀鋒萬育林黃亞趙維琦血液·血漿·血清血液包括血漿和血細胞血漿是血液的重要組成部分，為淡黃色液體血清為血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白后得到的淡黃色透明液體總蛋白測定及白蛋白測定實驗目的：熟悉血清蛋白的測定方法（雙縮脲法）。掌握血清總蛋白測定的臨床意義。進一步鞏固掌握721E型分光光度計的使用。熟悉血清白蛋白的測定方法（溴甲酚綠法）。掌握血清白蛋白的測定和白蛋白和球蛋白的含量比（A/G）測定的臨床意義。

蛋白質分子中含有肽鍵與縮脲結構相似，故也能進行此反應。反應生成紫紅色配合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內與蛋白質的含量成正比關系，故雙縮脲反應可作為蛋白質測定的依據。

雙縮脲反應并非是蛋白質特有的顏色反映！

凡分子內含有2個或2個以上甲?；被?CONH2-）均可呈雙縮脲反映。凱式定氮法測定化合物或混合物中總氮量的一種方法，即在催化劑條件下，用濃硫酸將有機氮轉化為無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，然后用過量的酸液吸收用標準堿滴定，這樣就可以算出樣品中的總氮量。由于一般氮元素質量占蛋白質質量的16%，故樣品中蛋白質含量=含氮量*6.25實驗試劑生理鹽水：NaCl0.9g溶于100ml蒸餾水雙縮脲試劑：硫酸銅3.0g溶于500ml蒸餾水，加酒石酸鉀鈉9.0g,碘化鉀5.0g，完全溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸餾水稀釋到1L，置聚氯乙烯瓶內蓋緊保存。蛋白質標準液：收集混合血清，經凱氏定氮法定值，用作蛋白質標準液。貯于冰箱中備用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。待測血清用生理鹽水1:10稀釋?；靹颍?7℃水浴放置10分鐘，以空白管調零點，在540nm波長處進行比色，分別讀取各管的吸光度。計算公式（P65）實驗原理白蛋白具有與陰離子染料結合的性質，在PH=4.2的環(huán)境中，帶正電荷的白蛋白（PI=4.9）與陰離子染料溴甲酚綠（BCG）結合，由黃色變成藍綠色。藍綠色的深淺與白蛋白的濃度成正比，在波長620納米處有光吸收峰。因此，應用BCG法可以直接測定血清白蛋白的含量。試劑中加入非離子型表面活性劑,可提高蛋白質與染料的結合力和溶解度。試劑1.溴甲酚綠（BCG）貯存液取BCG419mg，用10ml0.1mol/LNaOH溶解，加NaN3100mg，定容至1000mL。貯于棕色瓶備用。如用溴甲酚綠鈉鹽應稱取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2）分別配制0.1mol/L檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，然后按12.3：7.7的體積比例混合。每1000ml混合液加入NaN3100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液取Brij-3530g,加少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG應用液BCG貯存液250ml，0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2)750ml,30%Brij-358ml(也可以用Tween-208ml或Tween-8010ml代替）混合而成。5.標準蛋白溶液（10mg/ml)稱取人白蛋白1.00g，用生理鹽水注意事項1.由于各種血清蛋白質的分子量不同，故其濃度不宜用mol/L表示。2.雙縮脲試劑中酒石酸鉀鈉的作用是絡合銅離子，以維持銅離子在堿性溶液中的溶解性；碘化鉀能防止兩價銅離子還原3.高脂，黃疸及溶血標本應作清空白對照來校正誤差。含脂類極多的血清，加入雙縮脲試劑后會出現混濁，可用乙醚3ml抽提后再進行比色．4.血清白蛋白濃度＞100g/L時，需作稀釋處理，結果乘上稀釋倍數．2.血清白蛋白測定用生理鹽水按1：10的比例稀釋血清，取稀釋后的血清0.2ml加入BCG應用液5.0ml混勻后立即同上比色，讀取光密度，并從標注曲線上查出相應的白蛋白濃度。3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值）用雙縮脲法測定血清標本中的總蛋白濃度，用總蛋白濃度減去白蛋白濃度即得球蛋白濃度，并可求的A/G比值：A/G比值=—————————————白蛋白含量總蛋白含量---白蛋白含量【注意事項】5．BCG是一種PH指示劑，變色域為PH3.8（顯黃色）～5.4（顯藍綠色），因此控制反應液的PH是本法測定的關鍵。6．蛋白質標準液是一個復雜的問題，實驗證明，BCG不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質成分呈色，其中以球蛋白、運鐵蛋白、結合珠蛋白更為顯著，其反應速度較白蛋白稍慢。由于30S內呈色對白蛋白特異，故BCG與血清混合后，在30S內讀取吸光度，可明顯減少非特異性呈色反應。為了減少本法基質效應的影響，最好用參考血清作標準。臨床意義1.清總蛋白生理性波動：長久臥床者比直立活動者約低3～5g/L；新生兒比成人低5～8g/L；60歲以上的老人約比青壯年低2g/L。2.清總蛋白增高：①血液濃縮：腹瀉、嘔吐等。②合成增加：如多發(fā)性骨髓瘤等。3.清總蛋白降低：①血液稀釋：過多注射低滲溶液，各種原因引起的水鈉潴留。②攝入量不足和消耗增加：營養(yǎng)不良、慢性腸胃炎、嚴重結核病等。③合成障礙：肝臟疾病。④蛋白質丟失：嚴重燒傷時大量血漿滲出，腎綜合癥等?！九R床意義】1．血清白蛋白濃度增高，常見于嚴生脫水所致的血漿濃縮2．血清白蛋白濃度降低在臨床上比較重要和常見，通常與總蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要見于大出血和嚴重的燒傷；慢性降低見于腎病蛋白尿，肝功能損傷，腸道腫瘤及結核病伴慢性出血，營養(yǎng)