免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組化技術(shù)

1第一頁，共28頁。1、定義用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)〔immunohistochemistry〕技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)〔技術(shù)〕。2、根本原理根據(jù)抗原抗體反響和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反響，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶〔HRP〕或堿性磷酸酶〔AKP〕等的抗生物素〔如鏈霉親和素等〕結(jié)合，最后通過呈色反響或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反響產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。

2第二頁，共28頁。3、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹1〕免疫熒光方法

利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用較廣。3第三頁，共28頁。2〕免疫酶標(biāo)方法是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后參加酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞外表和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。

本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，比照度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等.。4第四頁，共28頁。4、被檢測的物質(zhì)組織或細(xì)胞中但凡能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。5第五頁，共28頁。5、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術(shù)與Western

blotting、ELISA的異同1〕Western

blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反響原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然Western

blotting也可定性和定位〔通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位〕，但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。2〕ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反響原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。6第六頁，共28頁。免疫酶標(biāo)法下的兩個實(shí)驗流程簡介一、SP三步法1〕石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2〕0.3%或3%H2O2去離子水〔無色液體〕孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。3〕蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4〕候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波〔建議30分鐘內(nèi)4次中火〕、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5〕血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。6〕滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜〔最好復(fù)溫〕。PBS沖洗，3分鐘×5次。

7〕滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30min-1h。8〕PBS沖洗，3分鐘×5次。9〕滴加SP〔鏈霉親和素過氧化物酶〕，室溫或37℃孵育30min~1h。

10〕PBS沖洗，3分鐘×5次。

11〕顯色劑顯色〔DAB等〕。

12〕自來水充分沖洗。

13〕可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明，14〕選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?/p>

7第七頁，共28頁。二、二步法免疫組化染色步驟二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯PBS沖洗3次，每次3分鐘根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)0.3%過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性PBS沖洗、浸泡5分鐘，3次正常山羊血清室溫封閉10分鐘8第八頁，共28頁。甩去血清，參加適當(dāng)稀釋的一抗，37℃孵育60分鐘或4℃過夜PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分鐘PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色3－10分鐘流水沖洗蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察拍照IPP軟件分析光密度DAB-二氨基聯(lián)苯胺是過氧化物酶的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。用于檢測過氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好。是HRP結(jié)合物最常用的底物常在免疫組化,原位雜交,Western

blot等膜顯色或檢測細(xì)胞或組織內(nèi)源性的過氧化物酶中應(yīng)用廣泛。

蘇木素是從洋蘇木中提取的一種染色劑，它在被氧化后生成蘇木精，同媒染劑〔常用的是三價的鐵或鋁的鹽〕一起使用，能夠使細(xì)胞核染色。蘇木素是一種堿性染料。9第九頁，共28頁。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1〕冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否那么組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。2〕組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。3〕血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清〔與二抗來源一致〕封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4〕一抗孵育條件：在免疫組化反響中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最正確；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。5〕二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，假設(shè)是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反響。10第十頁，共28頁。6〕封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。防止產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，那么可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。7〕切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗〔延長時間和增屢次數(shù)〕尤為重要。〔2〕溫柔沖洗，防止切片的脫落。3〕沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。〔4〕PBS的pH和離子強(qiáng)度的使用附和要求。11第十一頁，共28頁。組織與細(xì)胞材料的制備組織石蠟切片制作組織冰凍切片制作細(xì)胞爬片制作細(xì)胞涂片制作12第十二頁，共28頁。切片的制作組織的固定組織石蠟包埋切片13第十三頁，共28頁。目的:〔1〕防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)?！?〕使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與自然狀態(tài)時相仿。防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)?！?〕使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察?！?〕固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制片?！?〕防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)?！?〕經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便

于識別。組織材料的固定14第十四頁，共28頁。固定液的選擇：(1)甲醛固定液：10％福爾馬林，10％中性福爾馬林，10％中性緩沖福爾馬林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改進(jìn)BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑較適合富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，參加2.5%重鉻酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，對核內(nèi)抗原的保存效果較好。(10)PEG液(11)0.4%對苯醌(12)碳二亞酰胺-戊二醛〔ECG-G〕液(13)丙酮及醇類固定劑15第十五頁，共28頁。固定時間：固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原那么上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。16第十六頁，共28頁。大組織：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ過夜，無水乙醇Ⅰ30～60min，無水乙醇Ⅱ30～60min，無水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min〔可視觀察結(jié)果而定〕，石蠟Ⅰ30min石蠟Ⅱ1～2h，石蠟Ⅲ2～3h。小組織：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ過夜或2h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min〔肉眼觀察〕，石蠟Ⅰ30min，石蠟Ⅱ30min，石蠟Ⅲ1～2h。組織石蠟包埋17第十七頁，共28頁。切片載玻片的清潔：市售載玻片需經(jīng)清潔液浸泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開展原位雜交，還需將玻片240℃烤2h。切片粘合劑的使用：

〔1〕多聚賴氨酸〔分子量300KD〕：0.5%濃度。

〔2〕APES試劑〔3-氨基、丙基三氧基硅烷〕干凈載玻片→丙酮5min→用鑷子夾住浸入APES試劑〔1ml+50ml丙酮〕1～3次→純丙酮洗二次→枯燥玻片→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。?〕鉻礬明膠液：鉻礬0.5g明膠5gH2O21000ml〔4〕甲醛明膠液：40％甲醛2.5ml明膠0.5gH2O2100ml18第十八頁，共28頁。切片：

石蠟切片：

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片18h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)編上號

(6)切片可在4℃保存數(shù)年冰凍切片：(1)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)蔗糖處理24h，冰凍切片。(2)冰凍切片后需涼干后立即固定(3)冰凍切片固定后-80℃保存?zhèn)溆?9第十九頁，共28頁。細(xì)胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。待細(xì)胞生長到達(dá)60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。20第二十頁，共28頁。細(xì)胞涂片制作離心將細(xì)胞收集出來，用預(yù)冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細(xì)胞重懸。吸取30－50ul〔可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整〕滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風(fēng)干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞，固定2－4小時。在細(xì)胞上加一層甘油放-20℃保存。21第二十一頁，共28頁。熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)

直接法間接法22第二十二頁，共28頁。本卷須知一、抗體的保存

濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在4℃冰箱內(nèi)，保存時間可達(dá)1-3年。即用型抗體：理論上在4℃冰箱內(nèi)可保存半年左右。PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個月。23第二十三頁，共28頁。二、出現(xiàn)假陽性的原因組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作為判斷陽性的依據(jù)。出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過氧化物酶，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽性反