臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第1頁檢驗誤差發(fā)生率1997年，一位意大利著名檢驗教授對急診檢驗誤差發(fā)生種類和發(fā)生率進行了統(tǒng)計。結(jié)果顯示，約有68.2%檢驗誤差發(fā)生在檢驗前期，而來自檢驗中期和檢驗后期誤差率分別為13.3%和18.5%。年，這位教授又進行了類似統(tǒng)計，結(jié)果顯示，檢驗前期誤差發(fā)生率仍高達61.9%臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第2頁正確采集、運輸、保留臨床標本

主要性質(zhì)量確保關鍵性步驟處理包括試驗室檢驗醫(yī)患糾紛方法之一臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第3頁核酸提取主要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關鍵個別核酸提取成敗關系到臨床PCR檢驗正確是否臨床PCR檢驗操作中最易出問題步驟臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第4頁標本采集標本采集時間對擴增檢測結(jié)果影響（過早或過晚都可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果）

標本采集部位準備（適度消毒）

標本類型和采集量（衣原體上皮細胞）采樣質(zhì)量評價（評價方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學分析）

采樣及運輸容器（一次性無菌器材,防腐劑,抗凝劑）

標本采集中防污染（一次性無菌容器，預防混入操作者頭發(fā)，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌）

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第5頁標本運輸

樣本一經(jīng)采集，則應盡可能快送至檢測試驗室。樣本中如加入了適當穩(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC血清(漿)樣本和用于DNA測定EDTA抗凝血等,則可在室溫下運輸或郵寄。試驗室應依據(jù)待測靶核酸特征，對各種臨床樣本運輸條件作出對應要求。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第6頁臨床標本處理和保留血清（漿）全血外周血單個核細胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第7頁血清（漿）DNA測定，可按照普通血清標本處理程序，對測定影響不大。RNA測定，標本獲取和保留方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(禁止使用肝素，因其對PCR擴增有抑制，且極難在核酸提取過程中完全去除)全血標本，抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標本，則需盡快(2小時內(nèi))分離血清，標本短期（1～2周）保留可在-20℃下，較長久保留應在-70℃下。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第8頁全血以全血作為待測標本時,必須注意抗凝劑選擇,普通使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測,可4℃下短期保留,如用于RNA檢測，則應在取血后，盡快提取RNA。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第9頁外周血單個核細胞

外周血單個核細胞可從抗凝全血制備，主要有兩條路徑，一是使用淋巴細胞分離液分離制備；二是使用紅細胞裂解液,裂解全血中紅細胞,經(jīng)生理鹽水數(shù)次洗滌,即可得到單個核細胞。外周血單個核細胞如暫不提取核酸,可保留于-70℃下.臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第10頁痰痰屬于分泌物,臨床上常見作為結(jié)核桿菌DNA測定標本。痰標本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時,需對樣本進行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體PCR檢測，痰標本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到沉淀物即可用于核酸提取。液化標本如不馬上用于核酸提取,可保留于-70℃下。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第11頁痰標本處理基礎模式通用模式簡單模式臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第12頁痰標本處理通用模式（1）通用標本處理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：

4-6mol/L鹽酸胍（GuHCl）

50mmol/LTris-HCl,pH7.525mmol/LEDTA0.5%十二烷基肌酸鈉（Sarkosyl

）

0.1~0.2mol/Lβ-巰基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第13頁一定體積痰1.5倍體積USP溶液,震蕩30-40s10-15ml蒸餾水，室溫放置5-10min5000g室溫離心10-15min，棄上清500ul無菌0.05%Tween80溶解或重懸0g室溫離心10-15min，棄上清加入5倍10%chelex-100，混勻，90℃溫育40min0g室溫離心5min取5ul用于PCR擴增臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第14頁痰標本處理簡單模式

試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1mol/LNaOH、50μg蛋白酶K和0.05%TritonX-10050ul痰6000g離心10分鐘，棄上清加入裂解液50ul，60℃溫育30min90℃溫育30min加入Tris-HCl中和以上反應混合物取5ul用于PCR檢測臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第15頁痰標本處理中要注意問題痰標本在沒有加入內(nèi)標以控制假陰性情況下，不能采取異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采取這種方法提取，有可能會在提取過程中，出現(xiàn)一個可修飾DNA酶，在最終一步提取中，與核酸一起洗提出來，從而抑制其后擴增。在PCR主反應混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有預防這類抑制物產(chǎn)生效果。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第16頁棉拭子在使用PCR方法檢測性病病原體時,臨床標本普通為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置5～10分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清馬上離心,其后沉淀即可用于DNA提取。如不馬上用于核酸提取,則需保留于-70℃下.臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第17頁膿液膿液處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測定標本,粘稠膿液可采取痰標本處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗2～3次后,即可用于DNA提取。對于用于非分枝桿菌測定膿液標本,如過于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清馬上離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標本保留條件一樣為-70℃。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第18頁體液臨床體液標本包含胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標本方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本保留同上。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第19頁乳汁

乳汁有時也可作為標本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等PCR檢測。

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第20頁乳汁中分枝桿菌DNA提取試劑準備①裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,2%TritonX-100,4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）,0.3mol/L醋酸鈉。②玻璃珠：（直徑：425-600um）臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第21頁乳汁標本離心6000rpm，5min，棄上清脂質(zhì)和沉淀用750ul裂解液重懸重懸液移入含100mg玻璃珠離心管攪拌煮沸5min，離心14000rpm，3min650ul上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，等體積異丙醇沉淀70%乙醇洗滌沉淀，干燥50ulTris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR擴增臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第22頁組織

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后猛烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保留于50%乙醇中,詳細作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm小片,加入適量生理鹽水,然后,邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%.這么固定組織標本室溫下可保留數(shù)日,4℃可保留6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進行DNA提取。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第23頁臨床標本濾紙上保留臨床標本置于經(jīng)過處理濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保留數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。保留在濾紙上標本，保留時間長，還可因為標本中PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面擴增檢測造成影響。不論是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第24頁臨床標本中PCR反應抑制物內(nèi)源性

:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細胞內(nèi)乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

外源性

:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過分UV照射后礦物油、手套滑石粉、標本容器或采樣器材上含有抑制物。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第25頁肝素作用機理

肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強抑制作用，假如臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標本中肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對標本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、重復乙醇沉淀等均不能去除肝素這種干擾作用。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第26頁肝素作用機理每μg核酸標本中加入0.1U肝素,即可100%抑制酶活性。在標本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃2小時)可去除肝素抑制作用。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第27頁血紅蛋白、乳鐵蛋白血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細胞和白細胞內(nèi)主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中相關。研究鐵抑制效應時，發(fā)覺其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第28頁IgG

IgG抑制作用是因為其與單鏈DNA相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用使用煮沸作為標本處理方法或使用PCR前熱開啟,將增強IgG對PCR反應抑制臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第29頁去除或減輕抑制一些方法NaOH處理可中和臨床標本中TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適合用于DNA含量低標本，因為NaOH處理可使DNA大量丟失。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第30頁去除或減輕抑制一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對TaqDNA聚合酶抑制效應，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加TaqDNA聚合酶擴增能力，使其對糞便和肉類標本中抑制物抵抗能力分別提升10和20倍。單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA增強效應。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第31頁核酸純化核酸分離純化技術起源于二十世紀五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍應用和推廣。傳統(tǒng)核酸提取方法常包括去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第32頁普通核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內(nèi)釋出原理靶核酸能夠與宿主細胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細胞內(nèi)，如測定是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內(nèi)，假如上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。普通均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一個蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細胞內(nèi)釋放出來。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第33頁核酸分離純化

核酸分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床試驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第34頁DNA提取經(jīng)典方法即所謂”酚-氯仿提取法”

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第35頁臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第36頁RNA提取獨特征臨床標本及試驗室環(huán)境中,存在大量對RNA含有強烈降解作用RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。怎樣防止RNase對標本污染及預防RNase對提取RNA降解,是確保RNA成功提取關鍵之所在。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第37頁

RNA提取所用器皿處理經(jīng)高壓滅菌一次性使用塑料制品如試管,離心管等基礎上無RNase,能夠不經(jīng)預處理直接用于制備和貯存RNA.試驗室用普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡用于制備RNA燒杯,試管和其它用具。DEPC是RNase強烈抑制劑。灌滿DEPC器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最終高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量DEPC,以防DEPC經(jīng)過羧甲基化作用對RNA嘌呤堿基進行修飾。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第38頁RNA提取所用溶液準備

對于RNA提取所需溶液配制,必須用高壓滅菌水和RNA研究專用化學試劑配制溶液,用干烤過藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase玻璃器皿?？赡茉?溶液均應用0.1%DEPC于37℃最少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意是,DEPC可與胺類快速發(fā)生化學反應,所以不能用來處理含有Tris一類緩沖液,所以可存幾瓶新,未開封Tris試劑以制備無RNase溶液。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第39頁RNA提取中RNase污染控制試驗操作人員手是RNase污染最主要潛在起源。策略是：在準備用于RNA純化試驗材料和溶液時,以及在包括RNA整個提取操作過程中,都應戴一次性手套。在RNA提取試驗中，應勤換手套。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第40頁RNA提取常見方法

表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第41頁異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第42頁核酸提取改良方法

旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自動核酸純化儀臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第43頁旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）屬于硅吸附方法一個。在原理上現(xiàn)行旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€個別：（1）利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中核酸釋放出來（2）把釋放核酸特異地吸附在特定硅載體上，當然這種載體只對核酸有較強親和力和吸附力而對其它生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附（3）把吸附在特定載體上核酸洗脫下來，從而得到純化核酸。

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第44頁臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第45頁臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第46頁玻璃粉吸附法

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第47頁二氧化硅（Se）或硅藻吸附法

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第48頁使用NaI微量全血核酸提取法

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第49頁全自動核酸純化儀雅培m系統(tǒng)該儀器主要由兩個機械臂和八個單道移液器組成，將樣品放入樣品管中后，儀器就能夠自開工作，利用磁珠法進行核酸（DNA/RNA）提取。在樣品提取完成后，儀器還能夠進行PCR試劑混合步驟。基礎上沒有手工操作步驟，最大樣本量：96

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第50頁全自動核酸純化儀美國貝克曼庫爾特有限企業(yè)SPRI-TE小型化自動提?。?-10個樣品VidieraNsP大型化自動提取:96樣本臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第51頁全自動核酸純化儀QIAGEN企業(yè)生產(chǎn)BioRobotMDxWorkstation96通道自動化提取工作站。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第52頁全自動核酸純化儀另外還有羅氏推出MagNAPureLC2.0System，金麥格自動核酸提取系統(tǒng)。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第53頁靶核酸提取質(zhì)量

純化靶核酸完整性：可使用凝膠電泳將樣本核酸提取物與一核酸標準比較測定。核酸提取產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測定。核酸純度：可經(jīng)過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采取一個間接方法，即使用已知病原體含量溶血和/或脂血標本用待評價試劑提取，然后進行擴增檢測，比較所得到結(jié)果臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第54頁謝謝！臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第55頁臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第56頁一、標本搜集、運輸、保留

1、標本搜集臨床基因擴增檢測試驗室對各種臨床標本搜集應按檢測要求建立標準操作程序，并對臨床標本采集人員培訓。標本采集時間，應在患者疾病發(fā)展過程中，標本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。

臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第57頁（1）標本采集部位準備標本采集部位清潔消毒可去掉污染微生物或其它雜物，但應適度，故標本采集部位準備應由訓練有素人員進行。

（2）標本類型和采集量標本類型和采集量應依據(jù)所測病原體而定。如：定量PCR對結(jié)核分枝桿菌檢測，應選擇患者血腦脊液、胸腹水等標本，不宜用痰標本，因為痰中結(jié)核分枝桿菌分布不均。臨床pcr檢驗標本的采集處理保存及核酸提取方法第58頁PCR檢測衣原體時，因為衣原體感染上皮細胞，所以取材一定要取到細胞，不論男女取材均應用特制拭子，男性應進入尿道2-3cm，女性應進入子宮頸口2cm并