實(shí)驗(yàn)4 細(xì)胞骨架的顯示及觀察

實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察/NUMPAGES11實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察姓名：李思露學(xué)號：131140040實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼每捡R斯亮藍(lán)R250染色觀察動物和植物細(xì)胞骨架的原理和方法。了解免疫熒光法檢測細(xì)胞成分的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架：指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，包括微管（microtubule，MT）、微絲（microfilament，MF）、中間纖維（intermediatedfilament，IF）。微管微管是細(xì)胞內(nèi)由微管蛋白形成的直徑約20~26nm的長度不一的小管。分布在核周圍，呈放射狀向胞質(zhì)四周擴(kuò)散，主要確定膜性細(xì)胞器的位置和作為膜泡運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)管。微管蛋白有α和β兩種。αβ異二聚體沿縱向聚合成絲，原絲成環(huán)狀排列形成微管的壁。微管不穩(wěn)定，對低溫（冷凍）、高壓等物理因素及秋水仙素（微管斷裂劑）等化學(xué)因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚體結(jié)合，抑制微管解聚。微絲：真核細(xì)胞內(nèi)是主要由肌動蛋白（actin）組成的直徑為5～7nm的骨架纖絲。主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，作用是確定細(xì)胞表面特征、并與細(xì)胞運(yùn)動、收縮、內(nèi)吞等功能有關(guān)。脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，不同種類細(xì)胞中肌動蛋白組成不同。肌動蛋白單體為球形，依次連接成鏈，兩串肌動蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲。細(xì)胞松弛素B為微絲斷裂劑。中間纖維：直徑介于微絲和微管之間（7~11nm）、由多種不同蛋白組成的細(xì)胞骨架成分。在細(xì)胞中圍繞著細(xì)胞核分布，成束成網(wǎng)，并擴(kuò)展到細(xì)胞質(zhì)膜，與質(zhì)膜骨架相連結(jié)。主要起機(jī)械支撐和加固作用。組成中間纖維的蛋白：角蛋白，波形蛋白，結(jié)蛋白、神經(jīng)纖維，神經(jīng)膠質(zhì)纖維和核纖層蛋白。不同組織來源的細(xì)胞，組成其中間纖維的蛋白質(zhì)種類可能不同。研究細(xì)胞骨架的意義。（1）了解細(xì)胞骨架與細(xì)胞各種功能行使之間的關(guān)系。（2）了解理化因素是否通過影響細(xì)胞骨架對細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，以便趨利避害。（3）鑒定發(fā)育中的細(xì)胞及腫瘤的來源。6.顯示細(xì)胞骨架的常用方法：考馬氏亮藍(lán)染色法、免疫熒光染色法、鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法。（1）考馬斯亮藍(lán)染色法原理及特點(diǎn)原理：用去垢劑TritonX-100處理細(xì)胞適宜時間，可以溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解，剩下的纖維狀細(xì)胞骨架蛋白比較穩(wěn)定而不被溶解，然后用蛋白染料考馬斯亮藍(lán)染色即可顯示其結(jié)構(gòu)。特點(diǎn)：非特異蛋白染色，不能區(qū)分微管、微絲、中間纖維（2）免疫熒光染色法原理及特點(diǎn)原理：用TritonX-100處理固定處理過的細(xì)胞，可增加細(xì)胞膜通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合。接著用熒光素標(biāo)記的抗骨架蛋白抗體便可通過直接免疫熒光法或間接免疫熒光法顯示骨架。特點(diǎn)：特異顯示各種骨架蛋白（3）鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法原理及特點(diǎn)原理：鬼筆環(huán)肽可特異性地結(jié)合肌動蛋白，因此，用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以顯示微絲。特點(diǎn)：靈敏，能特異顯示微絲。實(shí)驗(yàn)材料、試劑及用品材料：洋蔥試劑（1）M-緩沖液。（2）6mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8）。（3）含1%TritonX-100的M-緩沖液。（4）用M-緩沖液配制的3.0%戊二醛。（5）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液。（6）0.9%氯化鈉生理鹽水。（三）用品普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴箱（37℃）小剪刀、鑷子、5mL一次性塑料注射器、膠頭吸管、1.5mLEP管、1.5mL試管架實(shí)驗(yàn)操作考馬斯亮藍(lán)染色法顯示洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架材料準(zhǔn)備：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，裁成大小0.5cm×０.５ｃｍ的小片。PBS平衡：放入盛有1mL6mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）的EP管中，靜置使材料下沉（完全浸透）；然后用膠頭滴管吸棄液體。TritonX-100處理：加1mL1%TritonX-100溶液處理20min，然后用膠頭滴管吸棄液體。洗滌：用M-緩沖液洗滌3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用膠頭滴管吸棄液體。固定：加1mL3.0%戊二醛固定30min,然后用膠頭滴管吸棄液體。洗滌：用PBS洗滌3次，每次浸泡5min,然后用膠頭滴管吸棄液體。染色：用0.5~1.0mL0.2%考馬斯藍(lán)R250染液染色10min。洗滌：用蒸餾水洗滌數(shù)遍。制備裝片：給載玻片中央加1滴水，用鑷子夾取樣品在其中展開，然后加蓋玻片。顯微觀察：在普通光學(xué)顯微鏡下，洋蔥細(xì)胞骨架為布滿細(xì)胞的藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。對照樣品：①省去步驟（3），不用TritonX-100處理；②省去步驟（4）,用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論1.實(shí)驗(yàn)樣品圖1洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400倍）實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞骨架分布細(xì)密均勻，視野中只剩下細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)，被考馬斯亮藍(lán)染成藍(lán)色。在視野的上半部分，細(xì)胞的背景呈現(xiàn)藍(lán)紫色，是由于最后洗滌不徹底所致。2.對照樣品①：不用TritonX-100處理圖2不用TritonX-100處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400倍）不用TritonX-100處理的對照樣品①的細(xì)胞中除了細(xì)胞骨架還有很多膜泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中還有藍(lán)色的細(xì)胞核。不用TritonX-100處理，使得視野中有很多非骨架蛋白，這些非骨架蛋白被考馬斯亮藍(lán)染成藍(lán)色，影響對細(xì)胞骨架的觀察。3.對照樣品②：用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌圖3用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400倍）圖3和圖2的情況類似，視野中沒有均勻細(xì)密的細(xì)胞骨架，這是由于M-緩沖液使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合鈣離子，溶液并提供鎂離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。用TritonX-100處理后雖然可以溶解膜脂和非細(xì)胞骨架蛋白，但是保留下來的骨架蛋白在沒有M-緩沖液的作用下，其結(jié)構(gòu)仍無法保持穩(wěn)定，影響觀察結(jié)果。作業(yè)與思考題比較用與不用1%TritonX-100處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：見五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論部分1、2。2．查閱資料說明M-緩沖液中咪唑、MgCl2、EGTA、EDTA、巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）在穩(wěn)定細(xì)胞骨架中的作用。答：在M-緩沖液中，咪唑是緩沖劑，MgCl2提供Mg2+,EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察；巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）可以在二硫鍵被打開后使蛋白質(zhì)的四級或三級結(jié)構(gòu)被破壞，由于巰基乙醇能夠打開蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，它常常被用于蛋白質(zhì)分析，且?guī)€基乙醇也常常被用于保護(hù)蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。設(shè)計(jì)檢測微絲的間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)流程。用未標(biāo)記的微絲抗體加到微絲抗原標(biāo)本上，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體，標(biāo)記的抗球蛋白抗體和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合。立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++--++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性七、反思與改進(jìn)1.防止洋蔥鱗莖內(nèi)表皮卷曲、折疊，若卷曲折疊