第十章酶的定向進化詳解演示文稿

第十章酶的定向進化詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點優(yōu)選第十章酶的定向進化目前二頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點一、自然進化與定向進化達爾文在《物種起源》中提出以自然選擇為基礎(chǔ)的進化學(xué)說，成為生物學(xué)史上的一個轉(zhuǎn)折點。1、自然進化

（1）環(huán)境壓力下物種朝著適應(yīng)生存環(huán)境的方向發(fā)展；（2）漫長時間里通過DNA復(fù)制發(fā)生突變或通過重組，產(chǎn)生了遺傳多樣性；（3）自發(fā)、非常緩慢、自然選擇；目前三頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點2、定向進化是達爾文的進化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應(yīng)用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實驗室條件下人工模擬生物大分子自然進化過程，在體外對基因進行隨機誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)自然界幾百萬年才能完成的進化過程。人為引發(fā)、較短時間、人為選擇。目前四頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點3、定向進化的一般過程細(xì)菌誘變500C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C目前五頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點4、酶定向進化的意義酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進化技術(shù)重新設(shè)計及改進酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要。目前六頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點二、理論來源利用基因工程原理在實驗室中模擬生物進化過程

待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體?；瘜W(xué)進化生物進化目前七頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點是蛋白質(zhì)工程的新策略主要是利用分子生物學(xué)手段，在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，在事先不了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制的情況下，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。是一種在生物體體外快速模擬達爾文進化的、具有一定目的性和快速改造蛋白質(zhì)的方法，相對于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)的“理性設(shè)計”，酶的分子定向進化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計。三、定向進化概念定向進化=隨機突變+正向重組+選擇（或篩選）目前八頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點定向進化的過程（1）通過隨機突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；（2）導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫；（3）通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。這個過程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。目前九頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體進行實驗，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。SolSpiegelman第二節(jié)酶分子定向進化的歷史目前十頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點1981年，B.G.Hall等定向改變E.coliK12中ebg酶的底物專一性，開發(fā)出對幾種糖苷鍵有水解能力的酶。1993年，Arnold研究組提出易錯PCR的方法。1994年，Stemmer將DNA重組方法引用到酶分子的定向進化中。1999年，Stemmer等把DNA改組延伸到族改組。目前十一頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點

第三節(jié)定向進化的選擇策略

隨機突變策略易錯PCR、DNA改組和外顯子改組、體外隨機引發(fā)重組、交錯延伸、定位誘變篩選——采用回交法目前十二頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點1、易錯PCR(error-pronePCR)通過改變PCR反應(yīng)條件，使擴增的基因出現(xiàn)少量堿基錯配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機突變。控制DNA的突變頻率。不足之處：靶序列長度一般在0.5-1.0kb，應(yīng)用范圍有限；中性突變較多；且較為耗時、費力；獲得的DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。此法突變具有一定的密碼偏向性。目前十三頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點連續(xù)易錯PCR(Sequentialerror-pronePCR)將一次PCR擴增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復(fù)進行隨機誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。目前十四頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點2、DNA改組1994年，Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗對象，用DNA改組，經(jīng)過三輪篩選和兩次回交得到一新菌株，其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍，也遠(yuǎn)高于易錯PCR的突變篩選結(jié)果。目前十五頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點DNA改組是DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上有性重組。通過改變單個基因(或基因家族)原有核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能。是一種分子水平上的定向進化。因此也稱為分子育種。DNA改組的效果必須由改組后的基因表達產(chǎn)物的功能來驗證。因此，靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。目前十六頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點DNA改組原理DNaseI產(chǎn)生隨機片段；隨機片段變性；隨機片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)步后，可獲得全長DNA片段2-4。目前十七頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點DNA改組步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機片段化，即將目的基因（可以是單個基因或一組相關(guān)基因）酶切成隨機片段，這些隨機片段集合包含了來自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3’末端；（3）無引物PCR，具有互補3’末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機互補進一步延伸；（4）有引物PCR，以上輪無引物PCR的產(chǎn)物為模板，加入基因兩端序列為引物，經(jīng)過多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合為突變文庫；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進一步對突變文庫進行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復(fù)上述步驟進行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。目前十八頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點單個DNA改組技術(shù)原理示意圖(a)單個基因目前十九頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點（b)基因家族改組技術(shù)(familyshuffling)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進化的目的，但其中隨機產(chǎn)生的多為點突變，且有益突變頻率低，導(dǎo)致篩選工作艱巨且進展緩慢。DNA家族改組是以來自不同種屬的同源基因作為重排對象進行DNA改組操作的技術(shù)。該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進行DNA改組。特點：顯著加速有益突變的累積，易于實現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進化。目前二十頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點1、需要有一個含有各種不同正突變的基因組庫(例如:通過經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進的不同的正突變菌株，就構(gòu)成了所需的基因組庫)；2、通過原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進行隨機重組；3、篩選目的性狀得到進一步改進的菌株來進行下一輪基因組改組；4、循環(huán)多輪隨機重組。目前二十一頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點與常規(guī)突變技術(shù)相比，DNA改組有以下顯著優(yōu)點：①DNA改組可在短時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可以達到幾十kb；②通過多輪篩選或選擇，可使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；③DNA改組從表型上早期進行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡化了操作程序；④DNA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機突變具有較大的優(yōu)勢，隨機突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變，但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。目前二十二頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點DNA改組與常規(guī)定向進化的比較目前二十三頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點3、體外隨機引發(fā)重組法

(random-priminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。反復(fù)進行上述過程，直到獲得滿意的進化酶性質(zhì)。目前二十四頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點該法優(yōu)于DNA改組法的特點在于:(1)RPR可以利用單鏈DNA為模板，可10~20倍地降低親本DNA量；(2)在DNA改組中，片段重新組裝前必須徹底除去；DNaseⅠ，故RPR方法更簡單;(3)合成的隨機引物具有同樣長度，無順序傾向性。在理論上，PCR擴增時模板上每個堿基都應(yīng)被復(fù)制或以相似的頻率發(fā)生突變；(4)隨機引發(fā)的DNA合成不受DNA模板長度的限制。目前二十五頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點4、交錯延伸方法：PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。反復(fù)進行，直到產(chǎn)生完整的基因長度，結(jié)果產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。特點：重組發(fā)生在單一試管中，不需分離親本DNA和產(chǎn)生的重組DNA。目前二十六頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點第四節(jié)定向進化的應(yīng)用一、提高酶分子的催化活力二、提高酶分子的穩(wěn)定性三、提高底物的專一性和增加對新底物催化活力的進化五、對映體選擇性的定向進化目前二十七頁\總數(shù)二十九頁\編于十八點一、提高酶分子的催化活力酶活的高低反映一個生物催化與轉(zhuǎn)化過程反應(yīng)速率的快慢，酶活越高，反應(yīng)速率越快，反之則反應(yīng)速率越慢。因此，實現(xiàn)較高的酶活是企業(yè)一直追求的目標(biāo)。L—天冬氨酸酶定向進化研究進行4輪易錯PCR，篩選了3000個菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶目前二十八頁\總數(shù)二