DNA重組技術(shù)與基因工程

PPT制作：XX、XX資料收集：XX、XX講解：XX、XXDNA重組技術(shù)與基因工程目前一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點一、基因和基因工程基因（gene）:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)最小功能單位。基因工程（geneome）:重組DNA技術(shù)是指分離純化或人工合成的基因（目的基因）與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入宿主細胞（細菌或其他細胞）內(nèi)，篩選出攜帶有重組DNA的活宿主細胞，再使之繁殖和擴增，直至表達出目的基因所編碼的多肽。由于這一過程類似于一個連續(xù)和復雜的工程，所以又稱為基因工程。DNA重組體外引入受體細胞（宿主細胞），進行無性繁殖和擴增的過程稱為基因克隆技術(shù)。目前二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點基因工程技術(shù)的誕生

基因工程技術(shù)的誕生不僅依賴于基因分子生物學理論的發(fā)展，同時也有賴于一些重要的分子生物學研究方法的建立。最重要的技術(shù)準備是限制性酶的分離純化、DNA連接酶的分離、大腸桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。到1970年，這三大技術(shù)都已經(jīng)建立，“萬事齊備，只欠東風”了。到了1972～1973年，兩位科學助產(chǎn)士Berg和Cohen將基因工程接到了人間。目前三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點一、基因工程的發(fā)展史目前四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點

第一個重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標志著基因工程技術(shù)的誕生。目前五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點第一個有功能重組體的構(gòu)建◆雖然Berg的工作具有劃時代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學功能?！?973年，S.N.Cohen等在美國PNAS上發(fā)表了題為“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）

的論文，宣布體外構(gòu)建的細菌質(zhì)粒能夠在細胞中進行表達,從而完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)。目前六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點BoyerandCohen目前七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點◆質(zhì)粒

pSC101的獲得●In1972,CohenconstructedanewplasmidbeginningwithDNAisolatedfromE.coli.CohennamedtheplasmidpSC101(“SC"forStanleyCohen).Thenewplasmidhadthreeimportantfeatures:ithadonlyasinglerecognitionsitewhereEcoRIwouldcutthemolecule,thusidentifyingthespotwheretheplasmidwouldopen;(2)ithadasequenceofnucleotidescalledanoriginofreplication,whichisneededtoinitiateDNAreplication;suchasequencestimulatesplasmidstomultiplyinahostorganism;(3)itcontainedageneforresistancetotheantibiotictetracycline;thus,bacteriahavingtheplasmidcouldresisttheeffectsoftetracycline,whereasbacterialackingtheplasmidwouldbekilledbythetetracycline.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻目前八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點◆質(zhì)粒

pSC101對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)突破●AnotherkeycharacteristicofCohen'splasmidwastheeaseofinsertingittoahostcell.Cohenfoundthathecouldinsertplasmidstofreshbacteriabysuspendingthelatterincoldcalciumchloride,thenrapidlyheatingthebacteriato42oC.Sotreated,thebacterialwallandplasmamembraneopentopermittheplasmidstopassthroughandintothecytoplasm.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻目前九頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點◆Cohen與Boyer合作創(chuàng)建重組DNA分子●Tosomehistorians,thedisciplineofDNAtechnologycameintobeingoverpastramisandwichesatalocaldelicatesseninWaikikiBeach.Theyearwas1972.●IthappenedthatHerbertBoyerwasatascientificconferenceinHawaiispeakingabouttheEcoRlrestrictionenzyme.StanleyCohenwasintheaudience.●Afterthepresentation,CoheninvitedBoyertolunchtoexploretheirpossiblecollaborationonaseriesofexperiments.●ThetworesearcherssatandconsideredtheexperimentsthatwouldsendDNAtechnologyintoanewera.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻目前十頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點BoyerandCohen的策略目前十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點從生物體中分離或通過化學合成制備目的基因。目的基因與合適載體進行體外連接，構(gòu)建重組DNA。將重組DNA導入受體生物細胞以獲得轉(zhuǎn)化體。篩選出含有重組DNA的活宿主細胞。對重組DNA的活宿主細胞進一步分析以及操作，使目的基因在受體生物細胞中高效表達。

（一）基因工程的基本過程目前十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點步驟1、構(gòu)建DNA重組體人工合成法、逆轉(zhuǎn)錄法、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶從染色體DNA中切割分離（1）目的基因的制備目前十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點（2）克隆載體的制備1、相對分子質(zhì)量較小2、能進行復制，具有高拷貝數(shù)3、具有較少的限制性內(nèi)切酶位點4、外源DNA插入以后載體本身的復制功能不受影響5、具有某種明顯的標志常用克隆載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒理想的載體目前十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點同一限制酶切位點連接由同一限制酶切割的不同DNA片段具有相同末端，當這樣的兩個DNA片段一起退火時，黏性末端單鏈間進行堿基配對，然后在T4DNA連接酶催化作用下形成共價結(jié)合的重組DNA分子。黏性末端連接（3）DNA重組體的制備目前十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點具有平末端的酶切載體只能與平末端目的基因連接。在一定反應(yīng)條件下，可用T4DNA連接酶將平齊末端的DNA片段有效地連接起來。鈍性末端連接法目前十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點人工接頭：人工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點，應(yīng)用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，可以分別得到互補的黏性末端。人工接頭連接目前十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點步驟2、將重組DNA引入宿主細胞篩選轉(zhuǎn)化（transformation）：將重組質(zhì)粒導入受體細胞，使受體菌遺傳性狀發(fā)生改變的方法。轉(zhuǎn)染（transfection）:將攜帶外源基因的病毒感染受體細胞的方法。根據(jù)受體生物，一般可將重組體導入受體細胞的方法主要分為大腸桿菌轉(zhuǎn)化法、酵母轉(zhuǎn)化法、植物細胞轉(zhuǎn)化法和動物細胞轉(zhuǎn)化法。目前十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點（一）利用表型特征進行篩選表型：指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。利用載體提供的表型特征進行篩選（1）抗藥性標記基因插入失活篩選法；（2）β－半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法。

利用噬菌斑的形成進行篩選（1）以λ噬菌體載體與外源DNA構(gòu)建的重組體篩選主要依賴于重組體的大小及形成噬菌斑的能力；（2）重組體DNA只有在為野生型λ噬菌體DNA的75%～105%的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而載體DNA自身不會包裝成活的噬菌體顆粒。目前十九頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點電泳檢測法根據(jù)DNA分子質(zhì)量的大小，以凝膠電泳檢測重組體。

R-環(huán)檢測法

R-環(huán)：指RNA通過取代與其序列一致的DNA單鏈而與另一單鏈DNA雜交，被取代的DNA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

R-環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定。應(yīng)用R-環(huán)檢測法可鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域（可在電子顯微鏡下觀察）。

（二）物理篩選鑒定法目前二十頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點步驟3、含重組DNA的活宿主細胞的繁殖擴增表達插入外源DNA質(zhì)粒載體加入重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入宿主細胞宿主細胞DNA在含有抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生大量重組DNA拷貝抗生素基因目前二十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點基因工程的技術(shù)組合目前二十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點基因工程的特點◆基因工程有兩個基本的特點∶分子水平上的操作和細胞水平上的表達?！艋蚬こ碳夹g(shù)的誕生使人們能夠在試管里進行分子水平上的操作，象一項工程那樣，進行按圖施工的操作，基因工程的對象是基因，而基因要安居才能樂業(yè)，也就是說基因需要在宿主細胞中工作，這樣，基因工程同一般的土建工程的根本差別在于，它需要在體外操作，然后送到細胞中去進行表現(xiàn)?！暨@實際上是進行無性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又稱為基因克隆。目前二十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點基因工程的基礎(chǔ)與應(yīng)用（一）

改良微生物菌種

最早成功應(yīng)用的基因工程菌(采用基因工程改造的微生物)是面包酵母菌。此外，食品生產(chǎn)中所應(yīng)用的食品添加劑或加工助劑，如氨基酸、有機酸、維生素、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、食用色素，食用香精及調(diào)味料等啤酒生產(chǎn)中要使用啤酒酵母，但由于普通啤酒酵母菌種中不含α-淀粉酶，所以需要利用大麥芽產(chǎn)生的α-淀粉酶使谷物淀粉液化成糊精，生產(chǎn)過程比較復雜。

改造食品

目前二十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點（二）改良動物食品性狀

為了提高乳牛的產(chǎn)奶量，可將采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的牛生長激素(BST)注射到母牛體內(nèi)，既可達到提高母牛產(chǎn)奶量的目的，又不影響奶的質(zhì)量。同樣，為了提高豬的瘦肉含量或降低豬脂肪含量，可將采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的豬生長激素，注射至豬體內(nèi)，便可使豬瘦肉型化，有利于改善肉食品質(zhì)。目前二十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點（1）改造油料作物最易用基因工程方法進行改造的油料作物是油菜，迄今為止，在世界范圍內(nèi)種植的良種油菜有31％是轉(zhuǎn)基因品種。

農(nóng)業(yè)應(yīng)用

目前二十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點

（2）提高油脂中抗氧化劑的含量。

已成功地從擬南芥中克隆甲基轉(zhuǎn)移酶基因并轉(zhuǎn)導到了大豆中，甲基轉(zhuǎn)移酶是γ—生育酚形成生育酚的關(guān)鍵酶。轉(zhuǎn)這種酶基因的大豆能在不降低總生育酚的前提下，使α—生育酚的含量提高80％以上。

目前二十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點（3）改良植物食品的蛋白質(zhì)品質(zhì)

如秘魯“國際馬鈴薯培育中心”培育出一種蛋白質(zhì)含量與肉類相當?shù)氖眍悾晦D(zhuǎn)移扁豆蛋白基因可獲得具有較高貯存蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因向日葵。我國在此方面也培育出了一批作物新品種，有的已經(jīng)在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。如山東農(nóng)業(yè)大學將小牛胸腺DNA導入小麥系814527，在第二代出現(xiàn)了蛋白質(zhì)含量高達16.51％的小麥變異株；中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所將大米草DNA引入水稻品種早豐，出現(xiàn)了籽粒蛋白質(zhì)含量高達12.74％的受體變異類型。

目前二十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點生產(chǎn)基因工程藥品如胰島素、干擾素、乙肝疫苗等。我國生產(chǎn)的部分