抗體效價(jià)的Elisa測(cè)定

實(shí)驗(yàn)五

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BSA抗體效價(jià)

1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理。(2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，抗體的效價(jià)測(cè)定及酶聯(lián)免疫測(cè)定儀的使用。

2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，定量測(cè)定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次

顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過(guò)氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)稱為Elisa)-----是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強(qiáng)兩方面的優(yōu)點(diǎn)。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定標(biāo)記抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究酶------性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無(wú)色、產(chǎn)物顯色，便于檢測(cè)常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過(guò)氧化物酶(horseradperoxidase簡(jiǎn)稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶標(biāo)技術(shù)戊二醛法，過(guò)碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O圖一直接型Elisa

圖二間接型Elisa圖三雙抗體夾心型ELISA圖四固相抗體競(jìng)爭(zhēng)型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。Pa斬rt否ia揚(yáng)ll傳y黑pu通ri煎fi唯ed尸,鼻in照ac錢ti服va欣te箱d泛HI援V爪an庸ti暖ge先nsan達(dá)ti灘ge忙ns著p松re羨-c餓oa思te紹d銜on殖to螺a煉n蝴EL遲IS拒A嬸pl喝at識(shí)e部分謙純化稈，滅毯活病因毒抗穴原抗原奸涂到給酶標(biāo)揚(yáng)板Pa屠ti榮en謝t揀se寨ru知m辦wh比ic犯h欲co米nt揚(yáng)ai轎ns鉛a準(zhǔn)nt催ib里od往ie償s.糠I杜f售th蓋e鏈pa飲ti突en綢t嘴is功H陡IV斤+,朝t鏡he漸n削th呼is磨s浙er康um溫w邁il剃l區(qū)co溜nt儲(chǔ)ai婆n糊an緞ti扛bo燃di嫩es姜t閣o喇HI冤V,見(jiàn)a圈nd氣t僅ho刻se哭a另nt僻ib祝od掉ie炕s嶼wi登ll劃b況in縫d原to競(jìng)t辭he編H盛IV菠a憤nt瞧ig首en都s境on擺t另he鉗p庭la何te交.病人遙血清暑中含記有抗醒體。甚如果剝病人班是艾君滋病譯毒+，那淘么這腿個(gè)血驗(yàn)清含夜有艾旺滋病五毒抗界體，蔥這些路抗體冰可以膚綁定欄到病著毒抗燈原板An蛙ti革-h鍵um波an辛i禍mm辟un微og盾lo裝bu扭li走n鋸co款up尋le楚d刊to認(rèn)a塌n來(lái)en泛zy渠me廣.旺Th白is芝i猴s鵝th逮e料se煩co皺nd籌a魯nt牲ib膝od滅y,肺a守nd死i淡t侵bi吃nd饒s薦to旨h提um沙an旬a(chǎn)斑nt慚ib擦od梯ie舟s.抗人炒免疫量球蛋昏白耦柳合酶尖。這鎮(zhèn)是繼餅抗體浩，并鉆結(jié)合往人類愉抗體su蘋(píng)bs儲(chǔ)tr弄at否e莖wh朵ic呀h獵ch樹(shù)an燦ge點(diǎn)s湖co凳lo則r煮wh惡en苦c豈le藍(lán)av維ed芒b達(dá)y糊th檢e絕en辦zy禁me禮a抬tt蕉ac較he菊d烤to字t籃he態(tài)s慌ec滑on武d忠an薦ti沙bo購(gòu)dy伴.基板攜而改捐變顏鏟色，不當(dāng)裂倘解酶涉附二飽抗體HI幣V(hu有ma重n垃im撲mu念no痰de盲fi聯(lián)ci告en言cy半v裝ir典us壟)廳de滑te荒ct葛io樹(shù)npo配si服ti順vene肚ga喇ti妥vePr謹(jǐn)ot訪ei奴n芹pr碗ot暫ei久n加in槍te載ra堡ct怠io條n-霞--庸EL注IS琴A1.該D眼ir牢ec丑tel抹is噴adi紫ff胡er鞭en本tep特it廉op媽eCo囑at鋤w嘉it蹈h貨pr遙ey截p滋ro扒te仰inIn升cu驕ba辟te羽w夕it蹦h柔ba陶it咸p諷ro頑te桶inPi罰ma區(qū)ryAban很ti挺b的ai課t熟pr腰ot久ei并n局--括--織-直接扭酶聯(lián)映免疫價(jià)吸附額試驗(yàn)雕不同半表位外套腳與獵斗物蛋喬白孵化臺(tái)與誘深餌蛋合白原發(fā)柱性抗伸體抗禮誘餌議蛋白2.匯Co亞mp友et羊it磨iv竹eel趣is夜asa北meep艘it滿op倚eCo訊at精w予it行h堵ba桶it稈p魚(yú)rIn宋cu聲ba龍te雖w紅it吉h誼pr慶im甩ar怠y凱an班ti賭bo乳dy辰a致nt獅i光ba壘it攤p光r廳a亂nd似v曬ar揮io毛us園c佳on御ce淹nt圓ra宅ti副on狐p映re社y靜pr角ot跌ei所n(競(jìng)爭(zhēng)色同一侄表位亞。外套恐與誘抗餌蛋陰白培養(yǎng)腐初級(jí)蘭抗體宏抗誘鍬餌蛋觀白及麻不同感濃度估的獵摘物蛋起白)4.操作易方法4.孫1獎(jiǎng)包被歐特異停性抗圾原:固奔體抗端原(庸如蛋技白質(zhì)得)用耕包被材液稀奮釋至幅10Oμ襪g/延ml翁，每凹浩孔加手10系0μL雷，加蓋與置4蓋℃過(guò)豬夜(繡37院℃術(shù)2h)，次日完傾去完凹孔乖內(nèi)液沫體，蹲用滴妥管取遺洗滌霉液在筑每孔塘中加器3～峽4滴馳，靜荒置3mi挪n后傾逢去，行重復(fù)無(wú)3次陽(yáng)，將祝反應(yīng)拘板扣嗎放在羅濾紙擱上，樓以除徒凈液更體。4.獅2昨封閉:抬每孔港中加斥入2劍00－4膏00μL封閉護(hù)液，低加蓋漏或用困封口模膜封甘板，筒置3磨7℃賤恒溫供箱6刷0mi桃n，傾去哨孔內(nèi)銅液體銹，按每上法錘洗滌零3次底。4.斥3華加待辟測(cè)血揀清(杠內(nèi)含竭抗體趣)、墾陰性廉血清譯(無(wú)上抗體顫)及禾稀釋她液(PB翻S/Tw謊ee之n):待測(cè)烏血清寨按倍劈燕比法究用稀用釋液炭稀釋濕(1敵:1她00背、1紀(jì):2概00德等)堤，陰誦性血史清也控稀釋冰成1品:1促00枕，取摧不同高稀釋頸度的降待測(cè)財(cái)血清霜，陰汁性血乘清及棟稀釋搜液(PB崖S/Tw散ee泉n)各1OO斜μL加至泳相應(yīng)打的凹毫孔中換，加職蓋或躺封板鉗，置廣37傾℃恒需溫箱踏1h，使抗腔體與山固相恩抗原潑進(jìn)行牢特異田性結(jié)唐合，兄反復(fù)撐洗滌么3次隔。12345678PB妙S/Tw米ee唯n1:宴10錄0陰慘性血桑清1:1,母00融01:5,覆00熟01:10僻,0喊001:20莫,0租001:50圣,0譜001:10愉0,例00督0陽(yáng)性血娃清4.諷4附加酶舅標(biāo)抗溜體:按鋪說(shuō)明濫書(shū)要辰求用狗稀釋并液稀扣釋HR營(yíng)P-抗體撇(抗升抗體巨)，返每孔肌加l0登0μ旱L，封板同后置淹37花℃溫載育lh，按上躁法至蘇少洗缺滌5家次，秒最后土用蒸話餾水話洗滌毛2次凱，扣貞在濾寺紙上妹吸干襲水分貞。4.族5帖顯色:悼每孔殘加入OP緩D應(yīng)用張液1OO鏡uL、反應(yīng)去板置付室溫?cái)z暗處際5～飄30mi品n。當(dāng)顯猴示橙湊色時(shí)引應(yīng)及錘時(shí)終獵止反寨應(yīng)。4.因6詞終止糕反應(yīng):每奴孔加雁入5Oμ劇L濱2m同ol策/L找H2SO4。穩(wěn)定園3～肉5mi活n即可胡比色永測(cè)定民。4.仙7猶檢測(cè):忘用酶婚聯(lián)免垮疫測(cè)砌定儀諒，以PB狗S/Tw車ee校n孔為遙對(duì)照諷、測(cè)蹤蝶波長(zhǎng)臨為49O旱nm時(shí)各蘭孔光快吸收沾（A）。計(jì)算谷陽(yáng)性苦血清壟與陰柔性血撞清A值之伏比(Po第si扒ti膝ve激/n塑eg揉at輔iv職e，券P/胞N)仰，當(dāng)P/檔N≥嗽2.質(zhì)1時(shí)為文陽(yáng)性賭，P/吸N<亞2.公1而≥穿1.胞5為征可疑擋，P/全N<制1.祝5為陰相性。暗用目脂測(cè)法周則以恰較陰柴性對(duì)影照深斤色的檢最高根稀釋低度作語(yǔ)為抗姑體效聽(tīng)價(jià)。用“?。瘪v“－張”表餓示，捉超過(guò)立規(guī)定舟吸收謹(jǐn)值（循0.吉2－面0.專4）諒的標(biāo)段本均升屬陽(yáng)囑性。注意偏事項(xiàng)(1周)聚丑苯乙脖烯微滋量反奏應(yīng)板她應(yīng)選述擇高非質(zhì)量越、非悼特異隱性吸悔附小嚇的產(chǎn)滿品。榮包被使物應(yīng)瓶具有親較高若的純矩度，談其濃聲度一調(diào)般在為1～墻10月0μg之間旗，在眨偏堿孤條件西下易釘吸附廊于反以應(yīng)板采的凹屈孔中天，4小℃放權(quán)置過(guò)討夜較祥理想追，若凝暫時(shí)職不用順，可嬌加入某終濃鏟度為照0.脈02鍵%Na轟N3，4路℃貯存松，也晶可傾屋去包滑被液維，干淋燥后揮置硅言膠干料燥器表中，及室溫刪存放快3個(gè)含月以診上不予影響牧測(cè)定小效果沃。(2尺)反晉應(yīng)各宵步均悠應(yīng)充頓分洗顏滌，翼以除稿去殘題留物呀，減手少非悄特異喊性吸陳附。傻為使辭結(jié)果群重復(fù)常應(yīng)固晃定洗壺滌次隨數(shù)及爭(zhēng)放置住時(shí)間皂，切眉忌相蛇互污功染。(3距)為橋使顯濾色反靜應(yīng)便萄于比酸較，撇顯色遷后置稠室溫接暗處伍的時(shí)睬間應(yīng)宅一致牛，終眨止反律應(yīng)3京～5mi瓣n后應(yīng)嘉立即謙比色疏。必觸要時(shí)攪可設(shè)能陽(yáng)性滲對(duì)照精，以牲固定據(jù)顯色出及終恰止時(shí)丸間。(4潤(rùn))待毯測(cè)抗城體或旦抗原藥與酶賞標(biāo)抗泄體應(yīng)早具有斷相同印的免者疫特麗異性寺，否挽則無(wú)什法結(jié)賊合。自動(dòng)波酶標(biāo)賴儀（El物x8區(qū)00斷UV）使用蟲(chóng)程序1開(kāi)機(jī)移，進(jìn)示行Sy許st盾em酷s倡el類f-粒te而st攻…2按“DE塌FI蠅NE絞”鍵，坊進(jìn)入照“SE蠅LE搜CT悉A駐SS站AY奪N反UM委BE擁R”來(lái)，用“NU雙ME慮RI舟C”或“OP必TI得ON界”鍵輸續(xù)入測(cè)香試號(hào)衡（注淺：as允sa礙y買01為qu永ic誼k抓re垃ad失，最大澡測(cè)試驗(yàn)號(hào)為炎55鉆）；翁按“EN賊TE觀R”鍵修躬改測(cè)勞試的太“NA取ME恐”；再按竹“EN笑TE武R”鍵進(jìn)嗓入下有列菜籌單：按“ME儀TH刪OD挽”鍵選件擇測(cè)涌試的要波長(zhǎng)全類型干（Si徐ng灰le或Du好al富）、波長(zhǎng)吼大小蔥(3暴40給、4失05斧、45捐0、49鬼0或穴63蛇0nm牛)、微孔它板類命型(96凳孔、4嶼8孔希或2癥4孔患)。按“MA扣P”鍵選妖擇閱增讀方梳式(Au妥to或Ma杯nu番al這)異、閱讀瓜方向丙（Do挑wn或Ac帖ro些ss新）、重復(fù)晉方向春（Do美wn或Ac鴉ro味ss獵）、閱讀陰起始沙位置糞（輸尺入編煉號(hào)）灶、空震白Ma街p（Ai捐r、F冰ul閉l、柏Co槽ns監(jiān)t、乞Co嫁lu茂mn接、P綢-D筒ow草n、仁P-催Ac梁ro陣ss棋）。3按“RE選AD乳”鍵，群酶標(biāo)燦板推扇進(jìn)入堂儀器濟(jì)，開(kāi)越始讀志數(shù)并蹤蝶計(jì)數(shù)泉，打穩(wěn)印機(jī)左輸出古數(shù)據(jù)驚。4扇按“MA港IN水M戒EN差U”鍵回傲到主謝菜單屢，關(guān)羊閉電奶源。酶標(biāo)秤板的耀清洗推：采用EL廟x5椒0T肯M型微完孔板禿洗板五機(jī)，巴注射啟泵驅(qū)給動(dòng)的赴液體束輸送江，條姓狀單紅排清室洗或那全板丑清洗了解擺轉(zhuǎn)膜該電泳配原理諷的應(yīng)里用及乒操作We鑄st晃er飽n偉Bl桑ot營(yíng)ti老ng堵o其rim再mu連no餅bl罩ot粒ti憤nga疤sp犬ec教if述ic加p疾ri蝴ma韻ry挖a伴nt暮ib伙od筐y19剩79腰,To托wb炕in19烤75后,So禮ut戲he優(yōu)rn比,蓄So吹ut慢he誦rn艙b同lo炭tt字in暮g19某77道,Al次wi犁ne,凈No替rt克he怠rn曉b揚(yáng)lo倚tt謊in掏g19狠79務(wù),To扔wb愈in,We眼st摘er業(yè)n論Bl丟ot磚ti從ng19逼82淹,Re某ih慶ar愈t,么Ea我st摸er霉n縣bl圣ot壩ti趕ng旦,雙向悟蛋白雖質(zhì)印如記We呢st謠er幕n頓bl欠ot夜ti起ng家:聽(tīng)A撕nt慎ib掙od鈔ie概s賢ca苗n框be酷u泄se導(dǎo)d畏to反d惱et側(cè)ec欣t盆sp鞭ec臣if角ic餡p奔ro謎te架in比sAl疊te型rn胸at錄e任de毫te忠ct炎io炭n翁me藍(lán)th刷od充–膏S炭ec屠on信da丹ry益a練nt駝ib區(qū)od廈ie蒜sMe揪me裂br夢(mèng)an帶e:吸附抽生命縫大分鄰子的蠻固體黨材料NC體,ni蘇tr競(jìng)oc括el堵lu嚼lo匆se硝酸解纖維交素膜塵0混.4享5um結(jié)合鄙率：畢80ugPr聰/c惰m2便宜耳，可提簡(jiǎn)單目快速?gòu)胤忾]素非特驢異性帶抗體殼的結(jié)址合ND叨M,潮n窄yl帆on盲-de喬ns介edme造mb朵ra螞ne尼龍針膜結(jié)合醒率：捐48六0ugPr腎/c苦m2DB階M,di紗az如ob幣en錫zy初lo年xy如me病th信yl重氮巨芐氧皆甲基困膜濕法敘轉(zhuǎn)移綠蛋白蘿質(zhì)：蜜將ge順l和me象mb帥ra弟ne夾在bl戚ot怕te州r更pa還pe販r中，濾浸在蜻轉(zhuǎn)移為裝置梯的bu犯ff很er中，技通電告45mi悲n或ov型er集n循ig豎ht可完銅成。Tr猴an蠟sf驗(yàn)er尤B頓uf憤fe億r塑(5炕00克m擱l,春p置H尿8.艙3)gl此yc女in童e1.止45溉0逼g態(tài)(3仁9mM)Tr俊isba通se役2歌.9副00峽g勁(夏48mM)SD晶S珍0.嫌18圈5騾g限(0事.0項(xiàng)37蒙%)Us孕in攜g偏th仰e森Se濱mi殖-D朗ry登T罰ra著ns吹fe茶r昂Un埋itRe般mo加ve誰(shuí)t狼he脫s稱ta許ck技in劃g儲(chǔ)ge煩l寧fr偉om杠t廉he門g埋el圍.去除車堆積可凝膠賢的凝圍膠。2.句Cu臘t倚pi棟ec利es莫o杜f決bl測(cè)ot鐮te現(xiàn)r傲pa狠pe殼r聞to浪t錢he沉s雙iz準(zhǔn)e費(fèi)of毒t燃he并g杜el俊.no燃te伴:姑th記e腐bl袍ot素te蝕r起pa彎pe貼r究(a涼nd螞t叨he祥m遙em邁br劇an蹤蝶e)步n喊ot班b堅(jiān)e南la淹rg嬌er筒t無(wú)ha洗n如th惜e煉ge租l.得L鑼ar泡ge躬r束pi前ec飾es貿(mào)m德ay冒m鳴ak物e觀co題nt至ac叫t功ar椅ou部nd悄t卸he并g桶el湯,浴an講d奶al悼lo適w手th規(guī)e鹿cu維rr友en逮t纖an作a妥lt慎er曲na蠶te腳r湖ou他te嗓,生th穿er曉eb通y歉ma輕ki宗ng禮t零ra地ns恨fe州r護(hù)in遵ef介fi宗ci站en井t.裁片扛的記輝事簿村紙張?jiān)拇蠊市〉慕饽z蹄。注：饒本記動(dòng)事簿庸紙（隔和膜交）不盆大于更凝膠這。大濁塊的伯可能桂使接奇觸周少圍的芒凝膠扮，并冊(cè)允許棋目前泛的替代路扯線，障從而掀使傳桌輸效晶率。3.江W獲ea鄭ri鮮ng沿g紡lo爬ve章s牲ri們ns辭ed雁o放f亂po說(shuō)wd液er蹦,對(duì)cu煎t尺a票pi捎ec感e吐of跨m退em拼br墾an伍e度to所t慘he吹s幸iz投e封of稀t贊he凍g沙el話.貴Ma么rk兇t聚he毒l喜ow紀(jì)er健r塵ig汽ht套-h窩an稈d弊co透rn梨er兵t訂o鵲al酬lo羨w蓮fo餐r唱or存ie覺(jué)nt龍at內(nèi)io司n.腐P子re惰-w秤et疼t志he結(jié)m奧em克br城an葬e呈in舞t子ra村ns惑fe纏r罩bu炎ff唉er盤f架or弊2襯t該o哥5煎mi升nu板te葵s.戴手己套清夠洗粉書(shū)，剪攜下一載塊膜衡大小周的凝足膠。疼標(biāo)記紋右下念角以紛便方述向。萄濕膜斑轉(zhuǎn)移趟緩沖坊液為2到5分鐘蹈。4.宇s暴an清dw哪ic揭hbl拒ot隆te鋸r頑pa怎pe汽r魄–驕me鎮(zhèn)mb聞ra扎ne薄-立ge災(zāi)l-奏b悶lo經(jīng)tt畝er勝p水a(chǎn)p鍛erma賄ke冠s正ur濕e課no嫁a很ir幅b禽ub產(chǎn)bl本es唉a掀re梨t側(cè)ra磨pp從edTh收e朝me臺(tái)mb徑ra氏ne寒m集us錯(cuò)t游th圖er佩e(cuò)f季or搜e瞇be冬p艇os纏it證io評(píng)ne裙d透co票rr裂ec鑄tl前y清th搬e粗fi牲rs撓t井ti塘me燙.毀Do站n池ot糧t彼ry頑t和o貞ad擇ju畜st摘.三明吵治吸墨掀紙紙–膜凝常膠-記事雞簿紙確保獅沒(méi)有戚氣泡號(hào)被困膜因貿(mào)此必皆須正此確定鑄位第恐一時(shí)反間。夢(mèng)不要癥試圖鎖調(diào)整故。5.孔H條ol巨d圍th鴉e蓄co賤ve咽r撤le吉ve宮l篩an勸d飯sl級(jí)id稻e遵it喊g炭en艙tl峰y排do陣wn攪o似nt鉗o跳th棍e墾st富ac咽k.持有描的封俱面和吳滑動(dòng)練它輕滅輕地正放到駁堆棧6.體w竿ei曬gh獅d困ow款n愉th誘e溫li標(biāo)d斥in現(xiàn)o球rd抬er糠t獄o紛en塔su喊re磁e怕ve戰(zhàn)n變co己nt位ac柱t壓wi竭th惕t先he酷s憑ta映ck遲.權(quán)衡讓下來(lái)晌的蓋餃子，惠以確憲保即許使接餡觸堆瞎棧。7.規(guī)C讓on基ne掃ct婆t燈he責(zé)u純ni狼t你to教a備s寸ui繞ta飽bl哀e焰po柴we遠(yuǎn)r廟su套pp醋ly嶄.Tu羅rn夜t見(jiàn)he邁p監(jiān)ow箭er肌s蓄up媽pl找y俗to糕z貢er茅o紗be冒fo于re妨t梅ur綱ni鵝ng寸o熟n.則T燃ur囑n撐on羞t流he臂p配ow雕er堂s爸up槐pl著y口an菠d萍se屋t慕to磁a