生物分析檢測技術(shù)詳解演示文稿

生物分析檢測技術(shù)詳解演示文稿本文檔共98頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分優(yōu)選生物分析檢測技術(shù)本文檔共98頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分6.何為實(shí)時(shí)？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理9.TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用——基因表達(dá)分析11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹1.醫(yī)療方面2.研究方面

3.其它方面四、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單五、實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究本文檔共98頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熱循環(huán)儀（PCR儀）熒光檢測系統(tǒng)計(jì)算機(jī)及軟件系統(tǒng)本文檔共98頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分不產(chǎn)熱的光源---

發(fā)光二極管（LED）靈敏度高的檢測器---

光電倍增管（PMT）優(yōu)點(diǎn)：

不產(chǎn)熱---無散熱裝置，全封閉無機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)裝置---抗震性強(qiáng)無需經(jīng)常校準(zhǔn)，耐用靈敏度高線性范圍廣本文檔共98頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測熱循環(huán)儀光色:藍(lán)色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes

精確性:±0.3°C激發(fā)光波長：450-495nm發(fā)射光波長:515-545nm

升降溫速率:最高3°C/秒.靈敏度:<5nM的熒光素溫度梯度:有檢測范圍:100-108拷貝容量:96樣品反應(yīng)管:0.2mL反應(yīng)管&96孔板操作系統(tǒng):WindowsNT本文檔共98頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)原理1.定量與常規(guī)的差別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析本文檔共98頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

SYBRGreenI定量原理

確定初始模板的濃度:

初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系：根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量

本文檔共98頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介實(shí)時(shí)熒光定量PCR：其反應(yīng)體系中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。本文檔共98頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分2.熒光擴(kuò)增曲線熒光擴(kuò)增曲線可以分三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。熒光背景信號階段：擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺(tái)期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段：PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。本文檔共98頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分3.熒光閾值和CT值

熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光閾值線的位置一般事實(shí)上位于減去本底的位置上，這時(shí)的熒光信號超過了熒光背景信號并且開始增加。對某一樣品的C（t）值就定義為熒光量與熒光閾值線交叉時(shí)的循環(huán)數(shù)。即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。

定量熒光擴(kuò)增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。本文檔共98頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分4.熔解曲線在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過程中的熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線。繪制熔解曲線時(shí)，Real-TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化過程。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí)，SYBRGreenⅠ的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測到。由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)（熔點(diǎn)，Tm）即為熔解峰值。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，當(dāng)圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬：表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。本文檔共98頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系：起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表CT值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)（如圖3所示）。因些只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本文檔共98頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Thistechnologyisvery

sensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable)Quantitationcanbe"relative"toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,or"absolute"whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.本文檔共98頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分6.何為實(shí)時(shí)？試劑方面：如何做到相對熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是PCR產(chǎn)物的相對量；如何做到相對熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是特定PCR產(chǎn)物的相對量；儀器方面：如何測定相對熒光強(qiáng)度Opticon實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)PCR儀試劑工作原理工作原理哪一步可以觀察到熒光信號？變性；復(fù)性；延伸應(yīng)用本文檔共98頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分7.SYBRGreenI的工作原理

SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部SYBRGreenI染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。SYBRGreenⅠ的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射強(qiáng)熒光信號;而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微弱熒光信號背景，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步。變性：無熒光信號，未結(jié)合SYBRGreenIDye通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物本文檔共98頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分SYBRGreenⅠ的特點(diǎn)由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此通用性好，且價(jià)格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)分子的染料結(jié)合，因此SYBRGreenⅠ的檢測靈敏度很高。但是，由于SYBRGreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析SYBRGreenI。本文檔共98頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分CYBRGreenI

的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)起始模板濃度定量融解曲線分析：可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析

使用方便：不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物沒有序列特異性：可以用于不同的模板便宜靈敏與非特異性產(chǎn)物結(jié)合本文檔共98頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

環(huán)與目標(biāo)序列完全配對

莖由互補(bǔ)配對的序列組成變性:產(chǎn)生非特異性的熒光延伸:沒有熒光本文檔共98頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分分子Beacons是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中：位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（FRET）。本文檔共98頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)：是一個(gè)具有莖－環(huán)（loop-stem）結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，通常有25～35個(gè)核苷酸，兩端分別標(biāo)上一個(gè)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)的部分用于與靶序列雜交（與目標(biāo)序列互補(bǔ)），通常由15～30個(gè)核苷酸組成，要求與靶序列雜交后能形成與探針－靶序列雙螺旋有關(guān)的反式構(gòu)型，并使干的部分打開，盡量得使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開足夠的距離。一般莖（干的部分）一般5-8個(gè)核苷酸長（堿基對），并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。本文檔共98頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，一般連在5’端；而淬滅基團(tuán)一般連在3’端。通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。分子Beacons必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下：

模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；

模板存在時(shí)則與模板配對。自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠得很近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（FRET和直接能量轉(zhuǎn)移），熒光基團(tuán)的能量被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅。。本文檔共98頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分當(dāng)有靶序列存在的時(shí)候，靶序列和分子信標(biāo)的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象改變，干的部分打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止；在有相應(yīng)的單色光激活時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與溶液中靶序列的多少成正比，通過檢測熒光的強(qiáng)度就可以計(jì)算出靶序列的量。Beacons與模板配對后：分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開；當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長的光子。本文檔共98頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分分子Beacons不同于SYBRGreen的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它特異性地檢測感興趣的目標(biāo)DNA。通過精心設(shè)計(jì)分子Beacons和優(yōu)化反應(yīng)條件（溫度和緩沖液）后，其靈敏度非常高，可用于單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的檢測。但是，為檢測某一特定的目標(biāo)DNA，每一個(gè)探針都必須單獨(dú)仔細(xì)地設(shè)計(jì)。

分子Beacons是美國紐約公共健康研究學(xué)會(huì)的技術(shù)專利。本文檔共98頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分MolecularBeacons

的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測對目標(biāo)序列有很高的特異性，用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一熒光背景低設(shè)計(jì)困難無終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高本文檔共98頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分9.

TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理

目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑模板和探針雜交

延伸:聚合反應(yīng)，Taq酶切下5’端熒光素出現(xiàn)熒光本文檔共98頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分TaqMan(水解型雜交探針)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析對目標(biāo)序列有很高的特異性,特別適合于SNP檢測與MolecularBeacons相比，設(shè)計(jì)相對簡單價(jià)格較高只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)

不能進(jìn)行融解曲線分析本文檔共98頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetector

DeborahS.Grove

NucleicAcidFacility,LifeScienceConsortium,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA16802

本文檔共98頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Probe

Aprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforward

andreverseprimers.Theprobeislabeledatthe5‘endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein[6-FAM]，6-羧基熒光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

[TAMRA],6-羧基-四甲基-若丹明)addedatanyTpositionoratthe3'end.TheprobeisdesignedtohaveahigherTm

thantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridized

forsuccessoftheassay.本文檔共98頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter.However,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（內(nèi)在的，固有的）5'to3'nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.

本文檔共98頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Fluorogenic5'nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.本文檔共98頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.TheCt

isinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.

本文檔共98頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.本文檔共98頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples.BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.

Turn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequence

specificprobeisrequired.Userswillalsoneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mm

thermalmicroseal

filmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.本文檔共98頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（數(shù)不清的）.

DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.

GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.Setupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironment

thantraditionalPCRtechniques.Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.本文檔共98頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Allelic(等位基因的)discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.Oneprobelabeledwith6-FAM(6-羧基熒光素)representsoneallele（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.Amismatchleadsto

alessefficientamplification.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.本文檔共98頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal.Heterozygotes（雜合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.Allthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication本文檔共98頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用

——基因表達(dá)分析本文檔共98頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分PRIMERANDPROBEDESIGN

Primersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5'and3'ends.

PE/ABDPrimerExpresssoftware,

whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram.TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10°Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58°Cand60°C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5'Gs.本文檔共98頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase,andtheprobesonly

havetodifferbythatbase.AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.

本文檔共98頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa"probeless"alternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.本文檔共98頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹本文檔共98頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹本文檔共98頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。可以不定期對PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析如：利用熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測等。本文檔共98頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面：比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等），及特定基因在不同相的表達(dá)差異；比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異；驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果；驗(yàn)證RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文檔共98頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分四、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）

以上物品各一套。2~8℃和-20℃或-80℃冰箱混勻器耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心）高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)本文檔共98頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分五、實(shí)時(shí)定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究Microarray最強(qiáng)大的功能是平行分析，在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察上萬種RNA的相對量變，也因?yàn)槠叫刑幚碇?，無法對每一個(gè)probe做最佳化、標(biāo)準(zhǔn)化，所以目前大部份結(jié)果都會(huì)再以

NorthernblotorReal-timequantitativePCR再做確認(rèn)。雖然Northernblot在過去曾扮演十分稱職的角色，但有時(shí)microarray篩選出來的基因常有上千個(gè)譜，以傳統(tǒng)方法來驗(yàn)證，仍是耗費(fèi)人力物力的苦差事。

Real-timequantitativePCR

在近年來迅速普及，原因在其高靈敏度、快速及精確，樣品需求量少也是很重要的優(yōu)勢，是最適合承接microarray驗(yàn)證的工具。本文檔共98頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

LaserCapturedMicrodissection(LCM)

RealTimeQuantitativePCR：量化組織中特定基因之表現(xiàn)共聚焦顯微影像系統(tǒng)(ConfocalImagingSystem)流速細(xì)胞篩選分析系統(tǒng)(FlowCytometry)以上技術(shù)就基因表現(xiàn)之各個(gè)面相作系統(tǒng)探討。

本文檔共98頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分本文檔共98頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

實(shí)驗(yàn)程序（舉例）RNA的定量：RNA的測量儀上，以NonoDrop軟件進(jìn)行RNA的定量(ng/μl)。如濃度過高必須稀釋后再定量，以便定量盡可能地準(zhǔn)確。同時(shí)，可從260/280的比值看出RNA的純度(一般在之間)是否在要求的范圍內(nèi)。RNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA模板的稀釋：用作RNA反轉(zhuǎn)錄的RNA量，在鹽芥和擬南芥兩種材料、各200mMNaCl處理2小時(shí)及對照的4種RNA之間必須完全準(zhǔn)確一致，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的RNA量均為2000ng。以下的反轉(zhuǎn)錄體系中RNA和RNase-freeH2O的總體積為8.5μl

。本文檔共98頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分RNA+RNase-freeH2O：8.5μl(2000ngRNA)Oligo-dT18(500ng/μl)：0.5μldNTP(2.5mM/each)：4μl計(jì)

：13μl該體系于65-70℃，5min；置于冰上冷卻后，加下面反應(yīng)體系：5×

RTBuffer：4μl0.1MDTT：2μlSuperScriptIIIRT：1μl總計(jì)：20μl混勻，50℃保持6小時(shí)或過夜，即得到20μlcDNA；該cDNA稀釋20倍，即為400μl稀釋的cDNA，此用于實(shí)時(shí)定量PCR作為反應(yīng)模板。

本文檔共98頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分DTT即Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4H10O2S2。

是一種常用d的小分子有機(jī)還原劑，有抗氧化作用。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）。DTT的異構(gòu)體為Dithioerythritol（DTE），即DTT的氧化結(jié)構(gòu)。

本文檔共98頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)

SYBR?GreenPCRMasterMix：12.5μl稀釋的cDNA模板：2μlPrimer-F：1μlPrimer-R：1μl總計(jì)：25μl

本文檔共98頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分2-ΔΔCT方法與相對基因表達(dá)差異的分析使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理，標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），β-actin(細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin)、β2-microglobulin(微球蛋白)以及rRNA；當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理的影響。

本文檔共98頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分相對定量的方法分析基因表達(dá)差異(i)選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因；(ii)確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理的影響；(iii)通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板，確保它們的

擴(kuò)增效率相同。(iv)最后通過2-ΔΔCT計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始CT值。ΔΔCT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異;

2-ΔΔCT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法。本文檔共98頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Giovanna(2002)提出“相對CT”或“δ-δCT”的方法，這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要為每次實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需要一個(gè)優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的、至少是相似的反應(yīng)效率即可。比較CT方法的優(yōu)點(diǎn)是無需標(biāo)準(zhǔn)曲線、適合多個(gè)樣品，當(dāng)然它也消除了創(chuàng)造標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)任何稀釋錯(cuò)誤的不利影響。

本文檔共98頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分相比于標(biāo)準(zhǔn)子(normalizer)，比較CT法(ΔΔCT)在對模板進(jìn)行相對定量、監(jiān)測基因的表達(dá)水平時(shí)，不需標(biāo)準(zhǔn)曲線并增加了樣品的通量；為了使這個(gè)方法成功應(yīng)用，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等。只要靶基因和標(biāo)準(zhǔn)者具有相似的動(dòng)力學(xué)范圍，比較CT(ΔΔCT)方法就是最具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的方法。本文檔共98頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分2-ΔΔCT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型；本實(shí)驗(yàn)中參照因子是未經(jīng)NaCl處理的對照樣品；內(nèi)標(biāo)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的看家基因Actin。根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)值，使用公式：

1.9-ΔΔCT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)基因在兩種處理情況下的表達(dá)水平均來自3次實(shí)時(shí)定量PCR的平均值。本文檔共98頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Ct-ActinCt(control)Ct-ActinCt(200mMNaCl處理)deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDev本文檔共98頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分ThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia(缺氧癥）ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner,IsabelleDupuis,andCrisKuhlemeier*InstituteofPlantSciences,Altenbergrain21,CH–3013Berne,SwitzerlandPlantPhysiology,June2003,Vol.132,pp.968–978,?2003AmericanSocietyofPlantBiologists本文檔共98頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分Fermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen,mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress.

Pyruvatedecarboxylase

(PDC,丙酮酸鹽(或酯)脫羧酶),whichcatalyzesthefirststepinthispathway,isthoughttobethemainregulatoryenzyme.PDCis

encodedbyfourcloselyrelatedgenes

inArabidopsis.

Usingreal-timequantitativepolymerasechainreaction,wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgene

indifferenttissues,undernormalgrowthconditions,andwhentheplantsweresubjectedto

anoxiaorotherenvironmentalstressconditions.本文檔共98頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期二\3點(diǎn)8分

PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses.Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genefamily.Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia，butALDH2B7

reactsstronglyto

ABAapplicationand

dehydration,suggestingthatALDHmayplayarolein