第4講+細胞融合與體細胞雜交

第4講細胞融合與體細胞雜交(zájiāo)新品種培育(péiyù)技術(shù)第一頁，共七十一頁。1精選ppt第二頁，共七十一頁。2精選ppt雜交(zájiāo)1.通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對。雜交優(yōu)勢：兩個(liǎnɡɡè)遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。一般情況下，通過生殖細胞相互融合而達到這一目的過程稱為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。由體細胞相互融合達到這一結(jié)果的過程稱為體細胞雜交。第三頁，共七十一頁。3精選ppt部分野生品種的塊莖、果實雖不能食用，但它們的植株具有較強的抗病蟲害、抗鹽堿性(jiǎnxìnɡ)和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生存能力較強的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本更為健壯(jiànzhuàng)，產(chǎn)量更高。雜交(zájiāo)擬南芥（中間）比其親本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科學家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長更大更好的原因:負責光合作用和淀粉代謝的基因在白天要更為活躍第四頁，共七十一頁。4精選ppt第五頁，共七十一頁。5精選ppt不親和性不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個體的細胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精(shòujīng)或接合不能正常進行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無繁殖能力等。是雙親個體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機理之一。種間不親和性：異種、異屬生物個體之間的生殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠緣則不親和性越高，直到完全不能受精。種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。第六頁，共七十一頁。6精選ppt遠源(yuǎnyuán)雜交遠緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠緣的種內(nèi)亞種之間個體的交配稱為遠緣雜交。由于種屬間存在著種種隔離機制，致使(zhìshǐ)遠緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠緣雜種表現(xiàn)不育。體細胞雜交是解決遠源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種第七頁，共七十一頁。7精選ppt視頻(shìpín)：/special/show_3043714/ACRkYAQc9LIhIUwv.html第八頁，共七十一頁。8精選ppt第九頁，共七十一頁。9精選ppt第一(dìyī)部分細胞融合第十頁，共七十一頁。10精選ppt一定義(dìngyì)與意義細胞融合（Cellfusion）是指用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術(shù)。對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細胞是體細胞，也叫“體細胞雜交（somaticcellhybridization）”。由于它不僅(bùjǐn)能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此細胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細胞、培育新品種方面意義重大。第十一頁，共七十一頁。11精選ppt二細胞融合的分類(fēnlèi)1.材料：原生質(zhì)體（去除了細胞壁的裸露的細胞）、動物細胞。2.從親本來源：（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細胞融合(rónghé)成的融合(rónghé)細胞。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細胞。3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetricfusion）：兩個完整的細胞間的融合。（2）不對稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再與另外一個完整細胞進行融合。第十二頁，共七十一頁。12精選ppt原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B同質(zhì)(tónɡzhì)融合（B+B）異質(zhì)(yìzhì)融合（A+B）同核體（BB）異核體（AB）核融合(rónghé)B的核丟失雜種細胞（A+B）B的染色體丟失胞質(zhì)雜種不對稱雜種B的染色體部分丟失第十三頁，共七十一頁。13精選ppt三發(fā)展(fāzhǎn)歷史自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞情況。動物體內(nèi)的破骨細胞也是自發(fā)融合形成的多核細胞。1962年日本學者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞的現(xiàn)象。20世紀70年代初，華裔加籍科學家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使(cùshǐ)植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細胞融合的研究。20世紀80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導細胞融合方法。第十四頁，共七十一頁。14精選ppt第十五頁，共七十一頁。15精選ppt主要(zhǔyào)環(huán)節(jié)（1）親本選擇(xuǎnzé)（單細胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細胞橋（4）胞質(zhì)滲透（5）細胞核融合（6）融合細胞篩選第十六頁，共七十一頁。16精選ppt原生質(zhì)體及其制備(zhìbèi)（1）定義：去除細胞壁后裸露的細胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點：無細胞壁，可以(kěyǐ)方便地進行遺傳操作、人工誘變、細胞器轉(zhuǎn)移、細胞融合等操作。具有全能性，能再生細胞壁。第十七頁，共七十一頁。17精選ppt（3）制備(zhìbèi)第十八頁，共七十一頁。18精選ppt兩步法：

酶分離法果膠酶處理(chǔlǐ)材料游離(yóulí)出單細胞纖維素酶處理(chǔlǐ)單細胞分離出原生質(zhì)體優(yōu)點：所獲得的原生質(zhì)體均勻一致、質(zhì)量好；缺點：操作復雜，已被淘汰。第十九頁，共七十一頁。19精選ppt一步法外植體酶液配制(pèizhì)：注意纖維素酶、果膠酶和滲透壓穩(wěn)定劑（甘露醇）的配比及pH酶液離心(líxīn)過濾滅菌(mièjūn)后-20℃保存外植體放入酶液，真空泵抽引滲透處理26℃搖床振蕩2-8小時第二十頁，共七十一頁。20精選ppt（4）分離(fēnlí)、鑒定與活力分析（1）分離飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖(zhètáng)、Percoll、Ficoll等。沉降法：低速離心，收集沉淀。不連續(xù)梯度法:無菌下，濃度較高溶液（如20%蔗糖(zhètáng)溶液）加入離心管加入原生質(zhì)體混合液封口后，離心，原生質(zhì)體漂浮在上面用吸管收集原生質(zhì)體液面，放入液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用飄浮法第二十一頁，共七十一頁。21精選ppt沉降(chénjiàng)法

微孔(wēikǒnɡ)濾膜過濾酶混合液低速(dīsù)離心3-5min棄去上清液和酶液液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次除去未消化的組織細胞使原生質(zhì)體沉淀將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用第二十二頁，共七十一頁。22精選ppt不連續(xù)梯度法

離心管中配制(pèizhì)成不同的濃度梯度加入(jiārù)原生質(zhì)體混合液離心5min，原生質(zhì)體位于(wèiyú)某一濃度梯度，用吸管收集液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用第二十三頁，共七十一頁。23精選ppt葉片原生質(zhì)體分離純化流程圖第二十四頁，共七十一頁。24精選ppt（2）鑒定與活力分析低滲爆破(bàopò)法：爆破后是無形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色法：有活力的原生質(zhì)體吸收不同染料顯示與死亡細胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細胞的觀察確定細胞活性第二十五頁，共七十一頁。25精選ppt酚藏花紅(huāhóng)染色法（0.1%)酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料，活細胞不攝取。 氧電極法：有活力原生質(zhì)體光照下放出(fànɡchū)氧氣，黑暗耗氧氣 第二十六頁，共七十一頁。26精選ppt關(guān)鍵(guānjiàn)：細胞核的融合第二十七頁，共七十一頁。27精選ppt五細胞融合方法(fāngfǎ)1.生物法病毒誘導細胞融合：研究最早的細胞融合誘導方法。主要是由于病毒會與宿主細胞膜直接融合，同時進入兩個細胞就會打破兩個細胞膜的隔閡，引發(fā)細胞質(zhì)的交流，進而達到細胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進細胞融合的功能。仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細胞。因此，目前已經(jīng)(yǐjing)很少使用病毒誘導法進行細胞融合。第二十八頁，共七十一頁。28精選ppt原理(yuánlǐ)與過程（1）足夠量的病毒顆粒(kēlì)附著在細胞膜上起搭橋作用，使細胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細胞間形成通道，細胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進入細胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細胞核融合，形成雜種細胞。第二十九頁，共七十一頁。29精選ppt2化學法可以采用(cǎiyòng)的化學誘導劑包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。細胞膜電荷平衡被打破。第三十頁，共七十一頁。30精選ppt（1）NaNO3誘導(yòudǎo)融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復并伴隨著細胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細胞雜種。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進細胞融合。NaNO3對原生質(zhì)體無損害(sǔnhài)，但融合效率低，一般小于4%。第三十一頁，共七十一頁。31精選ppt（2）高pH的高濃度Ca2+離子(lízǐ)誘導融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子(lízǐ)溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達到10%。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細胞膜表明表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細胞融合。第三十二頁，共七十一頁。32精選ppt（3）PEG誘導(yòudǎo)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均(píngjūn)分子量在200－20,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。

PEG分子具有輕微的負極性，可以與具有正極性基團的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當PEG分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團可能與另外一個原生質(zhì)體中帶負電的基團相連，導致原生質(zhì)體融合。第三十三頁，共七十一頁。33精選ppt（4）高Ca2+和pH誘導(yòudǎo)PEG結(jié)合誘導第三十四頁，共七十一頁。34精選ppt細胞融合例子(lìzi)1

甘藍與大白菜的化學誘導融合第三十五頁，共七十一頁。35精選ppt第三十六頁，共七十一頁。36精選ppt第三十七頁，共七十一頁。37精選ppt第三十八頁，共七十一頁。38精選ppt第三十九頁，共七十一頁。39精選ppt3物理(wùlǐ)法電融合誘導法（Electrofusion）：利用電場來誘導細胞彼此連接成串，再施加瞬間強脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進細胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激(cìjī)下，細胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而連接，直到閉合成完整的膜形成融合體。優(yōu)點：融合率高、重復性與可控制性強。缺點：可能會造成不可恢復的細胞損傷。第四十頁，共七十一頁。40精選ppt第四十一頁，共七十一頁。41精選ppt細胞融合舉例2

——薄荷的電誘導(yòudǎo)融合第四十二頁，共七十一頁。42精選ppt第四十三頁，共七十一頁。43精選ppt六融合細胞(xìbāo)篩選因融合(rónghé)的隨機性而成為細胞融合(rónghé)的關(guān)鍵而必需的技術(shù)第四十四頁，共七十一頁。44精選ppt1篩選(shāixuǎn)的原因與必要性細胞融合是一個隨機的物理過程，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過(tōngguò)培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細胞，分離出需要的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預見有哪些形式的細胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。未融合的A，B。第四十五頁，共七十一頁。45精選ppt2雜種(zázhǒng)細胞篩選方法（1）細胞(xìbāo)形態(tài)大小差異

(2)熒光標記選擇（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異第四十六頁，共七十一頁。46精選ppt。

FITC(異硫氰酸熒光素)在熒光顯微鏡下呈綠色(lǜsè)RITC(異硫氰酸羅丹明)

RITC在熒光顯微鏡下呈紅色第四十七頁，共七十一頁。47精選ppt（4）選擇性培養(yǎng)基篩選法：互補選擇法.利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞的方法。例如：利用抗性標記、酶缺陷型、激素需求(xūqiú)差異等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細胞由于雙親互補作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。第四十八頁，共七十一頁。48精選ppt原生質(zhì)體矮牽牛爬山虎冠癭混合體融合(rónghé)處理矮牽牛+爬山虎細胞(xìbāo)團愈傷組織(zǔzhī)（異核體）NT培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(無激素)NT培養(yǎng)基NT培養(yǎng)基細胞團MS培養(yǎng)基(無激素)死亡MS培養(yǎng)基(有激素)愈傷組織原生質(zhì)體細胞團MS培養(yǎng)基(無激素)死亡愈傷組織第四十九頁，共七十一頁。49精選ppt細胞融合例子3：

利用抗性標記進行(jìnxíng)的融合細胞篩選第五十頁，共七十一頁。50精選ppt第五十一頁，共七十一頁。51精選ppt費氏中華(Zhōnghuá)根瘤菌第五十二頁，共七十一頁。52精選ppt七細胞融合的應(yīng)用(yìngyòng)植物：體細胞雜交培育新品種動物(dòngwù)：單克隆抗體生產(chǎn)（動物(dòngwù)細胞生物制藥講授）第五十三頁，共七十一頁。53精選ppt第二部分(bùfen)體細胞雜交Somaticcellhybridization第五十四頁，共七十一頁。54精選ppt一體細胞雜交育種(zájiāoyùzhǒnɡ)的意義1克服有性不親和性，實現(xiàn)遠源遺傳重組。2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點？植物的抗逆性多為多基因控制(kòngzhì)，因此易于實現(xiàn)多基因控制性狀。第五十五頁，共七十一頁。55精選ppt二技術(shù)(jìshù)路線關(guān)鍵技術(shù)：細胞融合、組織培養(yǎng)第五十六頁，共七十一頁。56精選ppt三植物(zhíwù)新品種培育解析

文獻(wénxiàn)討論第五十七頁，共七十一頁。57精選ppt例子(lìzi)4：屬間體細胞雜交第五十八頁，共七十一頁。58精選pptMES:2-(N-嗎啡(mafēi)啉）乙磺酸

CPW是胞-原生質(zhì)體清洗液成份(chéngfèn)有KH2PO4KNO3CaCl2,2H2OMgSO4.7H2OKICuSO4.5H2O第五十九頁，共七十一頁。59精選ppt第六十頁，共七十一頁。60精選ppt第六十一頁，共七十一頁。61精選ppt石炭酸品紅(pǐn