基因診斷-課件

基因診斷GeneDiagnosis1PPT課件人類疾病的原因內(nèi)因：基因結(jié)構(gòu)改變（基因突變）——點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增

基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性

基因表達(dá)異常外因：

病原體的侵入2PPT課件對于疾病的診斷依據(jù)：臨床表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)：細(xì)胞學(xué)檢查生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶的活性變化檢查免疫學(xué)檢驗(yàn)

基因診斷3PPT課件一、基因診斷概述(一)基因診斷的概念與特點(diǎn)(二)基因診斷的基本原理與臨床意義4PPT課件(一)基因診斷的概念與特點(diǎn)1．概念：指利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA或RNA水平檢測基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，對疾病作出診斷的方法和過程?；蛟\斷以DNA和RNA為診斷材料，

DNA診斷RNA診斷5PPT課件2．基因診斷的特點(diǎn)：（1）直接檢測基因，屬病因診斷，針對性強(qiáng)；（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。6PPT課件基因診斷的評價(jià)特異性靈敏度重復(fù)性快速經(jīng)濟(jì)7PPT課件(二)基因診斷的基本原理與臨床意義1．基本原理：

通過檢測致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因）的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否及表達(dá)水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。2．臨床意義:

對有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷

早期快速診斷

確定個(gè)體對疾病的易感性疾病的分期分型、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等

8PPT課件二、基因診斷的常用技術(shù)與方法(一)基因診斷的常用技術(shù)(二)基因診斷的基本方法9PPT課件(一)基因診斷常用技術(shù)核酸分子雜交PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）限制性酶切分析SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）DNA測序DNA芯片技術(shù)10PPT課件基因診斷技術(shù)分類1、Molecularhybridization：

Southern,Northern,dotblot,2、PCR3、DNA測序4、DNA芯片技術(shù)11PPT課件1.核酸分子雜交

MolecularhybridizationSouthernblot——DNANorthernblot——RNADotblot，InSituHybridization,12PPT課件核酸雜交的基本原理：利用核酸變性和復(fù)性理論：（1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（2）具有互補(bǔ)堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補(bǔ)配對原則通過氫鍵結(jié)合為雙鏈。13PPT課件核酸分子雜交的流程示意圖待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參與雜交的探針檢測雜交信號制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)記核酸探針14PPT課件探針的種類DNA

探針:基因組DNA探針;基因探針cDNA探針:目前應(yīng)用最廣泛的寡核苷酸探針(Oligonucleotideprobes)RNA探針:15PPT課件

不同的探針在應(yīng)用中有各自的特點(diǎn),但最重要的是探針的序列選擇.而探針序列又是依據(jù)待測核酸序列選擇的。對致病性微生物應(yīng)選用其最保守、最特異的序列；對突變基因的檢測，應(yīng)用含有突變位點(diǎn)的序列或待測基因編碼的ｍＲＮＡ序列。16PPT課件探針的標(biāo)記物放射性標(biāo)記物32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)記物生物素，地高辛，熒光素，酶，金屬17PPT課件SouthernblotNNTTNTT18PPT課件1、Southernblot：用于DNA檢測，不但能檢測出特異的DNA片段，還能進(jìn)行定位和測定分子量，可用于基因的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等。2、Northernblot：雜交用于RNA檢測，能對組織細(xì)胞中的總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析。3、dotblot：既可檢測DNA也或檢測RNA，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析。缺點(diǎn)：特異性較低，不能鑒定所分析的基因分子量。4、原位雜交：在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位。19PPT課件PCR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成的過程（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)20PPT課件PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡單、省時(shí)對待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)21PPT課件1、直接采用PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性的基因，可以確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)的體內(nèi)基因缺失或基因突變

22PPT課件2、采用PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成和順序發(fā)生改變，會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消失。因此，突變基因經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會(huì)發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷突變是否存在。即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。

PCR－RFLP就是利用PCR技術(shù)先將包含待測位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增出來，然后用識別該位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶水解，根據(jù)限制性片段數(shù)量和長度作出診斷。23PPT課件3、采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ASO）原理：針對已知突變位點(diǎn)的基因，可以分別針對已知突變位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無突變序列互補(bǔ)，另一個(gè)為突變型探針，與突變序列互補(bǔ)。同時(shí)設(shè)計(jì)探針時(shí)，突變堿基應(yīng)位于探針的中央，這樣在嚴(yán)格控制雜交和洗脫條件下，只有完全互補(bǔ)的探針保留下來，形成穩(wěn)定雜交分子，而中央堿基與靶序列不匹配的探針則被洗脫。24PPT課件

PCR/ASO則是采用PCR擴(kuò)增受檢者基因的目標(biāo)片段，并與相應(yīng)的ASO探針雜交，如果受檢者DNA擴(kuò)增的產(chǎn)物與正常探針雜交，而不與突變探針雜交，表示受檢者不存在突變基因；如果只有突變探針可以雜交，說明突變基因?yàn)榧兒献?；如果兩者都存在，則說明突變基因?yàn)殡s合子。采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)25PPT課件

βΑ/βΑ

βΑ/βS

βS/βS

正常探針

突變探針26PPT課件4、PCR產(chǎn)物的反相點(diǎn)雜交分析技術(shù)

此項(xiàng)技術(shù)與PCR/ASO技術(shù)原理完全相同，只是雜交時(shí)采用的是反相雜交。是將探針固定在膜上成為固定相，用PCR產(chǎn)物作為液體相，進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。27PPT課件

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方法。DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈DNA會(huì)因其分子內(nèi)堿基之間的相互作用，形成一定的立體構(gòu)象。相同長度的單鏈DNA會(huì)因分子內(nèi)堿基組成或排列順序不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。對長度相同而構(gòu)象不同的單鏈DNA在非變性聚丙烯胺凝膠電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率。

5、采用PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進(jìn)行基因診斷28PPT課件

PCR-SSCP技術(shù)就是利用PCR擴(kuò)增目的基因片段，通過變性成為單鏈，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸的改變會(huì)造成DNA片段構(gòu)象的改變，其遷移率也會(huì)改變，從而檢測基因的突變。29PPT課件30PPT課件

該技術(shù)是先制備濃度從低到高的變性劑的凝膠，然后將待測分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，到DNA電泳到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性的位置時(shí)，DNA雙鏈分開，由于不同DNA片段的堿基組成不同，因此在凝膠中泳動(dòng)發(fā)生變性的位置不同，遷移率也不同，因此可以將相同長度但堿基組成不同的DNA片段分開，從而能檢測出基因的突變。6、采用PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳技術(shù)31PPT課件

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前新的研究熱點(diǎn)之一。如在一般正常的細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CPG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。因此DNA甲基化研究是一熱點(diǎn)。7、甲基化特異性PCR技術(shù)32PPT課件

將DNA先用亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對引物，一對為甲基化特異性的引物（primerⅠ），一對為非甲基化的引物（primerⅡ），進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終可以確定研究DNA片段部位的甲基化情況。甲基化特異性PCR技術(shù)（MS-PCR）33PPT課件34PPT課件以上介紹的基于PCR擴(kuò)增技術(shù)建立的基因診斷技術(shù)，只能提供定性結(jié)果，即有無突變。但對基因表達(dá)異常的疾病，上述方法無法滿足需要，還需要研究其基因的表達(dá)量上的變化分析，故還可運(yùn)用PCR定量分析基因表達(dá)。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀釋法、極限稀釋法、非競爭性對照法、競爭抑制法、

熒光定量PCR8、采用PCR技術(shù)進(jìn)行靶核酸的定量分析35PPT課件PCR擴(kuò)增有限性-平臺期及平臺效應(yīng)（plateaueffect）

PCR擴(kuò)增的平臺效應(yīng)36PPT課件梯度（系列）稀釋法：在擴(kuò)增檢測待測樣本的同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋的已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增的待測樣本中PCR模板的相對量.必須在擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行優(yōu)點(diǎn)：簡單，可作粗糙的定量分析。缺點(diǎn)：不準(zhǔn)確，影響因素多。

37PPT課件首先將原始模板進(jìn)行梯度稀釋;然后對該稀釋系列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測定;最低的陽性樣本被認(rèn)為含有與一已知的標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最后的陽性樣本中相同量的PCR模板基本依據(jù)：PCR擴(kuò)增的有效起始模板分子數(shù)為104～106個(gè)改良方法：極限稀釋分析38PPT課件39PPT課件非競爭性對照基因定量法該定量法是靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增。即在同樣的反應(yīng)條件下，在一個(gè)試管內(nèi)同步擴(kuò)增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列(通常是管家基因或它們的mRNA)。通過比較兩種序列的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的顏色強(qiáng)度對靶基因定量。40PPT課件競爭PCR與前述方法相似，即靶基因與參考標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，但參照標(biāo)準(zhǔn)通常是一段人工合成的模板而不是內(nèi)源性基因。競爭PCR必須構(gòu)建一個(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)能與靶基因競爭聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物能通過電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區(qū)分開來。將競爭模板作系列稀釋后，加入到恒量的樣品DNA進(jìn)行PCR，通過分離和分析競爭模板與樣品DNA產(chǎn)量，對樣品DNA進(jìn)行定量分析。競爭性PCR：41PPT課件3.DNA

sequencingDNA序列測定是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù)42PPT課件例：四色熒光自動(dòng)測序分析結(jié)果43PPT課件44PPT課件4.DNA芯片技術(shù)

DNAchipsormicroarray45PPT課件

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交的檢測分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）

由于在制備過程中運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)的概念46PPT課件DNA芯片技術(shù)原理大規(guī)模集成的固相雜交基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對、變性和復(fù)性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息47PPT課件第二節(jié)對不同疾病采用不同基因診斷的策略

人類疾病多種多樣，致病原因不同，因此在基因診斷上也有不同途徑和策略。1、對致病基因已經(jīng)找到、發(fā)生機(jī)制清楚的疾病，可以通過直接檢測致病基因進(jìn)行基因診斷。如：病原微生物的感染：病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌等，及與疾病有關(guān)的機(jī)體內(nèi)源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

48PPT課件2、對致病基因還沒找到，發(fā)生機(jī)制也沒有完全清楚，但致病基因已定位于染色體或基因組的特定區(qū)域的疾病，可以通過檢測致病基因的聯(lián)鎖遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷。

如：用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，利用該遺傳標(biāo)記與相鄰的基因在遺傳過程中分離幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖特點(diǎn)，建立了染色體基因連鎖圖，根據(jù)基因連鎖圖，通過分析連鎖基因的遺傳標(biāo)記，可判斷致病基因存在的可能性。第二節(jié)對不同疾病采用不同基因診斷的策略49PPT課件3、對多因素、多基因疾病，可以通過檢測表型克隆基因進(jìn)行基因診斷。第二節(jié)對不同疾病采用不同基因診斷的策略如高血壓、冠心病、腫瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病發(fā)生的原因復(fù)雜，涉及多基因、多因素。因此可采用表型克隆方法來分析診斷。原理：從分析正常和異?；蚪M采用差異顯示等技術(shù)找到正常人和疾病患者之間的差異序列，進(jìn)行克隆。根據(jù)克隆的一組基因差異序列制作相應(yīng)探針，用制備的這一組探針檢測相關(guān)疾病的方法。50PPT課件第二節(jié)對不同疾病采用不同基因診斷的策略4、對一些因基因表達(dá)異常出現(xiàn)的疾病，可通過基因表達(dá)的定量分析進(jìn)行基因診斷。對與基因表達(dá)異常出現(xiàn)的疾病，可以在轉(zhuǎn)錄水平上對該基因的表達(dá)的mRNA量進(jìn)行分析，作出診斷。51PPT課件第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景1.雜交基礎(chǔ)上的RFLP分析（20世紀(jì)80年代）2.PCR及其衍生技術(shù)3.基因芯片技術(shù)基因診斷的發(fā)展歷史52PPT課件第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景1.理論2.技術(shù)3.倫理基因診斷過程中存在的問題53PPT課件

遺傳病的基因診斷是在基因水平上對核酸堿基序列突變的檢測，從遺傳物質(zhì)的分子水平上揭示疾病的發(fā)生原因和分子機(jī)制。遺傳病的診斷分為產(chǎn)前檢查、癥狀前診斷和癥狀后診斷。遺傳病的基因診斷是進(jìn)行產(chǎn)前檢查和癥狀前診斷的唯一選擇，也是遺傳病預(yù)防最為有效的手段。第四節(jié)、基因診斷技術(shù)檢測遺傳病54PPT課件基因診斷技術(shù)途徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷途徑。第四節(jié)遺傳病的基因診斷55PPT課件第四節(jié)遺傳病的基因診斷直接診斷：檢測已知致病基因

必要條件①被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系：②被檢基因的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知。56PPT課件

1.點(diǎn)突變：（1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變

直接診斷：檢測已知致病基因57PPT課件血紅蛋白病可以由血紅蛋白結(jié)構(gòu)或合成異常所致的遺傳性疾病。前者稱為異常血紅蛋白病，后者稱為地中海貧血。針對異常血紅蛋白病如鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是由于珠蛋白基因的第6位密碼子GAG突變成GTG，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常。對此遺傳病的基因診斷可采用PCR-限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)。鐮狀紅細(xì)胞貧血HBS-Beta株蛋白基因突變：58PPT課件×5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR-RE分析MstII

CCTGAGG-CCTGTGG59PPT課件+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析60PPT課件1.點(diǎn)突變：（2）無限制性酶切位點(diǎn)改變

直接診斷：檢測已知致病基因

PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交等技術(shù)。PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、簡易地檢測已知突變。

61PPT課件Β地中海性貧血基因診斷（PCR-ASO）已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行SouthernBlot雜交/斑點(diǎn)雜交。

NormalβΑGeneProbe——與正常βΑ雜交MutationβSGeneProbe——與異常βS雜交62PPT課件

βΑ/βΑ

βΑ/βS

βS/βS

正常探針

突變探針63PPT課件1、Gene缺失遺傳病的診斷1）α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)αGene時(shí)可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe64PPT課件以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αα

αα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb65PPT課件直接診斷：檢測已知致病基因

在DNA序列上有較長一段序列的重新排布。包括大片段（數(shù)十個(gè)堿基甚至數(shù)千個(gè)堿基）的丟失、插入、取代、復(fù)制放大和倒位等，這些突變進(jìn)而引起更大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)上的改變從而影響多個(gè)基因的功能，即染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等2.基因重排\缺失：核酸分子探針雜交與PCR66PPT課件

（1）Southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交，通過設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)于缺失區(qū)域的核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測不到雜交信號（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技術(shù)成功地同時(shí)擴(kuò)增了人類杜氏肌營養(yǎng)不良蛋白基因的多個(gè)基因座

直接診斷：檢測已知致病基因67PPT課件杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷DMD是一種嚴(yán)重致死性疾病（XR），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。病因是抗肌萎縮蛋白基因突變所致。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個(gè)Exon，cDNA全長13974bp，編碼3685Aa，分子量427kD。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。68PPT課件1.DNAMarker2.陽性對照3.孕婦

1.DNAMarker2.陽性對照3.孕婦4.胎兒

5.陰性對照

4.胎兒

5.陰性對照采用多重PCR法擴(kuò)增該基因的多個(gè)外顯子69PPT課件3.基因表達(dá)異常mRNA的相對定量分析mRNA長度分析直接診斷：檢測已知致病基因70PPT課件二、遺傳病間接診斷當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gene本身尚未知時(shí)，主要通過Gene和遺傳標(biāo)記的連鎖分析間接地作出診斷。連鎖分析基于遺傳標(biāo)記與Gene在染色體上連鎖，通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析子代獲得某種遺傳標(biāo)記與疾病的關(guān)系，間接推斷受檢子代是否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判斷并做出診斷。遺傳標(biāo)記（限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA序列、單核苷酸多態(tài)性等）71PPT課件1Southernblot--RFLP診斷(PKU)

PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。間接基因診斷72PPT課件患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷73PPT課件成年型多囊腎病的基因診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13.3，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。74PPT課件以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行SouthernBlot

基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診斷75PPT課件結(jié)果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

76PPT課件結(jié)果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德爾方式遺傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診斷正常.77PPT課件遺傳疾病的基因診斷方法基因異常方法探針、引物或限制酶基因組DNA印跡雜交缺失基因的探針基因缺失PCR擴(kuò)增引物包括缺失或在缺失部位內(nèi)

RFLP分析突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶點(diǎn)突變ASO雜交正常和異常的ASO探針PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析（SSCP）引引物包括突變部位基因未知與疾病連鎖的多態(tài)性分析與疾病連鎖的多態(tài)位點(diǎn)探針或引物78PPT課件腫瘤的基因診斷腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素；發(fā)生過程呈多階段性，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，同時(shí)不同的腫瘤發(fā)生機(jī)制也不相同，因此在腫瘤的基因診斷時(shí)，無法采用統(tǒng)一的策略。79PPT課件策略一、通過檢測腫瘤染色體異位及融合基因診斷淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中,染色體異位和重排發(fā)生較為普遍.臨床上出現(xiàn)的炎癥性淋巴結(jié)腫大與淋巴瘤腫大的鑒定:在淋巴瘤細(xì)胞中，T細(xì)胞受體（TCR）基因和IgH基因發(fā)生重排，原來相隔數(shù)百個(gè)堿基的IgH基因和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)基因就會(huì)靠近在一起，而炎癥增生性細(xì)胞內(nèi)就不會(huì)發(fā)生基因重排，故通過PCR擴(kuò)增可以鑒定之。80PPT課件策略二、通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。多數(shù)腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中都檢測到癌基因與抑癌基因的突變。用基因診斷方法：定量PCR、印跡技術(shù)、PCR-SSCP等檢測。如ras癌基因，其激活的分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變，因此可通過PCR-ASO、PCR-SSCP等方法。

P53基因是抑癌基因，在腫瘤組織中其常發(fā)生突變而失活。因此可通過PCR-SSCP、DNA測序分析等，可檢測P53基因的突變。81PPT課件策略三、通過檢測腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宮頸癌EB病毒HBV、HCV人類乳頭瘤病毒HPV82PPT課件策略四、檢測腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤