現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)

現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)(ModernHistochemicalTechnology)

第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代組織化學(xué)的內(nèi)容

1、經(jīng)典組織化學(xué)

2、免疫組織化學(xué)

3、電鏡與免疫電鏡組織化學(xué)

4、原位雜交組織化學(xué)第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月組織化學(xué)（Histochemistry）第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、組織化學(xué)的基本概念 （一）組織化學(xué)的定義

應(yīng)用化學(xué)或物理反應(yīng)原理，通過顯示組織或細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分或酶活性而對其進(jìn)行定性、定位和定量研究

☆盡量保持組織的原有結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成

☆組織原位

☆借助顯微鏡

（二）組織化學(xué)與組織學(xué)、生物化學(xué)的區(qū)別組織化學(xué)：研究組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)組成及其含量、酶的存在及其活性組織學(xué)：研究組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系生物化學(xué)：通常將組織和細(xì)胞破壞，制成勻漿進(jìn)行化學(xué)測定（不考慮定位）第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）組織化學(xué)的基本原理化學(xué)試劑+擬檢物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物沉淀（有色）化學(xué)反應(yīng)（組織切片或細(xì)胞涂片、爬片）（擬檢物質(zhì)所在處）第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

（四）組織化學(xué)技術(shù)的基本要求保持組織和細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織和細(xì)胞生前的化學(xué)成分和酶的活性反應(yīng)產(chǎn)物不被溶解、不易位、不彌散，保證反應(yīng)產(chǎn)物的精確定位反應(yīng)產(chǎn)物具有可視性，反應(yīng)產(chǎn)物的顏色深度與相應(yīng)物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的量效關(guān)系所用組織化學(xué)方法必須具備一定的特異性（僅與某種化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)）和靈敏性（能夠顯示微量的物質(zhì)）方法穩(wěn)定并能重復(fù)設(shè)置必要的對照實(shí)驗(yàn)第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1、固定的目的：

1）保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2）使組織硬化2、固定的優(yōu)、缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到保持缺點(diǎn)：擬檢物質(zhì)反應(yīng)性減弱，酶的活性易受損取材：位置準(zhǔn)確、速度快、減少擠壓、大小適中（寧可面積大、不能厚）二、組織化學(xué)標(biāo)本的制備(一)取材與固定第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

☆

10%中性緩沖福爾馬林：甲醛實(shí)際濃度為4％

[甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)90ml混勻]

☆4%多聚甲醛[（HCHO)n，n=8~100]：多聚甲醛40g,0.1mol/LPB500ml，兩者混合加熱至60℃，攪拌并滴加1mol/LNaOH至溶液清澈，補(bǔ)充0.1mol/LPB至總量1000m1

☆PB和PBS是最常用的緩沖液，0.01mol/LPBS主要用于漂洗組織標(biāo)本、稀釋抗體和血清等。0.1mol/LPB常用于配制固定液及蔗糖等。

為減少固定劑與抗原的交聯(lián)，在使用醛類固定劑時，應(yīng)縮短固定時間(8～24h)，降低固定溫度(4℃)。3、常用固定劑2）戊二醛：C3H10(CHO)2

2?4%戊二醛溶液：較好的保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，但是保存酶活性效果不佳。1）甲醛：HCHO第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

3）乙醇：CH3CH2OH2x10minutesacetonefixationwithair-dryinginbetween.Thismayimprovethetissuemorphology.培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞涂片、冰凍切片的固定4%PFA

、甲醇、乙醇、丙酮有固定和脫水的雙重作用。能較好的保存酶活性和糖原，但會使組織嚴(yán)重收縮和硬化，常與其它固定劑混合使用甲醇：CH3OH既可作固定劑，又可作脫水劑。能使蛋白凝固，但不影響蛋白質(zhì)的反應(yīng)功能基團(tuán)而保存酶的活性。缺點(diǎn)是易使組織細(xì)胞收縮，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠佳。4℃下10分鐘。4）丙酮：(CH3)2CO第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、石蠟切片：

組織取材和固定（甲醛）

→脫水（梯度酒精）

→

透明（二甲苯）

→

浸蠟（石蠟）

→

包埋（石蠟）

→

切片（石蠟切片機(jī)）

→

粘片（載玻片）

→

烤片（烤箱）

→組織化學(xué)染色程序

組織結(jié)構(gòu)保存良好，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，方便標(biāo)本長期保存。（二）組織切片的制備第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）

→

脫水（梯度酒精）

→透明（二甲苯）

→浸蠟（石蠟）

→包埋（石蠟）

→切片（切片機(jī)）

→粘片（載玻片）

→烤片（烤箱）

→組織化學(xué)染色程序

第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→

透明（二甲苯）→浸蠟（石蠟）→包埋（石蠟）→切片（切片機(jī)）→粘片（載玻片）→烤片（烤箱）→組織化學(xué)染色程序以肉眼可見自然光線基本透過樣品為宜松節(jié)油代替二甲苯：作用柔和,制片材料不易硬化，避免二甲苯對人體和環(huán)境的危害第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蠟（石蠟）→包埋（石蠟）→切片（切片機(jī)）→粘片（載玻片）→烤片（烤箱）→

組織化學(xué)染色程序

脫水、透明要充分，否則不利于浸蠟。但時間過長會造成組織過硬和抗原損失。較軟的組織可選擇軟蠟（熔點(diǎn)42~50℃）較硬的組織可選擇硬蠟（熔點(diǎn)50~60℃）石蠟需要熔化過濾除去雜質(zhì)第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蠟（石蠟）→

包埋（石蠟）→切片（切片機(jī)）→粘片（載玻片）→烤片（烤箱）→組織化學(xué)染色程序包埋盒包埋模具第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蠟（石蠟）→包埋（石蠟）→

切片（切片機(jī)）→粘片（載玻片）→烤片（烤箱）→組織化學(xué)染色程序必要時哈氣、或冰凍第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蠟（石蠟）→包埋（石蠟）→切片（切片機(jī)）→

粘片（載玻片）→烤片（烤箱）→組織化學(xué)染色程序

40~45℃粘片劑第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→脫水（酒精）→

透明（二甲苯）→

浸蠟（石蠟）→

包埋（石蠟）→

切片（切片機(jī)）→

粘片（載玻片）→

烤片（烤箱）

→

組織化學(xué)染色程序前的處理→組織化學(xué)染色如37度過夜

第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月組織化學(xué)染色程序前的處理:

→

脫蠟（二甲苯）

→純酒精置換二甲苯

→梯度酒精入水

→

組織化學(xué)染色程序

→常規(guī)脫水、透明、封片

第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、

恒冷箱切片組織取材和固定或不固定→驟凍（液氮，–198℃；干冰，–78℃；

凍結(jié)金屬座，–30℃）

→

切片（恒冷箱）

→

粘片（載玻片）

→晾片

→組織化學(xué)染色程序→常規(guī)脫水、透明、封片

第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月能夠完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗體的選擇），能夠很好地保存脂肪、類脂等成分步驟更簡單，快速、省時冰凍過程容易使組織中的水分形成冰晶，破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成抗原的彌散，從而定位不準(zhǔn)確組織過大不容易凍結(jié)或組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。不容易制作較薄的切片，不容易做連續(xù)切片，不容易長期保存冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月糖類顯示法過碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，可將糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基，后者再與Schiff試劑中的亞硫酸品紅（無色）反應(yīng)，形成不溶性紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物對照：先用唾液淀粉酶滴于切片上，37℃30~60min，再按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

最常用于顯示細(xì)胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是過碘酸-雪夫反應(yīng)（periodicacidSchiff，PAS反應(yīng))。

第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月脂類物質(zhì)顯示法

蘇丹黑B

為脂溶性染料，染色后與組織中的脂類物質(zhì)結(jié)合，故組織中含脂類物質(zhì)處呈黑色。脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅O、蘇丹黑B等脂溶性染料染色；亦可用鋨酸固定兼染色，脂類呈黑色。

油紅O是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀，在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置人染液時，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色

第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月常用核酸組織化學(xué)第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Feulgen反應(yīng)顯示DNA用稀鹽酸處理切片，使DNA水解，打開脫氧核酸與嘌呤堿基之間的連接鍵（糖苷鍵），形成醛基，再與Schiff試劑作用，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月吖啶橙染色顯示DNA和RNA吖啶橙（acridineorange，AO）是一種常用熒光染料，與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力，但有一定的特異性，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮（黃）綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡便快捷，既可染活細(xì)胞又可染固定的細(xì)胞。

第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月methylgreen-pyronin為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。甲基綠：與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色派洛寧：與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色甲基綠-派洛寧染色顯示DNA和RNA第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Hoechst33258和Hoechst33342顯示DNAHoechst33342和33258主要的特點(diǎn)是能夠穿透完整的細(xì)胞膜，所以可以用來染活細(xì)胞，許多種類的干細(xì)胞（如HSC、NSC等）由于可以更有效地將進(jìn)入細(xì)胞的Hoechst染料主動轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，所以染色會弱一點(diǎn)，但染固定過的細(xì)胞則沒有區(qū)別。

Hoechst33342比33258更容易透過細(xì)胞膜，所以常用來進(jìn)行活細(xì)胞的DNA含量分析。染活細(xì)胞時，不同種類的細(xì)胞攝入Hoechst的效率不同，染色的強(qiáng)度也不一樣，在做細(xì)胞流式的時候會看到不同的信號峰。

LABELINGLIVECELLS:LabelingDNAwithHoechst33342亮藍(lán)色熒光第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月DAPI顯示DNADAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

DAPI像Hoechst染料一樣，粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)，是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月confocalimagesofnuclearethidiumbromide(EB)staining溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號

溴化乙錠(EB)顯示DNA

EB不能透過活細(xì)胞膜，但能對固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色?？梢杂脕頇z測單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA），但EB對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對較低。第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月吖啶橙能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴化乙錠僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。

正常細(xì)胞：核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胞膜完整，著綠色；早期凋亡細(xì)胞：核染亮綠色呈致密斑塊或碎片狀；晚期凋亡細(xì)胞：核染橘紅色呈致密斑塊或碎片狀;壞死細(xì)胞：胞膜破損、核膜完整，染色質(zhì)染均勻的紅色。AO/EB染色第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）PI檢測試劑盒可用于細(xì)胞凋亡檢測，也可用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色，染色后可用熒光顯微鏡檢測或流式細(xì)胞儀檢測。PI是一種DNA結(jié)合性染料，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為488nm和630nm，產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞。Thegreenisthemicrotubulenetwork(partofthecellcytoskeleton)stainedwithanantibodytotubulin.Theredisthenucleusstainedwithpropidiumiodide.

正常細(xì)胞：不能著色早期凋亡細(xì)胞：呈微弱紅光晚期凋亡細(xì)胞：紅光加強(qiáng)壞死細(xì)胞：呈強(qiáng)紅色熒光第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡，可以從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，使得PS暴露在細(xì)胞膜表面。在Ca2+存在時，AnnexinV與PS有很高的親和力，可與之迅速結(jié)合。PS外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂、DNA片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得AnnexinV與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測標(biāo)志事件。

PI被用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞可以同時與annexinV-FITC和PI結(jié)合顯色，而PI則被排除在活細(xì)胞(FITC陰性)和早期凋亡細(xì)胞(FITC陽性)之外。

第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月酶組織化學(xué)第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月酶組織化學(xué)基本反應(yīng)原理

酶特異性底物+相關(guān)捕獲劑

反應(yīng)產(chǎn)物沉淀（有色）

反應(yīng)產(chǎn)物沉淀（無色）+置換劑酶（孵育液內(nèi)）（組織細(xì)胞內(nèi)）鏡下觀察有色沉淀酶組織化學(xué)是顯示酶的活性第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、金屬-金屬鹽顯示法

方法Ⅱ：鉛法酶作用于底物時，其分解產(chǎn)物與底物混合液中某種物質(zhì)結(jié)合，沉著在作用部位。然后結(jié)合物被金屬置換，通過金屬顯色來證明酶的存在?；蛘?，酶作用于底物后生成的分解產(chǎn)物，與底物孵育液中的金屬離子相結(jié)合，直接沉著于酶反應(yīng)部位，使其顯色。方法Ⅰ：鈣-鈷法第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、偶聯(lián)偶氮色素法1、同時偶聯(lián)法：

該法是孵育液中的底物在酶作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者立即與重氮鹽結(jié)合（偶聯(lián)偶氮反應(yīng)），形成不溶性偶氮色素而顯色。2、后偶聯(lián)法：

該法是為了防止重氮鹽對酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解產(chǎn)生反應(yīng)物沉淀，然后將其浸漬于重氮鹽溶液中，使其形成偶氮色素而顯色。第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月OPO2CaOHN≡NClβ-磷酸萘酚α-萘基氯化重氮鹽不溶性偶氮色素N=NOH酶作用第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、色素形成法1、四唑鹽法

主要用于顯示脫氫酶。底物中含有四唑鹽或雙四唑鹽。在脫氫酶的作用下，底物釋出氫原子，并與四唑鹽或雙四唑鹽形成紅色或藍(lán)色的甲

（càn）或二甲

色素。C6H5—CN—N—C6H5N＝N—C6H5酶作用+2HC6H5—CN—NH—C6H5N＝N—C6H5+HCl四唑鹽(無色)甲

（紅色）Formazandyesareartificialchromogenicproductsofthereductionoftetrazoliumsaltsbydehydrogenasesandreductases.Theyhaveavarietyofcolorsfromdarkbluetodeepredtoorange,dependingontheoriginaltetrazoliumsaltusedasthesubstrateforthereaction.第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2、靛酚藍(lán)法：H3CCH3NNH3CCH3NNH2OH+酶作用+

2H2O二甲基–對–苯二胺-萘酚靛酚OO2細(xì)胞色素氧化酶過氧化物酶第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月酶組織化學(xué)注意事項(xiàng)1.選擇最適溫度、pH值及緩沖液2.為保持酶活性，最好使用冰凍切片，固定時間不能過長3.有些物質(zhì)能提高或抑制酶的活性，故要選擇合適的捕捉劑4.進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)：用酶的抑制劑、用去底物的孵育液、用已確定含該酶的組織細(xì)胞進(jìn)行對照

第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種酶的反應(yīng)原理

堿性磷酸酶 酸性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰膽堿酯酶 細(xì)胞色素氧化酶 一氧化氮合酶第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

堿性磷酸酶（ALP）1、反應(yīng)原理（鈣-鈷法）R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4

(β-甘油磷酸鈉)

Ca3(PO4)

2Co3(PO4)

2CoS

(棕黑色)2、孵育液的成分：

3%β-甘油磷酸鈉10ml

2%巴比妥鈉10ml2%CaCl220ml5%MgSO41ml

雙蒸水

5ml

ALPpH9.4CaCl2Co(NO3)2(NH4)2S第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

酸性磷酸酶(ACP)1、反應(yīng)原理（鉛法）：

R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4

(β-甘油磷酸鈉)

2、孵育液的成分：

0.05mol/L醋酸鹽緩沖液（pH5.0）10ml3%β-甘油磷酸鈉1ml

蔗糖

0.8mg

硝酸鉛

10mgACPpH5.0Pb3(PO4)2PbS↓(棕黑色)Pb2+(NH4)2S第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三磷酸腺苷酶(ATPase)

1、反應(yīng)原理（鉛法）：

A—P～P～

P

+H2OA—P～P+H3PO4+

能量

(ATP鈉鹽)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2

+

(NH4)2SPbS↓(棕黑色)

2、孵育液的成分：

ATP二鈉鹽

10mg

0.2mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.2）10ml0.1mol/LMgSO42.5ml2%Pb(NO3)21.5ml

蔗糖0.8mg

雙蒸水5mlATPaseMg2+第46頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月乙酰膽堿酯酶(AChE)1、反應(yīng)原理（亞鐵氰化銅法）：

碘化乙酰硫代膽堿+H2O硫代膽堿+

醋酸硫代膽堿+

鐵氰化物亞鐵氰化物亞鐵氰化物+Cu2+